全 文 ：收稿日期:2014 － 11 － 14;修回日期:2015 － 04 － 20
基金项目:国家高技术研究发展计划(863)资助(2014AA022103)
作者简介:陆向红(1971)，女，副教授，硕士生导师，博士，研
究方向为生物质能源(E-mail)luxh@ zjut． edu． cn。
油脂加工
响应面法优化眼点拟微绿球藻酶法提油工艺研究
陆向红，贾俊乾，张秋红，黄晨蕾，计建炳
(浙江工业大学 化学工程学院，浙江省生物质燃料利用技术研究重点实验室，杭州 310014)
摘要:采用纤维素酶酶解眼点拟微绿球藻提取胞内油脂。在单因素实验的基础上，以酶用量、酶解
时间、酶解温度、酶解 pH为自变量，油脂提取效率和 EPA提取效率为响应值进行响应面法优化酶
解反应条件。结果表明:对油脂提取效果影响的主次顺序为酶解温度 ＞酶解 pH ＞酶用量 ＞酶解时
间，在酶用量 1． 59 g /kg(以干藻粉质量计)、酶解时间 2． 11 h、酶解温度 39． 3℃、酶解 pH 4． 17 的条
件下，油脂提取效率达到最大值 98． 72% #0． 15%;对 EPA 提取效果影响的主次顺序为酶解温
度 ＞酶解时间 ＞酶解 pH ＞酶用量，在酶用量 1． 60 g /kg(以干藻粉质量计)、酶解时间 1． 86 h、酶解
温度 37． 9℃、酶解 pH 4． 10 的条件下，EPA提取效率达到最大值 97． 86% #0． 12%。
关键词:眼点拟微绿球藻;纤维素酶;酶法提取;油脂;EPA
中图分类号:TS224;TQ644 文献标志码:A 文章编号:1003 － 7969(2015)09 － 0013 － 05
Optimization of enzymatic extraction of oil from Nannochloropsis oculata by
response surface methodology
LU Xianghong，JIA Junqian，ZHANG Qiuhong，HUANG Chenlei，JI Jianbing
(Zhejiang Province Key Laboratory of Biofuel，College of Chemical Engineering，
Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China)
Abstract:The enzymatic extraction of oil from Nannochloropsis oculata by cellulase was studied． Using
enzyme dosage，enzymolysis time，enzymolysis temperature and enzymolysis pH as variables and extraction
efficiencies of oil and EPA as response values，the enzymatic extraction conditions were optimized by re-
sponse surface methodology on the basis of single factor experiment． The results showed that enzymolysis
temperature had the greatest effect on the extraction efficiency of oil，followed by enzymolysis pH，enzyme
dosage and enzymolysis time，and extraction efficiency of oil reached 98． 72% #0． 15% under the condi-
tions of enzyme dosage 1． 59 g /kg (based on the mass of dry algal powder)，enzymolysis time 2． 11 h，
enzymolysis temperature 39． 3℃ and enzymolysis pH 4． 17． Enzymolysis temperature had the largest im-
pact on the extraction efficiency of EPA，followed by enzymolysis time，enzymolysis pH and enzyme dos-
age，and the extraction efficiency of EPA was 97． 86% #0． 12% under the conditions of enzyme dosage
1． 60 g /kg(based on the mass of dry algal powder) ，enzymolysis time 1． 86 h，enzymolysis temperature
37． 9℃ and enzymolysis pH 4． 10．
Key words:Nannochloropsis oculata;cellulase;enzymatic extraction;oil;EPA
眼点拟微绿球藻(Nannochloropsis oculata)生长
速度快、适应能力强、油脂含量高(31% ～ 68%［1］)，
同时油脂中富含花生四烯酸(AＲA)、二十碳五烯酸
(EPA)等多不饱和脂肪酸，有利于降低胆固醇和甘
油三酯的含量，促进人体内饱和脂肪酸的代谢，从而
降低血液黏稠度，增强血液循环，提高组织供氧能
力，消除疲劳，可预防脑血栓、脑溢血、高血压等心脑
血管病，具有重要的医疗保健功能［2 － 3］。微藻是制
备生物柴油的良好原料［4］。生物柴油是目前最具
发展潜力的大宗生物基液体燃料［5 － 7］，可作为未来
312015 年第 40 卷第 9 期 中 国 油 脂
化石柴油的理想替代品［8］。因此，眼点拟微绿球藻
对生产生物柴油和保健品来说都具有很大潜力。
因微藻细胞体积小，细胞壁结构复杂、坚韧，从
微藻中提取油脂具有一定的困难［9 － 10］。常用的细
胞破壁方法有机械法、酸水解法、酶法等。机械法效
率低，酸水解法不仅对设备产生腐蚀，同时产生大量
酸性废水，而酶法效率高、酶解条件温和，不会对藻
油中的 n － 3 多不饱和脂肪酸产生影响，是可行的破
壁提油的方法。Gerken［11］、Elake［12］等用酶法从小
球藻中提取油脂制备生物燃料。崔丁维等［13］采用
水酶法对裂殖壶菌破壁提油，得率达 80%以上。林
杰［14］研究了酶解温度、pH、酶用量、反应时间对复
合酶降解裂殖壶菌细胞壁油脂提取效果的影响。这
些研究结果表明，酶法破壁提油是可行的，但所用的
酶及酶解的条件与藻的种类有关，针对藻的种类，选
择适宜的酶和酶解条件才能有效提高油脂的提取效
率。本文首先测定了眼点拟微绿球藻细胞壁的组
成，根据其组成选用纤维素酶酶解，并以油脂提取效
率和 EPA提取效率为评价指标，采用响应面法优化
酶解反应条件，以期为眼点拟微绿球藻的开发应用
奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 实验材料
眼点拟微绿球藻(Nannochlorpsis oculata)，来自
中国科学院典型培养物保藏委员会下属的海藻种质
库(中国青岛，chl － 3)，经涂布平板的方法纯化后，
在实验室保存待用。
纤维素酶，货号 C109262，由 Aladdin Chemistry
Co．，Ltd．提供，酶活性为 10 000 U /g，最适 pH 4． 0 ～
5． 0，最适温度 40 ～ 60℃。
1． 2 实验方法
1． 2． 1 眼点拟微绿球藻细胞壁组成测定
称取一定量干藻粉，采用 72%浓硫酸水解法测定
眼点拟微绿球藻细胞壁中的纤维素含量，采用 2 mol /L
盐酸水解法(即比色法)测定半纤维素含量，采用
0． 15%咔唑无水乙醇溶液比色法测定果胶含量［15］。
1． 2． 2 眼点拟微绿球藻纤维素酶酶解破壁提油
按照窦晓等［16］的方法对眼点拟微绿球藻进行
扩种、培养、采收。
取 1 g干藻粉加入到 100 mL 的圆底烧瓶中，加
入 10 mL去离子水，搅拌均匀，用 Na2HPO4柠檬酸缓
冲溶液调节 pH，加入适量纤维素酶，置于恒温磁力
搅拌器中，在一定温度下酶解破壁一定时间后，向酶
解体系中加入 10 mL 无水乙醇使酶失活，用 20 mL
乙醚萃取 2 次，合并萃取液、脱溶、称重。
酶法提取获得的藻油，参照窦晓等［16］的方法，
经甲酯化后用气相色谱法测定其脂肪酸组成和
EPA含量。
根据下列公式计算油脂和 EPA提取效率。
η油脂 =m1 /m0 × 100% (1)
ηEPA =m3 /m2 × 100% (2)
式中:η油脂、ηEPA分别为油脂提取效率、EPA 提
取效率，%;m0、m1 分别为干藻粉样品中含有的油脂
质量、提取的油脂质量，g;m2、m3 分别为干藻粉样品
中含有的 EPA质量、提取油脂中的 EPA质量，g。
2 结果与讨论
2． 1 眼点拟微绿球藻细胞壁组成和酶的选择
测定结果表明，眼点拟微绿球藻的细胞壁主要
由 42． 22%纤维素、11． 25%半纤维素、32． 32%果胶
和 14． 21%的其他物质组成。
根据眼点拟微绿球藻细胞壁的组成，实验选用
了一种含有少量半纤维素酶和果胶酶的纤维素混合
酶(简称纤维素酶)降解眼点拟微绿球藻的细胞壁，
提取藻油。图 1 为酶解前后眼点拟微绿球藻的细胞
形态。
酶解前
酶解后
图 1 显微镜(×400)下酶解前后眼点拟微绿球藻的细胞形态
从图 1 可以看出，与酶解前相比，酶解后的藻细
胞支离破碎，这表明纤维素酶降解了微藻的细胞壁，
使藻油等细胞内的物质流出。
2． 2 纤维素酶酶解眼点拟微绿球藻提油的单因素
实验
微藻酶解破壁提油效率不仅与酶的种类有关，
还与酶用量、酶解温度、酶解 pH 和酶解时间有关。
采用单因素实验，在酶解温度 45℃、酶解 pH 4． 5、酶
解时间 2 h 的条件下，研究酶用量(以干藻粉质量
计，下同)对油脂与 EPA提取效率的影响;在酶用量
41 CHINA OILS AND FATS 2015 Vol. 40 No. 9
1． 5 g /kg、酶解温度 45℃、酶解 pH 4． 5 的条件下，研
究酶解时间对油脂与 EPA提取效率的影响;在酶用
量 1． 5 g /kg、酶解 pH 4． 5、酶解时间 2 h 的条件下，
研究酶解温度对油脂与 EPA提取效率的影响;在酶
解温度 45℃、酶用量 1． 5 g /kg、酶解时间 2 h的条件
下，研究酶解 pH 对油脂与 EPA 提取效率的影响。
结果见图 2 ～图 5。
图 2 酶用量对油脂与 EPA提取效率的影响
图 3 酶解时间对油脂与 EPA提取效率的影响
图 4 酶解温度对油脂与 EPA提取效率的影响
图 5 酶解 pH对油脂与 EPA提取效率的影响
从图 2 可以看出，油脂与 EPA提取效率均随着
酶用量的增加而增加。酶用量过低时破壁效率低，
油脂提取效率较低;酶用量过高，底物基本被酶饱
和，酶解效率趋于稳定，此时提高酶用量对油脂与
EPA提取效率影响不大，但会增加酶的成本。因
此，眼点拟微绿球藻酶法提油的适宜酶用量为
1． 0 ～ 2． 0 g /kg。
从图 3 可以看出，酶解时间越长，破壁越彻底，
油脂提取效率越高;但酶解时间太长，油脂被氧化的
程度也会随着上升，EPA 提取效率下降。因此，纤
维素酶酶解眼点拟微绿球藻提油的适宜酶解时间为
1． 5 ～ 2． 5 h。
酶解温度和酶解 pH是影响酶活性的两个重要
因素，同时酶解温度还会影响眼点拟微绿球藻藻油
中 EPA的稳定性。从图 4、图 5 可以看出，酶解温度
和酶解 pH对油脂与 EPA提取效率的影响都是钟形
曲线。因此，纤维素酶酶解眼点拟微绿球藻提油的
适宜酶解温度为 35 ～ 45℃，适宜的酶解 pH 为
3． 0 ～ 5． 0。
2． 3 纤维素酶酶解眼点拟微绿球藻提油的响应面
优化
在单因素实验的基础上，采用 Box － Behnken 模
型，选取酶用量、酶解时间、酶解温度、酶解 pH 为自
变量，以油脂提取效率和 EPA提取效率为响应值进
行响应面实验，以优化眼点拟微绿球藻的酶解提油
工艺。响应面因素水平编码见表 1，Box － Behnken
实验设计与结果见表 2，方差分析见表 3。
表 1 响应面因素水平编码
水平
X1酶用量 /
(g /kg)
X2酶解
时间 /h
X3酶解
温度 /℃
X4酶解
pH
－ 1 1． 0 1． 5 35 3． 0
0 1． 5 2． 0 40 4． 0
1 2． 0 2． 5 45 5． 0
表 2 Box － Behnken实验设计与结果
实验号 X1 X2 X3 X4
提取效率 /%
油脂 EPA
1 － 1 0 1 0 65． 10 51． 53
2 0 0 － 1 1 74． 87 80． 00
3 0 0 0 0 98． 92 93． 98
4 － 1 0 0 1 76． 52 72． 76
5 0 1 1 0 71． 29 50． 82
6 0 1 0 － 1 70． 95 61． 84
7 0 0 0 0 98． 71 93． 78
8 1 － 1 0 0 84． 79 87． 24
9 0 0 1 － 1 59． 46 47． 04
10 1 0 0 － 1 73． 61 69． 90
11 0 － 1 1 0 66． 16 57． 65
12 － 1 0 － 1 0 74． 02 79． 08
13 0 0 0 0 100． 39 95． 41
14 0 － 1 － 1 0 77． 35 88． 78
15 1 0 0 1 81． 86 77． 76
512015 年第 40 卷第 9 期 中 国 油 脂
续表 2
实验号 X1 X2 X3 X4
提取效率 /%
油脂 EPA
16 0 0 － 1 － 1 67． 04 71． 63
17 0 － 1 0 1 75． 15 77． 35
18 0 0 1 1 65． 70 52． 04
19 1 0 － 1 0 80． 72 86． 33
20 0 1 － 1 0 81． 60 80． 82
21 0 0 0 0 99． 28 94． 29
22 － 1 0 0 － 1 68． 89 65． 51
23 － 1 － 1 0 0 76． 93 79． 18
24 0 0 0 0 98． 61 93． 67
25 － 1 1 0 0 82． 55 71． 94
26 1 0 1 0 71． 19 56． 33
27 1 1 0 0 89． 77 78． 16
28 0 － 1 0 － 1 75． 85 78． 06
29 0 1 0 1 88． 32 76． 94
从表 3 可以看出，油脂与 EPA提取效率的模型
均极显著(P ＜ 0． 01)，表明回归方程描述各因素与
响应值之间的关系时，因变量与所有自变量之间的
线性关系显著，即这种实验方法是可靠的;失拟项不
显著(P = 0． 318 4、0． 161 5 ＞ 0． 05)，表明回归模型
正确;Ｒ2 = 0． 997 1、0． 997 3，Ｒ2Adj = 0． 994 2、0． 994 5，
说明模型可靠性好。因此，该实验模型能真实准确
地描述和预测实际情况。从回归方程系数的显著性
检验可以看出:一次项 X1、X2、X3、X4均具有极显著
性，这表明酶用量、酶解时间、酶解温度和酶解 pH
对眼点拟微绿球藻酶法提取油脂和 EPA 的影响极
显著;二次项 X21、X
2
2、X
2
3、X
2
4对眼点拟微绿球藻酶法
提取油脂和 EPA的影响也极显著;交互项 X2X4极显
著，即酶解时间和酶解 pH 的交互作用对眼点拟微
绿球藻酶法提取油脂和 EPA的影响极显著。
表 3 方差分析
方差来源 自由度
油脂提取效率
平方和 均方 F P
EPA提取效率
平方和 均方 F P
模型 14 3 692． 50 263． 75 341． 10 ＜ 0． 000 1 5 839． 33 417． 10 363． 68 ＜ 0． 000 1
X1 1 117． 95 117． 95 152． 60 ＜ 0． 000 1 106． 29 106． 29 92． 68 ＜ 0． 000 1
X2 1 65． 28 65． 28 84． 68 ＜ 0． 000 1 190． 05 190． 05 165． 71 ＜ 0． 000 1
X3 1 263． 82 263． 82 341． 20 ＜ 0． 000 1 2 443． 15 2 443． 15 213． 00 ＜ 0． 000 1
X4 1 178． 38 178． 38 230． 70 ＜ 0． 000 1 153． 06 153． 06 133． 50 ＜ 0． 000 1
X1X2 1 0． 10 0． 10 0． 13 0． 721 6 0． 84 0． 84 0． 74 0． 405 6
X1X3 1 0． 09 0． 09 0． 12 0． 732 3 1． 50 1． 50 1． 13 0． 272 0
X1X4 1 0． 09 0． 09 0． 12 0． 732 3 0． 09 0． 09 0． 08 0． 779 2
X2X3 1 0． 19 0． 19 0． 24 0． 628 7 0． 31 0． 31 0． 27 0． 608 4
X2X4 1 80． 36 80． 36 103． 90 ＜ 0． 000 1 62． 54 62． 54 54． 53 ＜ 0． 000 1
X3X4 1 0． 63 0． 63 0． 81 0． 382 5 2． 83 2． 83 2． 47 0． 138 2
X21 1 498． 37 498． 37 644． 60 ＜ 0． 000 1 460． 53 460． 53 401． 55 ＜ 0． 000 1
X22 1 311． 83 311． 83 403． 30 ＜ 0． 000 1 299． 35 299． 35 261． 02 ＜ 0． 000 1
X23 1 2 016． 21 2 016． 21 2 608． 00 ＜ 0． 000 1 2 017． 30 2 017． 30 1 759． 00 ＜ 0． 000 1
X24 1 1 399． 01 1 399． 01 1 809． 00 ＜ 0． 000 1 1 278． 31 1 278． 31 1 114． 60 ＜ 0． 000 1
剩余 14 10． 82 0． 77 16． 06 1． 15
失拟 10 8． 78 0． 88 1． 71 0． 318 4 14． 09 1． 41 2． 86 0． 161 5
纯误差 4 2． 05 0． 51 1． 97 0． 49
总和 28 3 703． 28 5 855． 39
图 6 反映了酶用量 1． 5 g /kg，酶解温度 40℃的
条件下，酶解时间和酶解 pH 对眼点拟微绿球藻油
脂和 EPA提取效率的交互影响。从图 6 可以看出，
在酶解时间 1． 9 ～ 2． 1 h，酶解 pH 4． 0 ～ 4． 5 所构成
的区域内，油脂和 EPA提取效率均达到最大值。由
F的大小判断出各因素对油脂提取效果影响的主次
顺序为酶解温度 ＞酶解 pH ＞酶用量 ＞酶解时间，对
EPA提取效果影响的主次顺序为酶解温度 ＞酶解
时间 ＞酶解 pH ＞酶用量。
根据回归模型，经 Design － Expert 软件分析，眼
点拟微绿球藻酶法提取油脂的最佳条件为:酶用量
1． 59 g /kg、酶解时间 2． 11 h、酶解温度 39． 3℃、酶解
pH 4． 17，最大预测值为 99． 59%。眼点拟微绿球藻
酶法提取 EPA的最佳条件为:酶用量 1． 60 g /kg、酶
解时间 1． 86 h、酶解温度 37． 9℃、酶解 pH 4． 10，最
大预测值为 98． 16%。为验证模型的可靠性，在最
佳条件下进行 3 次重复验证实验，得到眼点拟微绿
球藻的油脂提取效率为 98． 72% #0． 15%，EPA 提取
61 CHINA OILS AND FATS 2015 Vol. 40 No. 9
效率为 97． 86% #0． 12%。实验值与模型预测值基本
吻合，说明该模型真实可靠，可以很好地预测眼点拟
微绿球藻酶法提取油脂和 EPA的提取效率。
图 6 酶解时间与酶解 pH交互作用对油脂和 EPA
提取效率影响的响应面图
3 结 论
(1)眼点拟微绿球藻细胞壁主要由 42． 22%纤
维素，11． 25%半纤维素，32． 32%果胶和 14． 21%其
他物质组成。根据细胞壁组成，实验选择含少量半
纤维素酶和果胶酶的纤维素混合酶用于眼点拟微绿
球藻酶解提油。
(2)通过响应面优化实验得到眼点拟微绿球藻
酶法提取油脂的最佳条件为:酶用量 1． 59 g /kg(以干
藻粉质量计)、酶解时间 2． 11 h、酶解温度39． 3℃、酶
解 pH 4． 17，此时油脂提取效率达到最大值 98． 72% #
0． 15%;眼点拟微绿球藻酶法提取 EPA 的最佳条件
为:酶用量 1． 60 g /kg(以干藻粉质量计)、酶解时间
1． 86 h、酶解温度 37． 9℃、酶解 pH 4． 10，此时 EPA提
取效率达到最大值 97． 86% #0． 12%。实验值与理论值
基本吻合，该模型准确可靠。
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