全 文 ：甲基莲心碱在体外对瘢痕成纤维细胞生长的影响
刘丽忠 ,李国辉
(江西医学院一附院 烧伤整形科 ,江西 南昌　 330006)
摘　要: 目的　研究甲基莲心碱 ( neferine, Nef)对瘢痕成纤维细胞增殖的影响 ,探讨 Nef应用于临床治疗增生性
瘢痕的可能性。方法　对人增生性瘢痕进行体外培养 ,观察其形态学和生长特征 ;采用 M T T比色法测定 Nef对细
胞的增殖抑制率。 结果　 Nef浓度 10～ 100μg /m L时 ,成纤维细胞的形态发生改变 ,增殖受到抑制 ,并呈现明显的
剂量依赖性。 结论　 Nef是瘢痕成纤维细胞生长的负性调节因子 ,有望在增生性瘢痕的防治中发挥作用。
关键词: 甲基莲心碱 ;增生性瘢痕 ;成纤维细胞 ;增殖
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 10 1018 03
Influence of neferine on proliferation of hypertrophic scar fibroblasts in vitro
LIU Li-zhong , LI Guo-hui
( Depa rtment o f Burn & Plastic Surg er y, No. 1 A ffiliated Hospital, Jiangx i Medica l Colleg e, Nanchang 330006, China )
Key words: neferine; hypert rophic sca r; fibroblast; proliferation
　　瘢痕形成是创伤愈合的必然结局 ,但瘢痕过度
增殖 ,将影响外观和生理功能 ,防治瘢痕过度增生一
直是医学研究中的一大难题 [ 1]。创伤愈合的研究表
明 ,影响瘢痕形成的主要因素是细胞、细胞外基质和
细胞生长因子 ,成纤维细胞是创面修复的主要细胞 ,
在创面愈合过程中起重要作用 ,通过合成胶原、纤维
粘连蛋白等细胞外基质成分参与创面愈合 [2 ]。 近年
来 ,许多国内外学者运用细胞培养技术 ,在体外控制
条件下对瘢痕组织来源的成纤维细胞的生物学活动
进行研究 ,以探求防治增生性瘢痕的方法 [3 ]。本实验
以体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞为实验对
象 ,研究其生长特性及甲基莲心碱 ( neferine, Nef )
对其生长增殖的影响 ,旨在为增生性瘢痕的防治寻
求新的治疗方法 ,并提供实验依据。
1　材料
1. 1　药物: Nef由同济医科大学药理教研室提供 ,
纯度为 95%。
1. 2　实验细胞的组织来源: 增生性瘢痕 ,供者年龄
为 4～ 35岁 ,病程半年至 1年 ,所有患者均无其它器
质性疾病 ,未进行过特殊治疗。
1. 3　试剂: RPM I-1640培养基、胎牛血清 (美国
GIBCOBRL) ,小牛血清 (杭州四季青生物工程材料
研究所 ) , M T T (美国 Sigma)。
1. 4　仪器:细胞培养皿 (美国 Corning ) , IT-41型
CO2培养 (日本 YAMATO) ,医用超净工作台 (苏
州医疗器械仪器厂 ) ,全自动酶标仪 (芬兰 Multi-
skan Aiscent ) ,倒置显微镜 (日本 Olympuse)。
2　方法
2. 1　细胞培养:采用组织块培养法进行人瘢痕纤维
细胞的原代培养 [4 ]。取新鲜瘢痕组织 ,用 0. 5% 新洁
尔灭漂洗 2次 ,每次 3 min,再用 0. 9% 生理盐水反
复冲洗。在无菌工作台内 ,修除表皮和皮下组织。在
少量胎牛血清中将瘢痕剪成 0. 5～ 1 mm3组织块 ,接
种于塑料培养皿中 ,组织块间距约 0. 5 mm,在 5%
CO2 , 37℃ ,饱和湿度和 95% 空气条件下培养 4 h,
使组织块粘附 ,然后加入 1640培养基 (含 20% 小
牛血清 ,青、链霉素各 100 U /mL)适量 ,继续培养 ,
每 3～ 5 d换液 1次。 3～ 4周后 ,待原代细胞生长基
本融合成片时 ,用 0. 25% 胰蛋白酶消化 ,按 1∶ 2
或 1∶ 3的比例分种传代培养 ,以后每 3～ 5 d传代
一次。取 3～ 6代细胞进行实验。以 2× 104个 /孔细
胞接种于 24孔细胞培养板中 ,从次日起 ,每天用血
球计数器计数 3孔细胞 ,计算均值。
2. 2　实验分组: 设 Nef实验和含 5% 小牛血清的
1640培养基空白对照两大组 ,其中实验组依 Nef浓
度不同分为 8个亚组。 N ef用 0. 03% 盐酸溶解后 ,
加入到含 5% 小牛血清的 1640培养基中 (含青、链
霉素各 100 U /mL) ,制成终浓度分别为 1, 5, 10,
·1018· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2002年第 33卷第 11期
收稿日期: 2002-04-21作者简介:刘丽忠 ( 1965-) ,女 ,副教授、副主任医师 ,多年从事烧伤整形外科工作 ,发表学术论文数篇。现攻读医学博士学位 ,研究方向为增生性瘢痕的防治。
* 江西医学院博士生导师
20, 40, 60, 80和 100μg /mL的 Nef条件培养基。
2. 3　 M TT比色法 [6 ]: 取对数生长期成纤维细胞 ,
经 0. 25% 胰酶消化后 ,用含 20% 小牛血清的 1640
培养基制成细胞悬液 ,调整细胞浓度为 1× 105 /
m L,以每孔 200μL (即每孔 2× 104个细胞 )接种于
96孔细胞培养板中 , 5% CO2 , 37℃ ,饱和湿度和
95% 空气条件下培养 24 h后 ,弃上清液 ,每孔分别
加入上述条件培养基 ,每个浓度 6个复孔 ,再培养
24 h。 抽出上清液 150μL,加入 M TT ( 5 mg /mL)
溶液 10μL,孵育 4 h后 ,加入 DMSO溶液 150μL,
全自动酶标仪振荡 10 min,使结晶充分溶解后 ,测
定波长为 570 nm处的吸光度 ( A )值。根据公式计
算 Nef对细胞增殖的抑制率:
抑制率 (% )= ( 1-实验组 A 值 ) /对照 A值× 100%
2. 4　统计学处理: 实验结果以 x± s表示 ,用 SPSS
统计软件进行 Dunnet t检验。
3　结果
3. 1　细胞形态的变化:倒置显微镜下观察 ,瘢痕成
纤维细胞贴壁生长 ,呈带有突起的扁平长梭形。不同
浓度的甲基莲心碱作用 24 h后 ,细胞形态观察结
果: 1和 5μg /m L浓度组 ,成纤维细胞的形态基本
正常 ,从 10μg /mL浓度开始 ,细胞形态发生改变 ,
呈圆形或不规则椭圆形 ,细胞贴壁减少 ,细胞内颗粒
增多 , 100μg /mL浓度组细胞部分出现坏死。
3. 2　细胞生长特性: 瘢痕组织块接种后 ,第 7～ 9
天细胞萌出 ,随后迅速生长 ,围绕组织块呈放射状平
行极性排列。第 21～ 24天细胞生长融合成片。传代
后细胞排列紊乱 ,极性消失 ,可出现交叉重叠现象。
一般每 3～ 5 d可传代一次。对数生长期成纤维细胞
以每孔 2× 104个细胞密度接种后 ,第 1天细胞数略
有减少 ,随后进入快速生长期 ,第 5～ 6天进入稳定
生长期 ,第 7～ 8天进入生长停滞期 ,细胞数不再明
显增加。每天计数 3孔细胞 ,将上述均值绘制成细
胞生长曲线 (图 1)。
图 1　成纤维细胞生长曲线
3. 3　 Nef对成纤维细胞生长的影响: Nef 1～ 5μg /
mL对成纤维细胞生长增殖无明显影响 ,而 10μg /
mL Nef则对成纤维细胞的增殖有抑制效应 ,随着
Nef浓度的加大 ,各实验组 A值逐渐减小 ,成纤维
细胞生长抑制率逐渐升高。 10～ 40μg /mL各组 A
值与对照组比较 P < 0. 01, 60～ 100μg /mL各组 A
值与对照组比较 P < 0. 001,差别均有显著性意义。
以 Nef浓度对数与 A值、抑制率作图 ,见 Nef抑制
成纤维细胞的生长率呈明显的剂量依赖关系 (图 2)。
与对照组比较: * * P < 0. 01　* * * P < 0. 001
图 2　Nef对成纤维细胞的生长抑制率 ( a)
和 A值 ( b)的影响
4　讨论
　　瘢痕增生与成纤维细胞的生长和代谢有密切关
系 [6 ]。人成纤维细胞的体外培养技术目前已较成熟 ,
但因成纤维细胞的生存能力有限 ,一般情况下最长
不超过 50代 ,这给体外研究瘢痕成纤维细胞带来
困难。探究成纤维细胞生长特性亦成为瘢痕防治研
究的基础。对瘢痕成纤维细胞生长特性的观察结果
显示 ,瘢痕组织块接种后 ,细胞萌出一般在第 7～ 9
天 ,第 21～ 24天原代细胞生长可传代 ,第 2～ 6天
为对数生长期 ,第 7～ 8天进入生长停滞期 ,细胞数
不再明显增加 ,这与其他学者的报道相吻合 [7, 8 ]。
近年来的研究表明 ,钙通道阻滞剂能够抑制成
纤维细胞胶原和蛋白的合成 ,具有抗纤维化作用 [9 ]。
细胞内钙浓度对细胞功能活动具有重要的调节功
能。 细胞内钙离子浓度能增加刺激成纤维细胞的分
裂 ,改变胶原的合成分解代谢平衡和细胞外基质的
合成 [10 ]。钙通道阻滞剂则通过减少细胞内钙浓度而
发挥广泛的生物学效应 [ 11]。 Nef是从中药莲子心中
提取的一种双苄基异喹啉类生物碱 ,是天然的钙通
道阻滞剂 [12 ]。为进一步研究钙通道阻滞剂对增生性
瘢痕成纤维细胞的影响 ,我们在了解人增生性瘢痕
成纤维细胞生长特性的基础上 ,观察 Nef对人瘢痕
成纤维细胞生长的影响。结果表明 , Nef以浓度依赖
方式显著抑制体外培养的瘢痕成纤维细胞的增殖 ,
剂量较大时成纤维细胞可出现坏死。表明 Nef可能
·1019·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2002年第 33卷第 11期
具有潜在的抗增生性瘢痕作用。 这不仅拓展了来源
丰富的 Nef的又一药用领域 ,也为增生性瘢痕的治
疗增添了一种新思路。因此 , Nef抑制成纤维细胞的
作用及机制值得进一步探讨。
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蒺藜果总皂苷对大鼠实验性脑缺血的保护作用
姜宗文 1 ,吕文伟 2 ,张志强 3 ,张　宏 3 ,徐　宏 3 ,丁晓昆 3
( 1. 中国人民解放军第 461医院 ,吉林 长春　 130021; 2. 吉林大学基础医学院 药理教研室 ,吉林 长春　 130021; 3. 吉林省
中医中药研究院 ,吉林 长春　 130021)
摘　要: 目的　研究蒺藜果总皂苷对大鼠实验性脑缺血的保护作用。 方法　采用结扎大鼠大脑中动脉的方法制备
脑缺血模型 ,测定脑含水量及血管通透性 ,并观察脑缺血后血中内皮素含量、超氧化物歧化酶 ( SOD)、 6-Keto-
PGF1α和 TXB2等指标。结果　蒺藜果总皂苷 20, 50, 100 mg /kg均能明显减轻脑含水量及血管通透性 ,降低脑缺血
后大鼠血中内皮素含量 ,提高血中 SOD活性。 结论　蒺藜果总皂苷对实验性脑缺血有明显的保护作用。
关键词: 蒺藜果总皂苷 ;脑含水量 ;内皮素 ;实验性脑缺血
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 11 1020 03
Protective effect of total saponins from fruit of Tribulus terrestris
on experimental cerebral ischemia of rat
JIAN G Zong-wen
1
, LU¨ Wen-w ei
2
, ZHANG Zhi-qiang
3
, ZHANG Hong
3
, XU Hong
3
, DIN G Xiao-kun
3
( 1. No. 461 Hospital of PLA , Changch un 130021, China; 2. Depa rtment o f Pharmcolog y, Clinic Co llege o f Jilin
Univ er sity , Changch un 130021, China; 3. Jilin Academy o f TCM , Changchun, 130021, China )
Key words: to tal saponins f rom the f rui t o f Tribulus terrestris L. ; wa ter-bearing of brain; endo the-
lins; experimental cerebral ischemia
　　蒺藜系蒺藜科蒺藜属一年生草本植物 ,其果实
为一常用中药 ,有效成分为呋甾醇和螺甾醇两类皂
苷 ,含量为 68. 1% [1 ]。具有增加脑血流量、降低脑血
管阻力及减少脑梗死面积的作用 ,本实验通过结扎
大鼠大脑中动脉的方法造成实验性脑缺血模型 ,观
察蒺藜果总皂苷对脑缺血的保护作用。
1　材料
1. 1　动物: Wistar雄性大鼠 ,由吉林大学实验动物
部提供。
1. 2　药物:蒺藜果总皂苷由吉林省中医中药研究院
提供 ,批号: 990401;心脑舒通胶囊由吉林敖东洮南
药业股份有限公司生产 ,批号: 980205;内皮素试剂
·1020· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2002年第 33卷第 11期
收稿日期: 2002-05-24作者简介:姜宗文 ( 1961-) ,男 ,副主任药师 ,执业药师 , 1983年毕业于长春市卫生学校大学班 ,现在中国人民解放军第 461医院药剂科工作 ,主要从事中药新药研究与临床药学。