全 文 ：基金项目:广东省科技计划资助项目辅助项目(编号:2010B080701065)
韦酋亨:潮州市潮安长江手外科医院 广东潮州 515638
韩 溟 谢 扬 :汕头大学医学院第二附属医院 广东汕头
515041
石花菜乙酸乙酯提取物对增生性瘢痕成纤维细胞
的影响
韦酋亨 韩 溟 谢 扬
EFFECT OF GELIDIUM AMANSII EXTRACTIVE ON HUMAN HYPERTROPHIC SCARS FI-
BROBLASTS
WEI Qiuheng，HAN Min，XIE Yang
【摘 要】 目的 探讨石花菜乙酸乙酯提取物对人增生性瘢痕(HS)成纤维细胞增殖及合成功能的影
响。方法 组织植块法分离培养瘢痕组织成纤维细胞并鉴定，MTT 法检测石花菜乙酸乙酯提取物(0，2. 5，5，
10 mg /ml)对细胞活性的影响;此外不同浓度的石花菜乙酸乙酯提取物(0，2． 5，5，10 mg /ml)刺激成纤维细胞
48 h后，ELISA 法检测细胞培养上清中成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原及转化生长因子 β1(TGF － β1)分泌水平。结
果 石花菜乙酸乙酯提取物呈时间及剂量依赖性抑制成纤维细胞活性。此外，5 ～ 10 mg /ml石花菜提取物使
HS成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原生成及 TGF － β1 分泌显著少于对照组(p ＜ 0. 05) ;2. 5 mg /ml石花菜提取物虽不
显著减少成纤维细胞的胶原合成，但与对照组相比，它可显著减少 TGF － β1 的分泌(p ＜ 0. 05)。结论 石花
菜乙酸乙酯提取物能有效抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖，并抑制细胞胶原合成及生长因子的分泌，对增生
性瘢痕可能具有治疗作用。
【关键词】 石花菜乙酸乙酯提取物 增生性瘢痕 成纤维细胞 胶原合成 转化生长因子 β1
【Abstract】 Objective To investigate the effects of Gelidium amansii extractive on the human hypertrophic
scars (HS)fibroblasts． Methods Fibroblasts form scars tissue were isolated and cultured． Then they were cultured
with various concentration of Gelidium amansii extractive by ethyl acetate extraction for different duration of time． Af-
ter incubation，MTT method was carried out for cell viability determination． In addition，the culture supernatants were
collected and used for determination of Ⅰ、Ⅲ collagen and transforming growth factor － β1(TGF － β1)． Results
Fibroblasts viability decreased in dose and time － dependent manner after incubation with Gelidium amansii extrac-
tive． 5 － 10mg /ml Gelidium amansii extractive decreased Ⅰ、Ⅲ collagen and TGF － β1 excretion(p ＜ 0. 05)． Con-
clusion Gelidium amansii extractive could inhibit the proliferation of fibroblasts and decrease the production of colla-
gen and growth factor． Thus，it may has a therapeutic effect on hypertrophic scars．
【Key words】 Gelidium amansii extractive，hypertropic scars，fibroblasts，collagen synthesis，transforming
growth factor － β1
【Authors address】 Chao An Changjiang hand surgery hospital of ChaoZhou city，Guangdong，515638，PRC
doi:10． 3969 / j． issn． 1671 － 332X． 2011． 10． 005
瘢痕的形成是组织损伤修复的正常生理过程，然而过度
的瘢痕增生不仅影响美观、局部瘙痒等，严重者可引起功能
障碍，影响患者日常生活。增生性瘢痕(hyperplasic scar，
HS)是皮肤创面愈合后局部组织过度纤维化的结果，其组织
学研究证实，成纤维细胞的过度增殖，及其合成、分泌的细胞
外基质过度沉积，是 HS 的主要生物学基础［1］。目前，临床
上常应用激素、抗肿瘤药物如紫杉醇、博来霉素等治疗瘢
痕，但这些药物副作用大。因此，寻找有效而副作用小的抗
瘢痕药对手外伤的修复及功能具有重要的临床意义。
近年来，有不少的中草药提取物被用于抗瘢痕的基础研
究［2］。说明中草药在抗瘢痕方面具有潜在的开发价值。石
花菜(Gelidium amansii)别名牛毛菜、鸡毛菜、海草、草珊瑚、
海冬菜等，为红藻门石花菜科石花菜属植物，它分布于渤海、
黄海、台湾北部的沿海地区［3 － 4］。古代药典籍记载，石花菜
味甘咸，性寒，全藻入药能消热解毒、缓泻，润肺化痰、滋阴降
火，利尿等功效，还具有抗病毒、防肿瘤等作用［5］。迄今，有
关石花菜的生物活性的研究报道不多，本实验通过研究石花
菜的乙酸乙酯提取物对 HS 成纤维细胞细胞活性及分泌功
能的影响，探讨石花菜提取成分的抗瘢痕活性。
11现代医院 2011 年 10 月第 11 卷第 10 期 专业技术篇 Modern Hospital Oct 2011 Vol 11 No 10
1 材料与方法
1． 1 瘢痕标本的采集
实验用组织标本均来自汕头大学医学院第二附属医院
医院整形烧伤科，因 HS 自愿行瘢痕整复手术的病人，共 10
例，取材局部无感染和溃疡，均未进行任何抗瘢痕性药物治
疗，均无传染、免疫、遗传和皮肤等疾病。取材前向病人说明
取材目的，并征得病人同意。瘢痕为创伤后 6 个月 ～ 1 年。
1． 2 试剂
新鲜石花菜采集于汕头南澳海域;DMEM/F12(v /v 1∶ 1)
培养基及小牛血清;噻唑蓝(MTT)为 Sigma 进口分装;人Ⅰ
型及Ⅲ型胶原交联羧基末端肽(ⅠCTP)ELISA 试剂盒、TGF
－ β1 ELISA试剂盒。
1． 3 成纤维细胞培养及鉴定
采用组织块贴壁法分离培养成纤维细胞［6］。使用含体
积分数 10%的新生牛血清 100 μ /mL 青霉素和 100 μg /mL
链霉素的 DMEM/F12(v /v，1∶ 1)培养液培养，培养条件为 37
℃、5%CO2、饱和湿度。免疫荧光法鉴定成纤维细胞Ⅰ型胶
原。取 3 ～ 6 代细胞进行实验。
1． 4 石花菜提取物的制备
石花菜样品采集后，用干净的海水洗去表面泥沙和附着
物，阴干并粉碎，用 95%乙醇室温浸泡提取 3 次，每次 72 h，
提取液合并后经旋转蒸发仪减压浓缩(温度 ＜ 50 ℃)除去
溶剂。浓缩物混悬于蒸馏水中，用乙酸乙酯萃取三次后合
并，减压浓缩后得提取物。
1． 5 MTT法测定药物对成纤维细胞增殖的影响
取对数生长期 HeLa细胞以 1 × 104 /ml的密度接种于 96
孔板，在含 10%小牛血清的 DMEM/F12 培养液条件下，培养
过夜。后分别含不同浓度石花菜乙酸乙酯提取物(0，2. 5，5，
10 mg /ml)的 DMEM/F12 培养基(含 2%小牛血清) ，分别培
养 24，48，72 h。培养终止时，每孔加入 20 μl 5 mg /ml MTT
溶液，继续培养 4 h后，吸弃培养基，每孔加入 200 μl DMSO
溶解，混匀后酶标仪 492 nm 测各孔吸光度，根据测得的 OD
值按下式计算对肿瘤细胞活性:%细胞活性 =(实验组 OD
值 /对照组 OD值)× 100%。
1． 6 石花菜提取物对成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原及 TGF － β1
分泌的影响
将体外培养的人 HS成纤维细胞接种于 6 孔板内，加入
不同浓度石花菜乙酸乙酯提取物(0，2. 5，5，10 mg /ml)刺激
48 h后，收集培养上清，－ 80 ℃冻存，用于检测 TGF － β1，及
Ⅰ、Ⅲ型前胶原蛋白的分泌。培养基中Ⅰ、Ⅲ型前胶原蛋白
测定及 TGF － β1 含量测定按试剂盒说明操作。
1． 7 统计学分析
结果用珋x ± s 表示，组间比较采用单因素方差分析，p ＜
0. 05为差异有统计学意义。所有统计在 SPSS 17. 0 软件进行。
2 结果
2． 1 细胞培养
体外培养的人 HS成纤维细胞呈长梭形，特异性表达Ⅰ
型胶原蛋白(图 1)。
图 1 A，培养细胞经免疫荧光检测Ⅰ型胶原，胞浆呈绿色荧光阳性
反应;B，阴性对照，以 PBS替代一抗(× 400)
2． 2 石花菜提取物对成纤维细胞增殖的影响
石花菜提取物以时间及剂量依赖性的方式抑制 HeLa
细胞的生长增殖，降低细胞活性(图 2)。
图 2 不同剂量石花菜提取物对 HS成纤维细胞活性的影响
* p ＜ 0. 05 与对照组比较
2． 3 石花菜提取物对成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原及 TGF － β1
表达的影响
5 － 10mg /ml石花菜提取物使 HS成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶
原生成及 TGF － β1 分泌显著少于对照组(p ＜ 0. 05) ，见表 1;
且随着石花菜提取物浓度的增加，胶原量减少越多。2. 5
mg /ml石花菜提取物虽不显著减少成纤维细胞的胶原合成，
但与对照组相比，它可显著减少 TGF － β1 的分泌(p ＜
0. 05)。
表 1 石花菜提取物对成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原及
TGF － β1 表达的影响 (n = 6)
组别
剂量
(mg /ml)
Ⅰ型胶原
(μg /ml)
Ⅲ型胶原
(μg /ml)
TGF － β1
(μg /ml)
对照组 － 10． 9 ± 1． 5 77． 2 ± 5． 7 2． 2 ± 0． 2
石花
菜提
取物
2． 5 9． 9 ± 1． 3 67． 5 ± 6． 9 1． 8 ± 0． 11)
5 8． 6 ± 1． 41) 61． 3 ± 7． 41) 1． 6 ± 0． 21)
10 7． 0 ± 1． 11) 48． 9 ± 7． 11) 1． 1 ± 0． 21)
1)p ＜ 0. 05 与对照组比较
3 讨论
创面愈合是一个复杂的病理生理过程，其中细胞和细胞
间、细胞和生长因子间、细胞和细胞外基质之间构成了极为
复杂的相互关系，共同影响和调节着创面的愈合。成纤维细
胞是创面修复过程中重要的功能细胞之一，同时也是瘢痕组
织中的主要细胞成分，能合成细胞外基质中的多种成分。而
细胞外基质的过多沉积将导致创面的过度愈合，从而形成增
生性瘢痕(HS)。关于 HS的发生机制，至今仍无定论。但普
遍认为 HS形成最直接的因素可能是成纤维细胞的功能异常
所致［7 －8］，成纤维细胞的功能状态受多种因素制约。临床上
21 现代医院 2011 年 10 月第 11 卷第 10 期 专业技术篇 Modern Hospital Oct 2011 Vol 11 No 10
櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒
(接上页)
瘢痕往往采用药物、手术和放射治疗等联合疗法，其中药物
治疗占据重要位置。到目前为止尚没有一种很好的治疗方法
和药物，为此，从抑制成纤维细胞的增殖及其生物合成功能
方面寻找治疗和预防瘢痕增生的药物具有重要的临床意义。
本实验表明，石花菜乙酸乙酯提取物在体外实验中呈剂
量依赖性抑制成纤维细胞增殖。低剂量(2. 5 mg /ml)提取
物作用 48h虽不能显著影响成纤维细胞活性，也不能显著降
低细胞胶原的合成，但可显著抑制 TGF － β1 的分泌。TGF －
β1 是目前已知作用最强的促成纤维细胞活化生长因子之
一，可明显诱导Ⅰ型胶原基因表达［9］。因此，低剂量石花菜
乙酸乙酯提取物可在不影响细胞活性的情况下抑制成纤维
细胞的合成功能，TGF － β1 分泌减少又可进一步抑制成纤
维细胞的过度增殖，从而起到抗瘢痕形成的作用。
对石花菜提取物的相关研究表明［10］，其所含的甾体皂
甙具有免疫调节等作用。本实验提示其可能具有抗瘢痕作
用，但乙酸乙酯粗提物中成分仍较复杂，需要进一步分离纯
化其有效成分。以期为临床抗瘢痕治疗提供新途径。
参考文献
［1］ JALALI M，BAYAT A． Current use of steroids in management of
abnormal raised skin scars［J］． Surgeon，2007，5(3) :175 － 180．
［2］ 戴丽冰，潘 姝，沈 雁，等．姜黄素对人增生性瘢痕成纤维细
胞生长及功能的影响［J］． 中国药学杂志，2010，29(12) :1100
－ 1103．
［3］ 郑汉臣，蔡少青，等． 药用植物学与生药学［M］． 北京:人民
卫生出版社，2003:194．
［4］ 张义浩，赵盛龙，吴常文，等． 海洋生物———藻类［M］． 杭
州:浙江大学出版社，2002:22．
［5］［10］孙 杰，王艳杰，朱路英，等．石花菜醇提物抑菌活性和抗氧
化活性研究［J］． 2007，28(10) :53 － 56．
［6］ 鄂 征． 细胞组织培养［M］． 北京:北京出版社，1995． 78 －
153．
［7］ WANG J，DODD C，SHANKOW SKY H A，et al． Wound Heal-
ing Research Group． Deep dermal fibroblasts contribute to hyper-
trophic scarring［J］． Lab I nvest，2008，88(12) :1278 － 1290．
［8］ H INZ B． Formation and f unction of the myofibroblast during tis-
sue repair［J］． J I nvest Der matol，2007，127(5) :526 － 537．
［9］ VOGELMANN R，RUF D，WAGNER M，et al． Effects of fibro-
genic mediators on the development of pancreatic fibrosis in a TGF
－ beta1 transgenic mouse model［J］． Am J Physiol Gastrointest
Liver Physiol，2001，280:164 － 172．
吴东恩 黄秀霞 叶小清 符 云:河源市妇幼保健院 广东河源
517000
原位杂交技术检测 93 例外阴及宫颈 HPV感染临床
病理分析
吴东恩 黄秀霞 叶小清 符 云
CLINICAL PATHOLOGICAL ANALYSIS OF IN SITU HYBRIDIZATION DETECT VULVAR
AND CERVICAL INFECTION OF HPV
WU Dongen，HUANG Xiuxia，FU Yun，et al
【摘 要】 目的 评价 HPV 原位杂交检测的应用价值及临床意义。方法 收集我院 93 例患者，所有病例均进行组织
石蜡切片病理检查及 HPV原位杂交检测。结果 在宫颈低度病变中(CIN I)鳞状上皮中、表层细胞核内可见呈棕黄色大团
块状、粗块状状杂交信号，在宫颈高度病变(CINⅡ ～Ⅲ)中，高倍显微镜下观察可见点状杂交信号，有些也可见点状与团块
状混合出现。55 例宫颈低度病变中，HPV6 /11 阳性为 80. 0%，27 例宫颈高度病变中中 HPV16 /18 阳性为 81. 4%。在不同宫
颈病变原位杂交 HPV16 /18 的表达结果有显着性差异(p ＜ 0. 05)。8 例 VINⅠ中 HPV16 /18 阳性为 0，2 例 VIN II及 1 例 VIN
III中 HPV16 /18 阳性为 100%。结论 在外阴及宫颈 HPV感染病变中，原位杂交既可观察组织学形态变化，又可以很好的
显示 HPV感染的组织学部位，具有较高特异性。
【关键词】 原位杂交 外阴及宫颈 HPV感染 临床病理分析
doi:10． 3969 / j． issn． 1671 － 332X． 2011． 10． 006
宫颈癌是女性常见恶性肿瘤，占女性恶性肿瘤的第二位，同
时我国是一个宫颈癌患病率和病死率均约占世界三分之一的大
国。近年来，宫颈癌的发病率持续上升并呈年轻化趋势。人乳
头状瘤病毒(HPV)与宫颈癌及癌前病变密切相关，大约有 10%
的 HPV感染者可能发生细胞学的病变，其中 1%可能逐步发展
为癌症，从癌前病变发展到癌，要经历 2 ～ 8 年时间［1］。因此，宫
颈癌和癌前病变的早期筛查和确诊就成为广大医务工作所面临
的重要课题。随着国家重大公共卫生服务项目之一的宫颈癌防
治工程的启动，以及液基细胞薄层制片术(TCT)和阴道镜的应
用，越来越多的宫颈鳞状上皮内瘤变可以被及时发现治疗［2］。
因此，只有加强对HPV持续性感染的了解和研究，才能有助于
31现代医院 2011 年 10 月第 11 卷第 10 期 专业技术篇 Modern Hospital Oct 2011 Vol 11 No 10