全 文 ：医学论坛
155BIOTECHWORLD 生物技术世界
生物技术
世界
孔石莼(Ulva pertusa)属绿藻门(Chlorophyta)石莼科
(Ulvaceae)石莼属(Ulva),是一种大型海洋绿藻。孔石莼多糖属细胞
间产物,在藻体中以杂多糖形式存在。已有研究表明,孔石莼多糖具
有多种生物活性,包括抗肿瘤活性,降血脂活性,免疫活性以及抗氧
化活性[1-4]。并且,孔石莼多糖的生物活性与其分子量、支链组成以及
硫酸根的含量有着密切的关系[4-5]。虽然关于孔石莼多糖的生物活性
的报道较多,但有关其保湿吸湿活性的研究未见相关报道。本文选
用青岛海域所产的孔石莼为原料制备了不同分子量的孔石莼多糖,
并对其保湿吸湿活性进行了研究。为评估孔石莼化妆品开发潜力提
供实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料
孔石莼采自中国青岛,除去泥沙与杂藻,自来水冲洗干净,风
干,密封于塑料袋中,阴凉干燥处放置。
1.2 试剂与仪器
常用生化试剂均为分析纯,购自国药集团。分子量标准品由中
国药品生物制品检定所提供,分子量范围为4.6-2000 kDa。移液枪
(大龙,青岛爱普科仪器有限公司),KDM型可调控温电热套(山东鄄
城华鲁电热仪器有限公司),R20ID旋转蒸发仪(巩义市英峪予华仪
器厂) , D H G - 2 0 2 型电热干燥箱( 山东潍坊医疗器械厂) ,
NicoletAvatar 360型红外光谱仪(JASCO公司),EL-204型分析天
平(梅特勒-托利多仪器有限公司),Perkin-Elmer高效液相色谱仪,
TSK G4000 PWxl (Japan)色谱柱,示差折光检测器
1.3 粗多糖的制备[6]
称取150g的孔石莼干藻,剪碎,加40倍量左右水,置于烧杯中加
热煮沸4 h,期间注意补充自来水,用干净的绢网初滤,初滤液用硅
藻土作助滤剂滤纸精滤,流动水透析48 h,蒸馏水透析48 h,50°C
下用旋转蒸发仪旋转蒸发浓缩至原体积的1/4左右,4倍体积75%的
乙醇(其中含千分之三的KCl)沉淀过夜,倾去上清液,将沉淀分离,
用95%乙醇脱水2次,于40°C烘箱中烘干,注意此过程中翻动沉淀,使
其不要结块,得灰白色多糖粉末,置于P2O5干燥器中干燥保存。
1.4 粗多糖的降解
在H2O2氧化降解过程中,要降低产物的分子量常需要较高的
反应温度和较高的H2O2浓度,同时也能使水溶性多糖的收率得到提
高,但是这样就会造成反应的重复性和稳定性较差,反应条件也难
以控制。若H2O2浓度和温度过低,则需要相应的延长反应时间, 就
会影响产品的外观品质。通过对降解条件及降解因素对多糖降解程
不同分子量孔石莼多糖保湿活性的研究
孙西峰 1 刘效磊 *2
(1.潍坊市人民医院检验科 山东潍坊 261041;2.潍坊学院 山东潍坊 261021)
摘要:通过水提醇沉法制备孔石莼多糖,采用过氧化氢降解的方法制备不同分子量的孔石莼多糖。在恒温恒湿的条件下测定不同分子量的孔石莼
多糖及甘油和丝瓜水的保湿活性。结果表明,分子量的保湿活性与孔石莼多糖的分子量密切相关,未降解的孔石莼多糖表现出更好的保湿活性。
关键词:孔石莼 多糖 保湿
中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1674-2060(2014)12-0155-02
课题编号:潍坊市科技发展计划项目 201301027。山东省高等学校科技计划项目 J12LM51。
作者简介: 孙西峰和刘效磊并列第一作者。
孙西峰(1971 —),男,山东潍坊人,主管检验师,研究方向:临床检验。
*通讯作者:刘效磊(1977—),男,山东潍坊人,讲师;研究方向:海洋生物资源的可持续发展,现就职于:潍坊学院,E-mail:wfqihuimin@126.com。
样品 降解温度(°C) 降解时间(h) 得率 (%)
U1 25 5 59.2
U2 60 2 65.1
表 1 不同分子量孔石莼多糖的制备条件
图 1 不同分子量孔石莼多糖的红外光谱
样品 峰位分子量 分布宽度比
U 151.6 kD 1.80
U1 64.5 kD 1.42
U2 28.2 kD 1.91
表 2 多糖的峰位分子量及其分布宽度比
图 2 不同分子量孔石莼多糖及甘油、丝瓜水的保湿活性研究。
■ 代表孔石莼多糖U,●代表降解的孔石莼多糖U1,▲代表甘
油,◆代表丝瓜水,▼代表降解的孔石莼多糖U2
医学论坛
156 生物技术世界 BIOTECHWORLD
生物技术
世界
度影响的考察,我们确定了利用过氧化氢降解法在表1所示的条件
下对孔石莼多糖进行降解以制备不同分子量的孔石莼多糖[7]。
1.5 不同分子量孔石莼多糖的保湿性研究
保湿性的测定需要在恒温恒湿条件下进行,因此我们可以采用
硅胶干燥器,在环境温度为20℃进行实验,并以甘油和丝瓜水作为
对照。样品干燥至恒重后精密称取0.1g三种不同分子量的多糖样品
放入直径3cm的称量瓶中,加入3倍量的蒸馏水并充分混匀,置于装
有干燥硅胶的干燥器中,放置时间为0,8,16,24,32,40,48小时,并分
别称量样品放置前质量(M0)和放置后质量(Mn),保湿率根据下式计
算:保湿率(%)=Mn/M0×100%。
2 结果与分析
2.1 不同分子量孔石莼多糖的红外光谱及分子量分析
不同分子量孔石莼多糖红外光谱(图1)显示,三种样品均具有孔
石莼多糖的特征吸收峰(3446,2939,1641,1432,1256,1052和847cm-1),
这表明三种多糖结构未发生明显变化。其中3446cm-1位置的峰被认
为是羟基的吸收峰,2937cm-1处的峰为C-H伸缩振峰,1641cm-1处
较强的C=O伸缩振动吸收峰表征了糖醛酸的存在,1256cm-1是硫酸
基的特征信号,847cm-1的弱吸收峰为硫酸基直立键C-O-S的弯曲
振动。U1,U2与原料孔石莼粗多糖U的红外图谱基本一致,这说明该
样品降解过程中分子结构并未发生太大变化,这一结果与化学分析
结果相吻合。
采用凝胶渗透色谱测定,我们选择U,U1及U2三份样品进样,多
糖的峰位分子量和分布宽度值如表2所示。
2.2 不同分子量孔石莼多糖保湿性比较
由图2可以看出,在干燥硅胶的环境中,三个不同分子量的孔石
莼多糖均表现出较好的保湿活性,保湿率随时间逐渐减小,其中U表
现出最强的保湿活性优于U1,U2,同时保湿性也强于甘油和丝瓜水。
未降解的孔石莼多糖表现出更好的保湿活性,这说明孔石莼多糖的
保湿活性与分子量有着密切的关系。
3 结语
孔石莼多糖来源于海藻中,具有良好的保湿功能。目前,保湿性
功能化妆品生产中逐渐倾向于采用天然来源的活性物质,因此开发
研究孔石莼多糖的保湿活性具有较好的应用前景。
参考文献
[1]卞俊,储智勇,鲍蕾蕾,等.孔石莼多糖对小鼠免疫功能的影响[J].
中国生化药物杂志,2006(5):276-279．
[2]王凯,綦慧敏,李玉磊,徐海亭,刘顺梅.孔石莼多糖及其硫酸酯化衍
生物抗肿瘤活性的体外实验研究[J].中国海洋药物,2014(2):19-23.
[3]王艳梅,李智恩,徐祖洪.孔石莼化学组分和药用活性研究进展[J].
海洋科学,2000(3):1-2.
[4]Huimin Qi,Tingting Zhao,Quanbin Zhang, Zhien Li,Zengqin Zhao
& Ronge Xing.Antioxidant activity of different molecular weight
sulfated polysaccharides from Ulva pertusa Kjellm(Chlorophyta)
Journal of Applied Phycology 2005,17:527-534.
[5]Qi H,Huang L,Liu X,et al.Antihyperlipidemic activity of high
sulfate content derivative of polysaccharide extracted from
Ulva pertusa(Chlorophyta)[J].Carbohydr Polym,2012,87(2):1637-
164 0．
[6]于鹏展,张虹,牛锡珍,等.正交实验法优选孔石莼( Ulvan Pertusa)
多糖的提取工艺[J].中成药,2004(1):16-18．
[7]于鹏展.孔石莼多糖生理活性的研究[M].硕士学位论文,2003.
Tribble3质粒双酶切,电泳、胶回收目的片段后,用T4 DNA连接酶
连接得到pEGFP-N1-Tribble3重组质粒,转化和质粒提取后,进行
双酶切鉴定,内切酶为BglII和SalI。
2 结果
2.1 大鼠 Tribble3 基因的克隆与测序
以SD大鼠肝脏组织获得的cDNA为模板进行PCR扩增,扩增产
物经1%琼脂糖凝胶电泳后可见大小约1047bp的特异性条带(图1)。
PCR产物连入pMD18-T载体进行测序,测序结果经BioXM 2.6软
件分析与GenBank公布的大鼠Tribble3基因序列完全相同。
2.2 pEGFP-N1-Tribble3 重组质粒的鉴定
将pEGFP-N1-Tribble3重组质粒用BglII和SalI进行双酶切,
结果得到1047bp和4.7kb两个酶切片段(图2),证明大鼠Tribble3基
因重组到了真核表达载体pEGFP-N1中。
3 讨论
血管内皮是形成心血管封闭管道系统的形态基础,血管内皮细
胞的损伤与凋亡是众多心血管疾病发生的始动环节。细胞凋亡是一
种遗传控制的细胞生理性死亡过程,伴随基因转录和蛋白合成等复
杂变化[3]。现已发现与细胞凋亡密切相关的信号转导途径共有十余
个,其中内质网应激(ERS)介导的细胞凋亡途径是继死亡受体信号
途径和线粒体途径后发现的一种新的细胞凋亡途径,大量研究表
明,血管内皮细胞凋亡与 密切相关,通过干预 可以有效对抗其凋
亡,起到保护血管内皮的作用[4]。
Tribbles基因是Grophans等人在果蝇体内发现的一类丝氨酸/
苏氨酸蛋白激酶样蛋白基因家族,是抑制有丝分裂、诱导细胞凋亡
的核基因。人类Tribbles基因家族包括Tribble1、Tribble2和
Tribble3[5]。目前有关Tribbles基因的研究主要集中在Tribble 3。在
ERS通路中,Tribble3属于下游基因,应激反应时ATF4和CHOP所
形成的复合物,通过与Tribble3启动子区域的一段33bp碱基重复序
列结合后促进Tribble3基因的表达[6]。目前尚未见Tribble3调控内质
网应激介导的血管内皮细胞凋亡的相关报道。本研究从SD大鼠肝脏
组织成功克隆出了Tribble3基因开放阅读框序列,其测序结果与
GenBank公布的基因序列(GenBank Accession No.NM_144755)
完全相同。将Tribble3基因克隆入pEGFP-N1真核表达载体后,经双
酶切鉴定,证实该基因重组到了真核表达载体pEGFP-N1中。
Tribble3基因真核表达载体的成功构建,为进一步研究该基因在内
质网应激介导的血管内皮细胞凋亡过程中的作用提供了实验基础。
参考文献
[1]龚云辉,桂顺平,周蓉.Ax1 与血管内皮细胞损伤关系的研究进展
[J].现代预防医学,2014,41(16):3011-3013.
[2]Joan A,Sharon E,Brian J, et al.TRB3 Function in Cardiac
Endoplasmic Reticulum Stress[J].Circ Res, 2010, 106(9):1516-
1523.
[3]张凯强,张颖,顾何锋,等.内质网应激与细胞凋亡研究进展[J].口
腔医学,2013,33(6):415-417.
[4]邱志凌,张军平,郭晓辰.内质网应激与血管内皮细胞凋亡的研究
进展[J].中国医学科学院学报,2014,36(1):102-107.
[5]Hegedus Z,Czibula A,Kiss-Toth E. Tribbles:novel regulators
of cell function;evolutionary aspects[J].Cell Mol Life Sci,2006,
63(14):1632-1641.
[6]Su N, Kilberg MS.C/EBP homology protein (CHOP) interacts
with activating transcription faetor 4 (ATF4) and negatively
regulates the stress-dependent induction of the asparagine
synthetase gene[J].J Biol Chern,2008,283(50): 35106-35117.
······上接第154页