全 文 ：第 26卷 第 4期 台 湾 海 峡 Vol.26, No.4
2007年 11月 JOURNALOFOCEANOGRAPHYINTAIWANSTRAIT Nov., 2007
收稿日期:2006-12-27
基金项目:国家自然科学基金资助项目(40676080);国家重点基础研究发展规划项目(2005CB422305)
作者简介:邢小丽(1979～ ),女 ,博士研究生.
通讯作者:梁君荣 ,女 ,讲师;E-mail:sunljr@xmu.edu.cn
大亚湾水域两种拟菱形藻的
形态学鉴定及毒素分析
邢小丽1 ,杨军霞1 ,康燕玉 2 ,高亚辉 1 ,梁君荣 1 ,林旭吟 3
(1.厦门大学生命科学学院 ,福建 厦门 361005;2.厦门市农产品质量安全检验测试中心 ,
福建 厦门 361009;3.厦门海洋职业技术学院 , 福建 厦门 361012)
摘要:对 2005年分离自广东大亚湾的两种潜在产毒拟菱形藻进行了形态学观察和毒性
分析.通过透射电子显微镜(TEM)观察确认藻种为细弱拟菱形藻 (Pseudo-nitzschia
cuspidata)和多纹拟菱形藻(P.multistriata).采用高效液相色谱法(HPLC)对这两种
藻的常规培养样进行软骨藻酸毒素检测 ,结果均未检测到软骨藻酸.鉴于以上两种拟菱
形藻存在着潜在产毒特性 ,不同培养条件的诱导实验尚需继续.
关键词:拟菱形藻;透射电子显微镜;软骨藻酸;高效液相色谱
中图分类号:Q949.27 文献标识码:A 文章编号:1000-8160(2007)04-0576-07
1987年加拿大爱德华王子岛东海岸发生因食用紫贻贝而造成的中毒死亡事件 ,造成 100
多人中毒 , 3人死亡.中毒者主要表现为腹痛 、腹泻 、呕吐 ,并伴有严重的头痛 、记忆丧失 、意识
混乱 、昏迷等症状.其中 12人病愈后记忆丧失长达 18个月之久 ,因此称之为记忆丧失性贝类
中毒(amnesicshelfishpoisoning, ASP).后经加拿大国立大西洋研究中心的专家们鉴定 ,发现
中毒物质为由多列拟菱形藻 (Pseudo-nitzschiamultiseries)产生的软骨藻酸(domoicacid).此
后 ,在加拿大 、美国海岸拟菱形藻产生软骨藻酸而引起危害事件不断被报道 [ 1] .
到目前为止 ,拟菱形藻属已有 12种被报道可产生软骨藻酸[ 2 ～ 4] ,其中澳洲拟菱形藻 (P.
australis)、成列拟菱形藻 (P.seriata)与多列拟菱形藻 (P.multiseries)的产毒性已得到广泛的认
可.而其他 9种:靓纹拟菱形藻 (P.caliantha)、细弱拟菱形藻 (P.cuspidata)、拟柔弱拟菱形藻 (P.
pseudodelicatisima)、多纹拟菱形藻 (P.multistriata)、尖刺拟菱形藻 (P.pungens)、柔弱拟菱形藻
(P.delicatesima)、P.fraudulenta、 P.turgidula和 P.galaxiae的毒性在不同地域则表现不同.
拟菱形藻也同样广泛分布于我国沿海 ,到目前为止 ,自南到北已报道的拟菱形藻有澳洲拟
菱形藻 、细弱拟菱形藻 、柔弱拟菱形藻 、多列拟菱形藻 、多纹拟菱形藻 、尖刺拟菱形藻 、拟柔弱拟
菱形藻 、成列拟菱形藻 、中华拟菱形藻 、 P.subpacifica, P.subfraudulenta, P.turgidula共 12
种 [ 5, 6] .其中有 9种是潜在产毒种 ,在非中国海区均有产毒报道 ,它们是:澳洲拟菱形藻 、细弱
拟菱形藻 、柔弱拟菱形藻 、多列拟菱形藻 、多纹拟菱形藻 、尖刺拟菱形藻 、拟柔弱拟菱形藻 、成列
拟菱形藻 、 P.turgidula[ 5, 6] .虽然陈西平等(2001)检测到我国渤海等海域部分海产品中存在
低浓度的软骨藻酸[ 7] ,李大志等(2002)也报道大连海域黑石礁省区的扇贝受到了软骨藻酸的
4期 邢小丽等:大亚湾水域两种拟菱形藻的形态学鉴定及毒素分析
污染[ 8] ,但是到目前为止 ,尚无关于中国海域拟菱形藻产生软骨藻酸的直接相关报道.那么分
布在我国海域的潜在产毒拟菱形藻是否会产毒 ?在何种情况下产毒? 这都需要我们进行相关
工作来进一步阐明.
最早用于检测软骨藻酸的方法是依据 AOAC确立的小鼠生物法 [ 9] .该方法对软骨藻酸的
检测下限约为 40μg/g,虽然方法简单易行 ,但检测的精确度不高.而高效液相色谱法(HPLC)
由于其灵敏度高 ,最低检测下限可达到 0.3 ～ 10ng,得到了广泛的认可和应用.因此 ,本文对分
离自我国广东大亚湾的两种潜在产毒拟菱形藻(即:细弱拟菱形藻和多纹拟菱形藻)在实验室
常规条件下培养 ,选用 HPLC方法检测其产毒的可能性.
1 材料和方法
1.1 藻株的培养
实验藻株:细弱拟菱形藻(厦门大学硅藻实验室藻种库株系号 MMDL547,下同)与多纹拟
菱形藻(MMDL548)均于 2005年 11月分离自广东大亚湾.
培养条件:在 1 000cm3三角瓶中盛 800cm3f/2培养基培养.海水采自厦门港 ,用 0.45μm
滤膜过滤 ,高压灭菌后加入 f/2母液配成 f/2培养基.培养基盐度:29.培养温度:20℃,光照强
度:5 000lx,光周期∶暗周期 =12∶12(h).
接种:取处于指数生长期的藻液 ,按藻液∶培养基 =1∶30的比例进行接种 ,细胞起始浓度
约为 1×104个 / cm3.
1.2 形态学观察
采用光学显微镜(LM)和透射电子显微镜(TEM)观察毒素检测前的拟菱形藻的形态特
征.其中 TEM观察的样品处理方法为:取 5cm3的藻液 ,加入等体积浓硫酸 , 100℃水浴 20min,
用蒸馏水多次水洗至中性.取 10mm3样品制成铜网 , 自然晾干或在白炽灯下烘干后置于
JEM2100 TEM下观察拍照.
1.3 高效液相色谱法检测藻毒素
1.3.1 样品预处理 藻细胞及培养液的收集:从藻种扩大培养第 2天起 ,隔天取藻液 15cm3 ,
至衰败为止.藻液经 0.45μm孔径滤膜过滤 ,收集滤液 ,同时将留在滤膜上的藻细胞用 5cm3灭
菌海水将其从滤膜上转移到 10cm3离心管中(离心管事先用酸浸泡过),将滤液和重悬后的藻
液 -20℃条件下保存备用.
藻细胞及培养液的预处理:参考 Vale(2001)的方法 [ 10] ,将重悬的藻液用直径为 0.1cm的
超声波破碎仪(virsonic475)冰浴破碎 5min.保存的细胞培养液滤液和超声破碎后的混合物经
0.22μm滤膜过滤 ,取滤液直接进样.
1.3.2 HPLC-DAD 采用 Agilent1100型高效液相色谱仪(二极管阵列检测器 , DAD)对预处
理的样品进行软骨藻酸检测.分析方法在 Vale等(2001)建立的方法上做相应改动.
流动相:水∶乙腈∶三氟乙酸 =80∶20∶0.1;流速:0.5cm3 /min;柱子:反相 ZORBAXEclipseXDB-
C8(4.6mm×150mm);检测波长:242nm,波宽:10nm.柱温:25℃.进样量:10mm3 [ 10] .
1.3.3 软骨藻酸标准曲线的建立 用乙腈∶水(1∶9)混合液将软骨藻酸标准品稀释至浓度为
0.1mg/cm3 ,再用流动相将标准品分别配制浓度为 0.1、0.5、1、5、10、15、20、25μg/cm3的软骨
藻酸标准溶液 ,进行 HPLC检测 ,每个样品测定 3次.以软骨藻酸的质量浓度 x(μg/cm3)为横
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坐标 ,以 3次测定的软骨藻酸的平均峰面积 y为纵坐标 ,做出标准曲线.软骨藻酸标准样(纯度
>95μg/cm3)购自上海生物工程公司.
2 结果
2.1 形态鉴定
细弱拟菱形藻的细胞间以壳面全长的 1/3连接成链状群体.细胞壳面披针形 ,从壳面中部
向两端逐渐变成尖细 ,长 17 ～ 55μm,宽 1.9 ～ 3.1μm.壳缝强烈偏心 ,具中央较大船骨点.肋突
分布均匀 ,密度为 10μm内 19 ～ 25个.肋纹密度为 10μm内 35 ～ 44条.点条纹由一排卵圆形或
方形孔组成 ,每微米 4 ～ 6个(图 1 A—D).
多纹拟菱形藻的细胞间以壳面全长的 1/9至 1 /11连接成链状群体.壳面外形略呈 “S”
形 ,两端分别向相反方向弯曲.壳面长 23 ～ 56μm,宽 2.5 ～ 4μm.管壳缝强烈偏心 ,无中央较大
船骨点.点条纹由两排孔纹组成 ,两条相邻的肋纹基部相连 ,并于相邻的肋突融合 ,形成 “Y”字
形.肋突密度为 10 μm内 23 ～ 26个 ,肋纹密度为 10 μm内 37 ～ 42,孔纹密度为每微米 5 ～ 6个
(图 1E—H).
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2.2 毒素分析
2.2.1 软骨藻酸标准曲线的建立和
最低检测限 建立软骨藻酸 HPLC检
测的标准曲线 ,如图 2所示.结果表明:
软骨藻酸浓度在 0.1 ～ 25μg/cm3时 ,其
峰面积与质量浓度有良好的线性关系
(R2 =0.999 9), 回归方程为:y=
103.25x.本方法的最低检测下限为
10ng/cm3.
2.2.2 回收率的测定 将浓度为
0.1mg/cm3软骨藻酸标准品 0.24cm3与 2.76cm3的海水混合进行处理 ,按 “1.3.1”节的方法
进行处理 ,共做 6个平行.实验证实本方法的回收率为 90.491%.Agilent1100型高效液相色谱
仪的重现性标准偏差为 47.16,本实验方法的重现性标准偏差为 28.49.对藻液的提取方法并
未影响对软骨藻酸的分析.
2.2.3 样品检测 软骨藻酸的出峰保留时间为 7.418min(图 3a所示).分别对常规培养的细
弱拟菱形藻和多纹拟菱形藻进行 HPLC检测 ,发现在预定的保留时间内都未出现样品峰(图 3
b、c、d),表明从所检测的样品中未检测出软骨藻酸.
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3 讨论
拟菱形藻的产毒能力是一个比较复杂的情况.报道过的有毒拟菱形藻并非一定会产生软
骨藻酸.大部分产毒拟菱形藻都具有产毒株和无毒株两种.营养盐(如磷 、硅等)、光周期 、盐度
等条件的变化都可能对有毒拟菱形藻的产毒能力产生影响.Fehling等(2005, 2004)证实 ,有毒
种成列拟菱形藻在磷 、硅缺陷条件下和长的光周期条件下(光∶暗 =18∶6),会产生更多的软骨
藻酸[ 11, 12] .Thessen等(2005)指出 ,由食用产自高盐度海区牡蛎而引发的记忆缺失性贝毒
(ASP)事件远多于低盐度海区 [ 13] .Bates等(1998)认为 ,氮不仅是藻细胞生长的必需元素 ,同
时还是软骨藻酸合成的必需元素[ 14] .软骨藻酸可能是微量金属元素(如铁 、铜)的鳌合物 ,所以
它的产生可能和海水中的铁和铜离子的浓度密切相关[ 15] .培养于铁充足环境中的多列拟菱形
藻比在缺铁环境生长可产生较多的软骨藻酸 ,而铜的情况刚好相反 [ 16] .
虽然目前尚无关于中国海域拟菱形藻产生软骨藻酸的直接相关报道 ,但是已有学者发现
我国渤海和大连等海域的海产品中存在低浓度的软骨藻酸 [ 7, 8] .这提示我国海区的拟菱形藻
有可能产生软骨藻酸.
我们所分析的细弱拟菱形藻和多纹拟菱形藻在国外都已有相关产毒报道 [ 3, 17] .但是 ,本文
对实验室培养的这两种潜在产毒拟菱形藻在 HPLC检测限度内没有检测到软骨藻酸的产生 ,
其可能的原因有:
(1)大亚湾水域分离得到的这两种拟菱形藻不产生软骨藻酸.但在我国其他海区已发现
的贝类体内存在软骨藻酸 ,而中国南海海域为赤潮高发区 ,此水域分布的拟菱形藻种类和数量
非常丰富 ,因此可能存在尚未被检测到的产毒拟菱形藻.所以我们还需进一步的分离 、培养及
检测等相关工作来作进一步判断.
(2)这两种拟菱形藻可能需要一定条件的诱导才能产生软骨藻酸.我们所分析只是在常
规培养条件下.因此 ,我们将进一步改变营养盐 、光照 、温度等其他条件进行探讨.
(3)拟菱形藻在实验室培养条件下的产毒能力与其在自然海区的产毒能力存在着差别.
实验室培养条件可能会抑制其产生软骨藻酸.Bates指出 ,有性生殖产生的较大的新细胞较个
体小 、分裂多次的细胞可产生更多的软骨藻酸 [ 18] .我们发现 ,拟菱形藻在实验室培养一段时间
后 ,藻体细胞会发生变形 ,细胞变小 ,成链现象消失.且培养的时间越长 ,藻体变形就越严重 ,最
终会导致死亡.这提示藻细胞在实验室培养条件下处于的生长状态也可能影响其产毒能力.
上述原因都仅仅只是推测 ,我们正在进行相关的工作 ,以验证和进一步探讨中国南海及东
海海域拟菱形藻的产毒情况.
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Morphologicalstudyandtoxicanalysis
fortwoPseudo-nitzschiaspeciesisolatedfromDayaBay
XINGXiao-li1 , YANGJun-xia1 , KANGYan-yu2 , GAOYa-hui1 , LIANGJun-rong1 , LINXu-yin3
(1.SchoolofLifeSciences, XiamenUniversity, Xiamen361005, China;
2.XiamenInspectionandTestingCenterofAgriculturalProductQuantityandSecurity, Xiamen361009, China;
3.XiamenOceanVocationalColege, Xiamen361012, China)
Abstract:Inthispaper, domoicacid(DA)contentwasdetectedbyHPLCfortwoPseudo-nitzschia
speciesisolatedfromDayaBayin2005.Basedonthemorphologicalcharacteristicsobservedunder
transmitingelectronicmicroscope(TEM), theywereidentifiedasPseudo-nitzschiacuspidata
(Halse)HalseandP.multistriata(Takano)Takano.Thesetwoalgalstrainswereculturedinrou-
tinecondition:f/2medium, 20℃underaniradianceof5 000lxina12∶12light∶darkcycle.The
resultssuggestedthatnoDAwasproducedbythesetwostrainsunderthelabculture.However, due
tothecomplexityinDAproductionamongPseudo-nitzschiaspeciesandthepotentialtoxicproduction
abilityoftheabovespeciesinotherareasoftheworld, furtherstudiesonthetoxicityarerequested
underdiferentgrowthconditions.
Keywords:Pseudo-nitzschia;transmitingelectronicmicroscope(TEM);domoicacid(DA);high
performanceliquidchromatography(HPLC)
(责任编辑:郭水伙)
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