全 文 ：孔石莼组织内他感物质的初步研究
金 秋，吴翰桂，张昕欣，柯中炉
（台州职业技术学院生化制药研发中心，浙江台州 318000）
摘 要：3.85 kg的孔石莼干粉末用甲醇提取得到320 g粗提物浸膏，浸膏被萃取分离为石油醚相、乙酸
乙酯相、正丁醇相和蒸馏水相。对这4个相进行了高效液相色谱（HPLC）分析，然后对石油醚相和乙酸
乙酯相进行了气相色谱－质谱（GC/MS）联用分析。用赤潮异弯藻进行各个分离组分的杀藻活性检
测。活性检测表明石油醚相和乙酸乙酯相具有很强的杀藻活性，GC/MS分析鉴定其中的16种脂肪酸，
其中不饱和脂肪酸占大部分。活性检测表明9, 12, 15-十八碳三烯酸、6，9，12，15-十八碳四烯酸、5Z，
8Z，11Z，14Z-二十碳四烯酸、5Z，11Z，14Z，17Z-二十碳四烯酸和5Z，8Z，11Z，14Z，17Z-二十碳五烯酸具
有很强的杀藻活性，其有效浓度在 5 mg L-1以下。实验结果表明，孔石莼组织中含有多种不饱和脂肪
酸，其中一些对赤潮异弯藻具有强烈的杀藻作用，不饱和脂肪酸可能是孔石莼组织内抑制赤潮微藻生
长的他感物质重要组成成分之一。
关键词：孔石莼；赤潮异弯藻；他感物质
中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1001-7119（2015）09-0080-05
Preliminary Studies on The Allelochemicals in the Tissue of Ulva pertusa
Jin Qiu，Wu Hangui，Zhang Xinxin，Ke Zhonglu
（Biopharmaceutical Research and Development Center，Taizhou Vocational and Technical College，Zhejiang Taizhou
318000，China）
Abstract：3.85 kg dry powder of Ulva pertusa was extracted with methanol, and 320 g extracts was
obtained. The extracts were partitioned to petroleum ether phase, ethyl acetate phase, butanol phase and
distilled water phase by liquid- liquid fractionation. Thereafter, the 4 phases were analyzed by HPLC,
and petroleum ether phase and ethyl acetate phase were analyzed by GC/MS. Bioassays of the activity of
every fraction were carried out on Heterosigma akashiwo. Petroleum ether phase and ethyl acetate phase
had strong algicidal effect on the microalga. The results of GC/MS revealed that there were 16 fatty acids
in the 2 phases, and most of them were unsaturated fatty acids. The results of bioassays demonstrated
that 5 unsaturated fatty acids in the tissue of Ulva pertusa had strong algicidal effect on Heterosigma
akashiwo, and the effective concentrations were below 5 mg L-1. The results of this study demonstrated
that unsaturated fatty acids in the tissue of Ulva pertusa might be one of the components of the
allelochemicals in the macroalgae.
Keywords：Ulva pertusa；heterosigma akashiwo；allelochemicals
收稿日期：2014-03-19
基金项目：台州市海洋生物资源开发与利用科技创新团队资助项目（MBR2012053）。
作者简介：金秋（1978-），男，浙江临海人，讲师，博士，主要从事天然产物活性成分研究。E-mail: david78225@163.com。
第31卷第9期
2015年9月
科 技 通 报
BULLETIN OF SCIENCE AND TECHNOLOGY
Vol.31 No.9
Sep. 2015
DOI:10.13774/j.cnki.kjtb.2015.09.018
第9期
海洋生态系统中的许多大型海藻和微藻都
能产生多种次级代谢产物，包括不饱和脂肪酸、
多酚、萜、糖苷和硫化物等 [1, 2]。这些次级代谢产
物在海洋生态系统的组成和动态变化中起着重
要的作用[3, 4]。其中，海洋藻类为了抑制竞争对手
而产生的他感物质往往具有特殊的化学结构和
生理功能，对海洋藻类他感物质的提取、分离和
鉴定及其实际应用已成为海洋化学生态学新兴
的前沿研究领域[3]。
随着全世界沿海范围内赤潮问题的日益严
重，给世界经济造成了重大的损失。如何科学、
有效地进行赤潮的治理和控制已成为迫切需要
解决的重大问题；寻找方便有效、低投入、对环境
相对无害的赤潮防治方法为目前所急需[5-7]。
在以前的研究中，我们发现大型海藻孔石莼
（Ulva pertusa）能通过主动分泌某些化学物质有效
地抑制赤潮异弯藻（Heterosigma akashiwo）、亚历
山大藻（Alexandrium tamarense）和海洋原甲藻
（Prorocentrum micans）的生长，并且其组织的甲醇
提取物具有很高的杀藻活性[8]。本研究的主要目
的是探讨孔石莼对赤潮微藻产生他感作用的物
质基础，即采用海洋化学生态学和天然产物化学
研究方法，分离孔石莼组织中抑制赤潮微藻生长
的他感物质，测定其化学结构，阐明孔石莼他感
作用的化学物质本质，为利用孔石莼的他感物质
来进行有限区域内赤潮的防治提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 藻种和培养条件
本研究中作为生物检测（Bioassay）指标种的
赤潮异弯藻无菌株（Heterosigma akashiwo）由中国
海洋大学微藻研究实验室提供。其培养于 f/2[9]培
养液中，培养温度为20°C，光强为60 μmol m-2 s-1，
亮暗时间比为 12∶12。每天定时晃动培养瓶两
次，以防止微藻附壁生长。
孔石莼（Ulva pertusa）于2013年7月采集于青
岛太平角。采集后的藻体组织用自来水仔细清
洗，以去除泥污和附生生物。然后将藻体组织放
置于室内阴凉处完全阴干，并用研钵研磨成细粉
末，共得到孔石莼组织干粉末3.85 kg。
1.2 孔石莼组织粗提物制备及液-液萃取分离
在室温20°C下，用甲醇浸泡搅拌提取3.85 kg
的孔石莼干粉末 3次（每次用甲醇 20 L），每次提
取 24 h。将 3次的提取液合并，用旋转蒸发器在
40 °C减压条件下完全蒸干，回收甲醇，得到黑色
浸膏320 g，得率为8.3%。
将 300 g粗提物浸膏用 90%的甲醇水溶液溶
解，加入石油醚萃取3次，分离浓缩得到石油醚相
浸膏 107 g。再将分离的甲醇水溶液相用旋转蒸
发器在40℃减压条件下除去甲醇，加入适量的蒸
馏水重新溶解，然后加入乙酸乙酯萃取 3次。分
离浓缩得到乙酸乙酯相浸膏68 g。最后在分离的
蒸馏水溶液中加入适量的正丁醇萃取 3次，分离
得到正丁醇相浸膏42 g和蒸馏水相浸膏16 g。萃
取过程中有一些不溶解的盐类物质弃去不用。
分离得到的 4相分别进行生物活性检测，以确定
下一步分离的重点。
1.3 他感物质生物活性检测
本研究中选择赤潮异弯藻作为跟踪、检测孔
石莼组织内他感物质生物活性的指标种。每一
次分离孔石莼组织粗提物所得的各个组分均要
通过以下的方法来确定其杀藻活性：将所得的各
个组分分别溶解于适量的甲醇中，得到各个组分
的 4个浓度梯度溶液（0.1，1，10，100 g L-1），将 10
μL各个浓度梯度溶液加入25 mL锥形瓶中10 mL
的赤潮异弯藻藻液中（初始细胞密度：1×105 cells
mL-1），各个组分在微藻藻液中最终的浓度梯度
为：0.1，1，10，100 mg L-1，各个处理为3重复，然后
将微藻培养 24 h，培养条件同上。能在 1 h内完
全杀死赤潮异弯藻的组分最低浓度作为此组分
的有效浓度。
1.4 萃取分离组分的HPLC分析
为了初步了解孔石莼组织粗提物萃取分离
的 4个组分（石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和
蒸馏水相）的化学组成，利用高效液相色谱
（HPLC）对这4个组分进行了分析。HPLC分析所
用到的仪器和试剂条件如下：高效液相色谱仪
M209型（Waters，日本产）；色谱柱为 C18 3.9×300
mm，5 μm；M490紫外可见光检测器，波长 254
nm；M740数据处理机；流动相为甲醇和水，流速
1 mL min-1。进样量 10 μL，检测时间 70 min。甲
醇为色谱纯，水为超纯水。
1.5 石油醚相和乙酸乙酯相GC/MS分析
根据孔石莼组织提取物各个组分的抑制赤
潮异弯藻活性检测结果和HPLC分析结果，我们
金秋等.孔石莼组织内他感物质的初步研究 81
第31卷科 技 通 报
决定对孔石莼组织粗提物的石油醚相和乙酸乙
酯相进行气相色谱—质谱联用分析（GC/MS）。分
析前，取石油醚相与乙酸乙酯相浸膏各 5 g用硫
酸二甲酯进行甲基化处理后备测。
GC/MS分析所用的仪器为Finnigan 4510 GC/
MS联用仪。气相色谱条件：色谱柱为AC-5石英
毛细管柱，柱长30 m，柱内径为0.25 mm。载气为
高纯氦气。分流压30∶1，柱前压力为14 Pa。气化
室温度为250 °C，柱温150~240 °C，以3 °C min-1的
速度程序升温。质谱条件：质谱电离方式为EI，电
离电压为 70 eV，发射电流 0.25 mA，倍增器电压
1300 V，离子源温度为220℃，扫描周期为1 s。
数据处理及质谱检索：甲基化样品经气相色
谱－质谱分析，所得各组分峰的质谱数据运用计
算机谱库自动进行检索，并参照标准图谱进行核
对，最后对色谱峰用面积归一化进行计算，得出
各组分的相对含量。
图1孔石莼甲醇提取物石油醚相（A）、乙酸乙酯相（B）、正丁
醇相（C）和蒸馏水相（D）的HPLC分析图谱。
Fig.1 HPLC chromatogram of petroleum ether phase (A), ethyl
acetate phase (B), butanol phase (C) and distilled water phase
(D) of the methanol extracts of U. pertusa
2 结果
2.1 萃取分离组分HPLC分析结果
图 1给出了孔石莼甲醇提取物石油醚相、乙
酸乙酯相、正丁醇相和蒸馏水相的HPLC分析图
谱。从图中可以看出，石油醚相中的物质组成比
较简单（图1A），而乙酸乙酯相中的物质组成较复
杂（图 1B）；正丁醇相中的物质组成也较简单（图
1C），蒸馏水相中的物质组成较简单且极性较高
（图1D）。生物活性检测的结果表明，乙酸乙酯相
对赤潮异弯藻具有很高的杀藻活性，其有效浓度
为 18 mg L-1；石油醚相活性次之，其有效浓度为
33 mg L-1。而正丁醇相和蒸馏水相对赤潮异弯藻
没有明显的杀藻作用。对于有杀藻活性的石油
醚相和乙酸乙酯相，其主要成分均在20 min以后
溶出，表明这些物质具有中低极性。
2.2 石油醚相和乙酸乙酯相GC/MS分析结果
孔石莼甲醇提取物石油醚相甲基化以后，经
气相色谱－质谱计算机联用分析，并核对标准图
谱和有关参考文献，共鉴定出6种脂肪酸成分（表
1）；其中不饱和脂肪酸相对含量占 64.22%，而饱
和脂肪酸占22.19%。乙酸乙酯相共鉴定出10种
脂肪酸成分（表 2）；其中不饱和脂肪酸相对含量
占78.23%，而饱和脂肪酸占3.46%。
表1孔石莼甲醇提取物石油醚相主要脂肪酸化学成分
Table 1 Main fatty acid components of petroleum ether phase of
the methanol extracts of Ulva pertusa
分子式
C16H32O2
C16H30O2
C16H30O2
C16H26O2
C18H30O2
C18H28O2
化合物名称
十六碳酸
7-十六碳烯酸
9-十六碳烯酸
4, 7, 10-十六碳三烯酸
9, 12, 15-十八碳三烯酸
6, 9, 12, 15-十八碳四烯酸
相对含
量/%
22.19
5.06
6.65
12.47
14.36
25.68
有效浓度/
（mg L-1）
66.5
46.3
42.8
10.2
5.4
4.6
2.3 他感物质活性生物检测结果
在利用GC/MS确定孔石莼甲醇提取物石
油醚相和乙酸乙酯相中各种脂肪酸的结构和分
子式后，我们向 Sigma公司（美国）购买了以上 16
种脂肪酸纯品，并针对赤潮异弯藻作杀藻活性检
测。检测结果见表 1和表 2。孔石莼甲醇提取物
石油醚相中，9，12，15-十八碳三烯酸和 6，9，12，
15-十八碳四烯酸具有杀藻活性，其有效浓度分
别为 5.4和 4.6 mg L-1。而乙酸乙酯相中，5Z，8Z，
82
第9期
11Z，14Z-二十碳四烯酸、5Z，11Z，14Z，17Z-二十
碳四烯酸和 5Z，8Z，11Z，14Z，17Z-二十碳五烯酸
具有很高的杀藻活性，其有效浓度分别为0.7、0.5
和0.4 mg L-1。生物活性检测结果表明，不饱和脂
肪酸对赤潮异弯藻具有强烈的杀藻作用，其作用
要比饱和脂肪酸强，并且其不饱和程度越高杀藻
作用越强。
表2孔石莼甲醇提取物乙酸乙酯相主要脂肪酸化学成分
Table 2 Main fatty acid components of ethyl acetate phase of the
methanol extracts of Ulva pertusa
3 讨论
许多海洋藻类组织中都含有多种不饱和脂
肪酸，这些不饱和脂肪酸在海洋生态系统中也起
着不同的作用[2, 4]。一方面，对于海藻的捕食者来
说这些不饱和脂肪酸所含的热量很高，是很好的
能量物质[10]。另一方面，一些海藻也分泌不饱和
脂肪酸来抑制其竞争生物的生长，即在海洋生物
间的他感作用中扮演重要角色[3, 11-14]。
本研究的结果表明，孔石莼组织的甲醇提取
物中含有多种不饱和脂肪酸，其中一些对赤潮异
弯藻有强烈的杀藻作用。Kakisawa 等 [15]从黄藻
Cladosiphon okamuranus中提取分离了两种不饱
和脂肪酸：6Z，9Z，12Z，15Z-十八碳四烯酸和 5Z，
8Z，11Z，14Z，17Z-二十碳五烯酸，并检测了这两
种不饱和脂肪酸对赤潮异弯藻的杀藻活性。他
们发现在 2 mg L-1的浓度下，这两种不饱和脂肪
酸能在 30 min内完全杀死赤潮异弯藻细胞。添
加这两种不饱和脂肪酸后，正常的赤潮异弯藻细
胞很快失去活动力，变得圆和静止，最终细胞破
裂。他们还检测了这两种不饱和脂肪酸对其他
多种微藻的杀藻活性，发现其对那些没有细胞壁
的微藻细胞有很强的杀灭作用，而对那些有坚硬
细胞壁的微藻作用就不明显。Suzuki等[11]从红藻
Neodilsea yendoana中也分离提取了 5Z，8Z，11Z，
14Z，17Z-二十碳五烯酸，这种脂肪酸在 1 mg L-1
的浓度下能完全杀死绿藻 Monostroma oxysper⁃
mum。Ikawa等[13]研究了不饱和脂肪酸9，12-十八
碳二烯酸和 9，12，15-十八碳三烯酸对小球藻
Chlorella pyrenoidosa的作用，发现这两种不饱和
脂肪酸能强烈地抑制小球藻的生长。他们的研
究表明，不饱和脂肪酸可能是这些藻类抑制其他
藻类生长的他感物质。
在本研究中，我们也从孔石莼组织甲醇提取
物的乙酸乙酯相中检测到了 5Z，8Z，11Z，14Z，
17Z-二十碳五烯酸，并且在0.4 mg L-1的浓度下就
能在1 h内完全杀死赤潮异弯藻细胞。另外孔石
莼组织中还含有 9, 12, 15-十八碳三烯酸、6，9，
12，15-十八碳四烯酸、5Z, 8Z, 11Z, 14Z-二十碳四
烯酸和 5Z，11Z，14Z，17Z-二十碳四烯酸等多种
不饱和脂肪酸，这些不饱和脂肪酸也能杀灭赤潮
异弯藻，其有效浓度在 5 mg L-1以下（表 1和表
2）。并且赤潮异弯藻在这些不饱和脂肪酸的作
用下细胞也变得圆和静止，最终破裂。这跟Kaki⁃
sawa等[15]和我们以前的研究结果[8]相符合。
不饱和脂肪酸非常容易氧化，并且氧化（不
饱和程度降低）后其杀藻活性降低[13, 15]，这也符合
我们以前研究工作中的观察结果。以上的研究
结果表明，不饱和脂肪酸可能是孔石莼组织内抑
制赤潮异弯藻生长的他感物质的重要组成成分
之一。孔石莼鲜组织是否能主动分泌不饱和脂
肪酸来抑制赤潮微藻的生长还有待于进一步的
研究。孔石莼组织内可能还含有其他种类的他
感物质，这些物质的产生、作用机理以及相互之
间的作用也需要在以后的研究工作中加以验证。
一些研究也证明孔石莼组织中含有丰富的
不饱和脂肪酸 [16,17]，因此孔石莼是鲍鱼等养殖生
物天然的优良饵料。另外由于不饱和脂肪酸具
有降血压、降血脂、降胆固醇、抗血栓、抗动脉硬
分子式
C16H24O2
C16H24O2
C18H34O2
C18H32O2
C20H32O2
C20H32O2
C20H30O2
C20H28O2
C22H44O2
C22H42O2
化合物名称
5E, 8E, 11E, 14E-十六碳四
烯酸
5Z, 8Z, 11Z, 14Z-十六碳四
烯酸
9-十八碳烯酸
9, 12-十八碳二烯酸
5Z, 8Z, 11Z, 14Z-二十碳四
烯酸
5Z, 11Z, 14Z, 17Z-二十碳四
烯酸
5Z, 8Z, 11Z, 14Z, 17Z-二十
碳五烯酸
4, 7, 10, 13, 16, 19-二十二碳
六烯酸
二十二碳酸
13-二十二碳烯酸
相对含
量/%
14.86
4.76
9.17
1.08
8.76
12.32
18.85
6.69
3.46
1.74
有效浓度/
（mg L-1）
5.8
6.4
16.7
14.3
0.7
0.5
0.4
1.2
48.6
36.4
金秋等.孔石莼组织内他感物质的初步研究 83
第31卷科 技 通 报
化等作用，孔石莼还有一定的药用价值。本研究
结果证明，孔石莼组织中的多种不饱和脂肪酸能
高效地杀灭赤潮异弯藻，这为进一步利用我国丰
富的孔石莼资源提供了科学依据。
4 结论
孔石莼组织中含有多种不饱和脂肪酸，其中
一些对赤潮异弯藻具有强烈的杀藻作用，表明不
饱和脂肪酸可能是孔石莼组织内抑制赤潮微藻
生长的他感物质重要组成成分之一。
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