全 文 ：第 32 卷第 5 期
2008 年 9 月
水 产 学 报
JOURNAL OF FIS HERIES OF CHINA
Vol.32 , No.5
Sep., 2008
收稿日期:2007-10-24
资助项目:国家自然科学基金(40676077);国家海洋 863计划(2006AA10A413);福建省科技重大专项(2004NZ03);福建省自然科
学基金(2007J0064)
作者简介:陈昌生(1957-),男 ,福建平潭人 ,教授 ,主要从事水产增养殖和育种技术的研究。 E-m ail:cschen@jmu.edu.cn
文章编号:1000-0615(2008)05-717-08
野生坛紫菜种群遗传多样性的 ISSR分析
陈昌生 , 谢潮添 , 纪德华 , 徐 燕 , 郭留超
(集美大学水产学院 ,福建 厦门 361021)
摘要:采用简单序列重复区间(ISS R)分子标记技术对福建省的 3个野生坛紫菜(Porphy ra
hai tanensis)种群共 60个个体进行了遗传多样性分析。15条引物共扩增出 222个位点 ,其中
186个位点具有多态性 , 多态位点百分率为 83.78%, 在种群水平上 ,多态位点百分率为
80.18%～ 81.53%,平均为 80.93%。期望杂合度 、Shannon信息指数在物种水平上分别为
0.3304和 0.4834;在种群水平上分别为 0.3089和 0.4551 ,表明坛紫菜种群内存在着较高的
遗传多样性水平 ,且在三个种群间没有明显差异 。依据 Gst值 ,坛紫菜的遗传变异主要发生在
种群内的个体间(占 93.5%),只有 6.5%的遗传变异发生在种群间 ,由此说明坛紫菜种群间的
遗传分化水平很低 ,这与坛紫菜种群间充分的基因交流(Nm =7.1930)是相关的 。基于遗传距
离的 UPGMA 聚类结果表明坛紫菜 60个个体并不按照其地理分布进行分群 ,而是随机分群
的。文章最后还对坛紫菜种质资源保护的必要性进行了讨论。
关键词:坛紫菜;ISSR;遗传多样性;遗传分化
中图分类号:S 917 文献标识码:A
坛紫菜(Porphy ra hai tanensis)是我国特有
暖温带性种类 ,其产量约占全国紫菜总产量的
75%。经过 40多年人工养殖的坛紫菜 ,由于种质
提纯复壮和育种研究工作严重滞后 ,所使用的栽
培品系已出现严重的种质退化 ,生产效益受到了
极大影响。因此迫切要求对原产地的野生坛紫菜
种群进行遗传多样性分析 ,以摸清坛紫菜的遗传
背景 ,从而为坛紫菜的遗传育种及种质资源保护
提供理论基础。分子标记技术为种质资源遗传分
析提供了强有力的工具 ,它直接在 DNA 水平检
测基因组的遗传变异 ,不受发育时期和环境因素
的影响 ,数量丰富且多态性好 ,已广泛应用于紫菜
的遗传多样性分析中 ,如:梅俊学等[ 1] 对 4个条斑
紫菜栽培品系 ,徐涤等[ 2] 对 2种紫菜的 5个品系 ,
陈骁等[ 3] 对 11个紫菜样品等都采用 RAPD标记
进行了遗传多样性分析。杨锐等[ 4-5] 则采用
AFLP 标记对坛紫菜的野生种及两个栽培品系 ,
11个条斑紫菜品系进行了遗传变异研究。但这
些研究都只是对少数几个品系进行遗传多样性分
析 ,目前尚未见到对野生坛紫菜种群进行遗传多
样性分析的报导 。
ISSR(inte r-simple sequence repeat)———简
单序列重复区间扩增多态性是由在 SSR标记基
础上发展起来的一种分子标记技术[ 6] ,具有 DNA
样品用量少 ,操作简单 ,无需预先知道受试基因组
DNA 序列 ,结果记录方便 ,实验成本低 ,能提供丰
富的关于基因组的信息 ,且比 RA PD技术更加稳
定可靠 ,重复性好等优点 ,已经在植物的遗传多样
性分析 、指纹图谱绘制 、品种鉴定 、进化及分子生
态学等研究中得到广泛应用[ 7] 。但迄今为止 ,
ISSR标记应用于海藻研究的报道还很少 ,国内仅
见李文红等[ 8] 、孙雪等[ 9] 利用 ISSR 标记对几个
江蓠属海藻进行遗传变异分析 ,以及谢潮添等[ 10]
探讨了 ISSR标记在坛紫菜种质鉴定上的应用等
报导 。本研究的主要目的是要对福建省的野生坛
紫菜种群进行遗传多样性分析 ,以期了解野生种
群的遗传与分化特点 ,为坛紫菜的种质改良提供
实验基础。
1 材料与方法
1.1 样品的采集
根据野生坛紫菜的地理分布情况 ,2006年 12
月选取福建平潭岛(PT)、南日岛(NR)及东山岛
(DS)三个种群(图 1)作了取样分析 ,分别随机选
取种群内的 20个个体的叶状体作为样本 ,阴干后
装入封口塑料袋中 ,带回实验室置于-20 ℃冰箱
中保存备用 。
图 1 坛紫菜样品的采集地点
A.漳州东山岛(DS);B.莆田南日岛(NR);C.平潭(PT)
Fig.1 The lo calities of P.haitanensis
sampling populations
1.2 基因组 DNA的提取及检测
取冷冻保存的坛紫菜叶状体 1 g ,于海水中恢
复至室温后剪成碎片 ,加入 5 mL 酶液(2%海螺
酶 ,2 mol·L-1葡萄糖),30 ℃振荡保温 2 h 。酶解
结束后用无菌海水稀释酶解物 ,筛绢过滤 ,滤液经
5 000 r·min-1 ,10 ℃离心 5 min ,收集细胞 。用无
菌海水重悬浮洗涤 、离心收集细胞 ,采用 CTAB
法[ 11] 提取基因组 DNA ,并经 DNA片段快速纯化
试剂盒(北京鼎国生物技术有限责任公司)纯化
后 ,在 1.0%的琼脂糖凝胶电泳中检查 DNA的完
整性及在 Beckman DU-600核酸蛋白紫外分析仪
上测定 DNA 浓度 。
1.3 坛紫菜 ISSR标记分析的引物筛选
实验所用引物参照加拿大哥伦比亚大学
(UBC)公布的第 9 套 ISSR 引物序列(ht tp://
www .michaelsmi th.ubc.ca/ services /NAPS/
primer.sets/primers.pdf),由大连宝生物工程有
限公司合成。按照扩增条带清晰稳定 、重复性好
为原则 , 在 25 μL 的反应体系中对引物进行
筛选 。
1.4 PCR扩增及检测
按照本实验室建立的坛紫菜 ISS R标准反应
体系及扩增程序[ 10] 进行 。PCR扩增在美国 MJ
Research PTC-200 型 PCR 仪上进行 ,扩增结束
后 ,以 100 bp DNA ladder (100 ～ 3 000 bp)作为
相对分子质量标准 ,取 5μL 扩增产物在 6%的聚
丙烯酰胺胶上于 60 W恒功率电泳 1.5 h ,经银染
显色 ,并用扫描仪记录结果。
1.5 数据统计与分析
ISSR是显性标记 ,同一引物扩增产物中电泳
迁移率一致的条带被认为具有同源性 ,按照相同
迁移位置上有扩增条带的记为 1 ,没有扩增条带
的记为 0的方法记录电泳谱带 ,输入计算机形成
1 、0矩阵 。应用 POPGENE 1.31程序 ,假定种群
在这些 ISS R标记位点处于 Hardy-Weinberg 平
衡状态 ,分别统计各个种群及所有样本(总群体)
的下列参数[ 12] :
(1)多态位点百分数(P):扩增的 DNA 片段
出现频率小于或等于 0.99的位点即为多态位点 ,
P =具 有 多 态 的 位 点 数/检 测 到 的 位 点
数×100%;
(2)平均每个位点的观察等位基因数
(N a);
(3)平均每个位点的有效等位基因数
(N e);
(4)期望杂合度(h),亦称 Nei的平均基因多
样性;
(5)Shannon 信息指数(I);
(6)总的基因多样度(Ht)和种群内的基因
多样度(H s);
(7)基因分化系数(Gst)和基因流(Nm);
(8)遗传距离(D)和遗传相似性(I)。
最后根据种群间 Nei的遗传距离 ,采用算数
平均数的非加权成组配对法(UPGMA 法)进行
718 水 产 学 报 32 卷
聚类分析。使用软件为 N TSYSpc 2.02 。
2 结果与分析
2.1 ISSR标记分析结果
对 3个坛紫菜种群共 60 个个体进行 ISS R
扩增 ,结果从 65条 ISS R引物中筛选出 15 条引
物 ,可以扩增出清晰稳定 ,重复性好 ,多态性高的
条带(部分引物的扩增结果见图 2)。这 15条引
物共扩增出 222个位点 ,其中 186个位点具有多
态性 ,多态位点百分率(P)为 83.78%。每个扩增
引物的位点数为 12 ～ 19 个(表 1),平均为 14.8
个 ,扩增条带大小在 120 ～ 2 800 bp 。 ISS R-PCR
扩增结果共检测出 60个基因型 ,即每个样品均有
独立的基因型。
图 2 3 个坛紫菜种群的 ISS R-PCR扩增结果
1～ 20:平潭种群;21～ 40:莆田南日岛种群;41～ 60:漳州东山岛种群
Fig.2 The ISS R am plification pr oducts of 3 populations of P.haitanensis
1-20:PT population;21-40:NR population;41-60:DS population
表 1 各引物序列 、扩增位点与多态位点数
Tab.1 Primer sequences , number of loci and number of polymorphic loci
引物
p rim er
引物序列(5′-3′)
s equence
位点总数
no.of loci
多态位点数
no.of polym orphic loci
多态位点百分率(%)
percent of polymorphic loci
807 (AG)8T 14 12 85.71
808 (AG)8C 14 11 78.57
812 (GA)8A 14 12 85.71
816 (CA)8T 13 11 84.61
825 (AC)8T 12 10 83.33
826 (AC)8C 16 13 81.25
830 (TG)8G 15 13 86.67
835 (AG)8YC 15 12 80.00
836 (AG)8YA 16 13 81.25
840 (GA)8YT 15 13 86.67
841 (GA)8YC 19 16 84.21
847 (CA)8RC 15 13 86.67
848 (CA)8RG 10 8 80.00
856 (AC)8YA 18 15 83.33
858 (TG)8RT 16 14 87.50
合计
t otal
222 186 83.78
719 5 期 陈昌生 , 等:野生坛紫菜种群遗传多样性的 ISS R分析
2.2 野生坛紫菜的遗传多样性
由表 2可知 ,坛紫菜在物种水平上的多态位
点百分率为 83.78%, 种群内的位点百分数在
80.18%～ 81.53%, 平均为 80.93%,差异很小。
物种水平上每位点的有效等位基因数为 1.5810 ,
种群水平上为 1.5390;期望杂合度在物种水平上
为 0.3304 ,在种群水平上为 0.3089;Shannon 信
息指数在物种水平上为 0.4834 ,在种群水平上为
0.4551。三个种群内的多态位点百分数 、有效等
位基因数 、期望杂合度及 Shannon信息指数均差
异均为不显著(P>0.05),说明三个坛紫菜种群
的遗传多样性水平没有明显差异。
表 2 坛紫菜种群间遗传变异统计
Tab.2 The genetic variation statistics among populations of P.haitanensis
种群
population
观察等位基因数
N a
有效等位基因数
N e
期望杂合度
h
Shannon信息指数
I
多态位点百分数
P
PT 1.8018±0.3995 1.4984±0.3484 0.2917±0.1799 0.4344±0.2503 80.18%
N R 1.8108±0.3925 1.5673±0.3608 0.3205±0.1873 0.4685±0.2546 81.08%
DS 1.8153±0.3889 1.5514±0.3578 0.3145±0.1813 0.4623±0.2511 81.53%
平均 average 1.8093±0.1454 1.5390±0.1211 0.3089±0.0943 0.4551±0.1047 80.93%
总群体 t otal population 1.8378±0.3694 1.5810±0.3423 0.3304±0.1750 0.4834±0.2426 83.78%
2.3 坛紫菜种群的遗传结构
由表 3可知 ,坛紫菜所有群体总的基因多样
度为 0.3304 ,种群内的基因多样度为 0.3089 ,基
因分化系数为 0.0650(表 3),表明坛紫菜种群间
的遗传变异只占遗传总变异的 6.5%,而 93.5%
的遗传变异都分布在种群内的个体间 ,由此说明
坛紫菜种群间的遗传分化水平较低 。这一点也得
到了种群间遗传距离(D)和遗传一致度(I)(表 4)
计算结果的证实 ,三个坛紫菜种群间的遗传相似
性为 0.9480 ～ 09586。
表 3 坛紫菜种群间的遗传分化统计
Tab.3 The genetic dif ferentiation statistics among populations of P.haitanensis
种群
population
总的基因多样度
Ht
种群内的基因多样度
Hs
基因分化系数
Gst
基因流
Nm
总群体
t otal population
0.3304±0.0306 0.3089±0.0277 0.0650 7.1930
从表 3还可看出 ,三个坛紫菜种群间基因流
(Nm)的估测值为 7.1930 ,说明坛紫菜种群间有
充分的基因交流 。
表 4 坛紫菜种群间 Nei的遗传一致度
(对角线上方)和遗传距离(对角线下方)
Tab.4 Neis genetic identitity(above diagonal)and
genetic distances(below diagonal)matrix of
P.haitanensis
种群 population PT NR DS
PT 0.9480 0.9586
N R 0.0534 0.9538
DS 0.0422 0.0473
2.4 聚类分析
根据个体间 Nei的遗传距离 ,将三个种群的
60个个体进行 UPGMA 聚类 ,聚类结果如图 4。
从中可以看出三个种群的 60个个体并不按照它
们的地理分布进行聚类 ,而是随机聚类的 ,由此进
一步说明坛紫菜种群间的遗传分化水平较低 ,遗
传变异主要存在于种群内的个体间 。
3 讨论
3.1 野生坛紫菜的遗传多样性
Jia等[ 13] 、王勇等[ 14] 、杨锐等[ 5] 以及陈骁等[ 3]
采用 RAPD 或 A FLP 标记技术在对部分坛紫菜
野生或栽培品系进行的遗传多样性分析结果中都
表明坛紫菜的栽培品系间及野生品系间都存在着
720 水 产 学 报 32 卷
图 4 基于 Nei遗传距离构建的坛紫菜个体 UPGMA 聚类图
F ig.4 Dendrogr am of UPGMA cluster analy sis based on Neis genetic distance o f the 60 samples of P.haitanensis
较高的遗传多样性水平。而对于野生种群水平的
坛紫菜遗传多样性分析 ,至今未见报导 ,这可能与
野生坛紫菜仅分布于福建沿海且采样难度较高有
关。本文通过对福建省三个野生坛紫菜种群的遗
传多样性分析结果发现 ,坛紫菜在物种水平上 ,多
态位点百分率为 83.78%, 有效等位基因数为
1.5810 ,期望杂合度为 0.3304 , Shannon 信息指
数为 0.4834 ,都要高于一般植物的遗传多样性分
析结果[ 15] ,由此表明坛紫菜种群内个体间的遗传
变异较大 ,遗传多样性水平较高 ,种质资源保护较
好 ,可以为后续坛紫菜遗传育种提供良好的种质
保证 。物种遗传多样性的丰富程度在很大程度上
受物种本身的生殖模式影响[ 16] ,坛紫菜大部分为
雌雄异体 ,少数为雌雄同体 ,且不具无性生殖[ 17] ,
长期异交的结果 ,会使得坛紫菜个体之间逐步分
化 ,遗传变异加大 ,从而表现出较高的遗传多样性
水平 。此外 ,植物遗传多样性除了遗传因素外 ,
还受外界生态环境因素 , 即选择因素的影响 ,但
由于水生植物的水体生长环境基质相对稳定 , 生
态因子的变化幅度相对较小 , 环境的异质性较
小 , 所以环境因素对水生植物遗传多样性的影响
相对较小[ 18] ,本文分别对三个地理种群遗传变异
721 5 期 陈昌生 , 等:野生坛紫菜种群遗传多样性的 ISS R分析
的统计结果(表 2)也说明了这一点。
3.2 坛紫菜种群的遗传结构
坛紫菜种群间的遗传变异只占遗传总变异的
6.5%,93.5%的遗传变异都分布在种群内的个体
间 , 种群之间分化程度较低 , 遗传相似度为
0.9480 ～ 0.9586。已有的研究结果表明 ,植物种
群的遗传结构是物种的长期进化史(分布区转移 ,
生境片断化和居群特化)、突变 、遗传漂变 、交配系
统 、基因流(Nm)和选择等不同过程相互作用的结
果[ 19] ,而其中基因流与遗传漂变是相互拮抗的 ,
基因的相互交流会引起种群内遗传变异量的增
加 ,减少种群间的分化[ 20] , 根据 A llendo rf 等[ 21]
的观点 ,当 Nm >4时 ,就表明种群间的基因交流
比较充分 ,足以抵制遗传漂变的作用 ,发挥匀质化
作用 ,防止种群间分化的发生 。本研究中 3个坛
紫菜地理种群间的 Nm 值高达 7.1930 ,表明三个
种群间发生了充分的基因交流 ,从而阻止了种群
间遗传分化的发生。影响种群间基因流大小的主
要因素很多 ,如繁育系统 、分布范围 、种子传播机
制 、演替阶段等[ 22] ,而在植物中 ,花粉和种子的扩
散与传播是基因流最主要的方式 ,不同地点 、不同
生境的居群可通过花粉和种子的传播 ,实现基因
交流[ 20] 。坛紫菜大部分为雌雄异体 ,繁育类型主
要为异交 ,而且生活史中的果孢子及壳孢子都可
以通过海流的运动进行长距离传播 ,这些因素足
以引起坛紫菜种群间发生充分的基因交流 ,从而
阻碍种群间遗传分化的发生。
3.3 野生坛紫菜种质资源的保护
海洋生物种质资源是“蓝色农业”的基础 ,是
国家重大战略性基础资源 ,也是世界各海洋大国
竞争的焦点之一 ,对于未来人类发展的重要性不
可估量[ 23] 。坛紫菜是我国特有的暖温带性种类 ,
福建是其原产地 ,野生坛紫菜资源非常丰富 ,为了
对这一优质资源进行长期有效的保护 ,就必须进
行种群分化和遗传结构方面的研究 ,以摸清遗传
背景 。从本文的研究结果可以看出 ,目前坛紫菜
野生种群仍然保持着较高的遗传多样性 ,而且不
同地理种群间进行着频繁的基因交流(Nm =
7.1930)。但近年来 ,随着沿海经济的发展 ,向海
中排放的污水量逐年增多 ,超过了海水自身的净
化能力 ,环境污染日益严重 ,加上野生坛紫菜价格
的不断上涨 ,人为的滥采乱采 ,很多天然岩石(菜
坛)上生长的野生坛紫菜遭到严重破坏 ,资源数量
锐减 ,如果不进行抢救性的收集 、保护和保存 ,有
些生境的坛紫菜就会濒临绝种 。而养殖群体在经
过人工定向选择和有限亲体的多代繁殖后 ,往往
会导致等位基因的丧失和遗传变异的减少 ,出现
种质退化[ 24] ,在最近 10年的坛紫菜栽培中 ,已多
次出现种质退化原因造成的减收或绝收事件 ,必
须通过种质复壮和种质改良来保证坛紫菜养殖业
的可持续健康发展。而野生种质资源的保护和保
存正是种质复壮和种质改良的基础 ,因此必须加
大对坛紫菜这一优质资源的种群分布 、地理分化
和遗传背景的研究 ,通过建立种质库和基因库来
实现种质的长期有效保存 。
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723 5 期 陈昌生 , 等:野生坛紫菜种群遗传多样性的 ISS R分析
Genetic diversity of wild population of Porphyra haitanensis
based on ISSR analysis
CHEN Chang-sheng , XIE Chao-tian , JI De-hua , XU Yan , GUO Liu-chao
(College of F isheries , J imei University , Xiamen 361021 , China)
Abstract:Porphy ra haitanensis i s a unique seaw eed species that g row s in South China and has the
highest production (by w eight)in Chine se aquaculture.However it has been a g reat lo ss in nori
farming due to the degeneration of the germplasm quali ty in the last y ears.In o rder to understand the
genet ic backg round of P.haitanensis and guide i ts g enetic breeding and germplasm resource
pro tection , Inter-simple sequence repeats (ISS R) markers w ere used to invest igate the genetic
variations wi thin and among 3 populat ions(PT , NR and DS)of P .hai tanensis.The thal li samples
were collected f rom 60 individuals.15 ISSR primers g ave rise to 222 discernible DNA bands of w hich
186(83.78%)were polymorphic , indicated a considerable gene tic v ariat ion at specif ic level.A t the
population level , the pe rcentage of polymorphic bands(P)was f rom 80.18% to 81.53%, 80.93% on
ave rage.Expected heterozygosi ty (h)and Shannons info rmation index (I)were 0.3304 and 0.4834
respectively at specific level , 0.3809 and 0.4551 at population level.Acco rding to the value of Gs t , a
large proport ion of genetic variance (93.5%) of P .haitanensis was among individuals w ithin
population , only 6.5% genetic variance w as among populations , the results indicated that the genetic
different iation lev el among the 3 populations of P.hai tanensis was low.And according to the value of
Nm , the reason of the low genetic dif ferentiation level among populations o f P.haitanensis was the
suff icient gene f low .UPGMA cluster analy sis based on Neis genet ic distance show ed that the
individuals from the same population w ere no g rouped to gether , but randomly.At Last , the necessa ry
of protecting the germplasm resource of P .haitanensis also w as discussed.
Key words: Porphyra haitanensis; inter-simple sequence repeat; genetic diversity; genetic
different iation
724 水 产 学 报 32 卷