全 文 ：第３２卷第５期
２０１４年１０月
上 海 交 通 大 学 学 报 （农 业 科 学 版）
ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＳＨＡＮＧＨＡＩ　ＪＩＡＯＴＯＮＧ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ）
Ｖｏｌ．３２Ｎｏ．５
　 Ｏｃｔ．２０１４
文章编号：１６７１－９９６４（２０１４）０５－００７６－０８　 ＤＯＩ：１０．３９６９／Ｊ．ＩＳＳＮ．１６７１－９９６４．２０１４．０５．０１４
收稿日期：２０１３－１０－１１
基金项目：国家自然科学基金（３１１７０６５５、３１３７０６９５和３１３００５８０）
作者简介：陈冠群（１９９０－），女，博士生，研究方向：园林植物种质资源保存，Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｇｑ０１１１＠１６３．ｃｏｍ；
申晓辉（１９６２－）为本文通讯作者，女，博士，研究员，研究方向：园林植物种质资源保存与创新，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｈｅｎｘｈ６２＠ｓｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
百子莲胚性愈伤组织玻璃化法超低温保存体系
建立及遗传稳定性分析
陈冠群１，李晓丹２，申晓辉１
（１．上海交通大学 农业与生物学院，上海２００２４０；２．上海市崇明县新海镇农技中心，上海２０２１５０）
摘　要：采用单因素随机区组试验及多因素、多水平正交试验方案建立了百子莲胚性愈伤组织
（ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ，ＥＣｓ）玻璃化法超低温保存体系。将由花梗诱导的胚性愈伤组织接种至预培
养基（ＭＳ＋０．５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖＋１％琼脂）上，在４℃下预培养２ｄ后，在室温下加入装载液（ＭＳ＋０．４
ｍｏｌ／Ｌ蔗糖＋２ｍｏｌ／Ｌ丙三醇＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＮＯ３）处理６０ｍｉｎ；利用改良后的ＰＶＳ　２玻璃化溶液
（ＭＳ＋０．４ｍｏｌ／Ｌ蔗糖＋３０％丙三醇＋１５％乙二醇＋１５％ ＤＭＳＯ）在０℃下处理４０ｍｉｎ，将含有
ＥＣｓ的冻存管投入液氮中冻存１ｈ；在４０℃水浴中快速解冻９０ｓ；用洗涤液（ＭＳ＋１．２ｍｏｌ／Ｌ蔗糖
＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＮＯ３）处理３０ｍｉｎ，每１０ｍｉｎ换１次新鲜的洗涤液；洗涤后，接种到胚性愈伤组织
增殖培养基上恢复培养２４ｈ后，相对成活率分别达５６．９％（ＴＴＣ法）和４３．３％（Ｅｖａｎｓ　ｂｌｕｅ法）。
恢复培养５５ｄ的百子莲胚性愈伤组织经过ＡＦＬＰ多态性检测后未发现基因组变异，证明该方法可
用于百子莲种质资源的超低温保存。
关键词：百子莲；胚性愈伤组织；玻璃化法超低温保存；遗传稳定性；ＡＦＬＰ
中图分类号：Ｓ６８２．３２　　　　文献标识码：Ａ
Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ－Ｂａｓｅｄ　Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　Ｃａｌｕｓ　ｏｆ
Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ｐｒａｅｃｏｘ　ｓｓｐ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ　ａｎｄ
Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｂｙ　ＡＦＬＰ
ＣＨＥＮ　Ｇｕａｎ－ｑｕｎ１，ＬＩ　Ｘｉａｏ－ｄａｎ２，ＳＨＥＮ　Ｘｉａｏ－ｈｕｉ１
（１．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｊｉａｏｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００２４０，Ｃｈｉｎａ；
２．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｃｈｏｎｇｍｉｎｇ　Ｘｉｎｈａｉ　Ｔｏｗｎｓｈｉｐ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０２１５０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｆｏｒ　ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ　ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ（ＥＣｓ）ｏｆ　Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ
ｐｒａｅｃｏｘ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｉｎ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｓｔｕｄｙ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｒａｎｄｏｍ　ｂｌｏｃｋ　ａｎｄ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ．Ｔｈｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ＥＣｓ
ｆｒｏｍ　ｐｅｄｉｃｅｌ　ｗｅｒｅ　ｐｒｅ－ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ＭＳ　ｍｅｄｉｕｍ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ　ｗｉｔｈ　０．５ｍｏｌ／Ｌ　ｓｕｃｒｏｓｅ　ａｎｄ　１％ａｇａｒ　ａｔ　４℃ｆｏｒ
２ｄａｙｓ，ａｎｄ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＭＳ＋０．４ｍｏｌ／Ｌ　ｓｕｃｒｏｓｅ＋２ｍｏｌ／Ｌ　ｇｌｙｃｅｒｏｌ＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＮＯ３）ｆｏｒ　６０
ｍｉｎ　ａｔ　ｒｏｏｍ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｔｈｅｎ　ｅｘｐｏｓｅｄ　ｔｏ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＰＶＳ　２（ＭＳ＋０．４ｍｏｌ／Ｌ　ｓｕｃｒｏｓｅ＋３０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ＋１５％ｇｌｙｃｏｌ
＋１５％ＤＭＳＯ）ｆｏｒ　４０ｍｉｎ　ａｔ　０℃；Ａｆｔｅｒ　ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ＥＣｓ　ｉｎ　ｃｒｙｏ－ｔｕｂｅ　ｗｅｒｅ　ｐｌｕｎｇｅｄ　ｉｎｔｏ　ｌｉｑｕｉｄ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ．Ｏｎｅ
ｈｏｕｒ　ｌａｔｅｒ，ｔｈｅ　ＥＣｓ　ｗｅｒｅ　ｔｈａｗｅｄ　ｒａｐｉｄｌｙ　ｉｎ　４０℃ ｗａｔｅｒ　ｂａｔｈ　ｆｏｒ　９０ｓ，ａｎｄ　ｄｉｌｕｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ＭＳ　ｌｉｑｕｉｄ　ｍｅｄｉｕｍ
ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ　１．２ｍｏｌ／Ｌ　ｓｕｃｒｏｓｅ　ａｎｄ　１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＮＯ３ｆｏｒ　３０ｍｉｎ．Ａｔ　ｌａｓｔ，ＥＣｓ　ｗｅｒｅ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ
第５期 陈冠群，等：百子莲胚性愈伤组织玻璃化法超低温保存体系建立及遗传稳定性分析
ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｒｅ－ｇｒｏｗｔｈ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅｓ　ａｆｔｅｒ　ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ
５６．９％（ｉｎ　ＴＴＣ　ｍｅｔｈｏｄ）ａｎｄ　４３．３％（ｉｎ　Ｅｖａｎｓ　ｂｌｕｅ　ｍｅｔｈｏｄ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｎｏ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＥＣｓ　ａｆｔｅｒ
ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｒｅｃｏｖｅｒｙｉｎｇ　ｆｏｒ　５５ｄａｙｓ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ＡＦＬＰ　ｔｅｓｔ，ｗｈｉｃｈ　ａｌｓｏ　ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ　ｔｈａｔ　ｉｔ　ｉｓ　ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ　ｆｏｒ
ｔｈｅ　ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ｐｒａｅｃｏｘ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ｐｒａｅｃｏｘ；ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ；ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ　ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ；ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓｔａｂｉｌｉｔｙ；ＡＦＬＰ
　　百子莲（Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ｐｒａｅｃｏｘ　ｓｓｐ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）
又称蓝百合，为百子莲科（Ａｇａｐａｎｔｈａｃｅａｅ）百子莲属
（Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ）多年生草本花卉，原产于非洲南部的
亚热带地区。它具有花期长、花朵大而密集、花色别
致多样等观赏特点，被西方国家广泛应用于高档鲜
切花、盆花和沿海公园地被材料，也是除玫瑰花之外
最能表达爱意的爱情花［１］。我国对百子莲的研究起
步较晚，在引种的过程中出现了不易结实的现象，因
此目前主要通过体细胞胚胎发生方法快速繁殖引进
的优良种质资源。但在近几年的试验中发现，百子
莲胚性愈伤组织（ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ，ＥＣｓ）长时间
连续继代在含有高浓度２，４－Ｄ、６－ＢＡ和ＰＩＣ增殖培
养基上会引起细胞胚性丧失或胚胎败育等问题，重
新启动胚性愈伤组织诱导不仅费时、费力，而且可能
会引起体细胞变异。因此，研究建立百子莲胚性愈
伤组织超低温保存（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ）技术体系是
实现其长期离体保存的最佳途径。
超低温保存是指将植物材料在－８０℃甚至更
低的温度下进行中长期离体保存的方法，因为通常
是将植物材料保存在液氮（－１９６℃）中，又称液氮
保存［２］。近二、三十年来，玻璃化法超低温保存
（ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ　ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ）种质资源的
技术得到了很大程度的发展和应用。玻璃化法超低
温保存即指在投入液氮前，用由一定比例的渗透性
和非渗透性保护剂组成的玻璃化溶液 （ｐｌａｎｔ
ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＰＶＳ）处理材料，使之与玻璃
化溶液在足够快的降温速率下过冷到玻璃化转变温
度，最终固化成无定形的玻璃化状态而避免胞内结
冰，并以这种状态在低温下保存的过程。玻璃化超
低温保存方法成功的关键在于冷冻材料进入液氮的
瞬间即固化形成玻璃态，以及解冻时没有再结晶现
象发生，而液氮中贮存时间的长短对冻后植株再生
和细胞遗传的特性几乎没有影响。由于该方法具备
操作简单、冻存率高、重现性好、适应性广等优点，逐
渐成为长期稳定保存植物种质资源的一条重要途
径，并已成功应用于２００多种植物的胎胚、花粉、花
药、种子、愈伤组织、悬浮细胞、原生质体及茎尖、根
尖、腋芽等分生组织的保存［３］。
本文在实验室已有的研究工作基础上，采用单
因素随机区组试验，按照预培养蔗糖浓度、预培养时
间、装载时间、脱水时间的顺序逐步筛选出最优的处
理条件。然后应用多因素、多水平正交试验进一步
检验及优化，建立百子莲胚性愈伤组织玻璃化法超
低温保存体系，并探究超低温保存的关键步骤对于
冻后存活率的影响，最后对于保存前后的百子莲材
料进行遗传稳定性分析以检测该种方法对于百子莲
种质资源超低温保存的适用性。
１　材料与方法
１．１　植物材料
试验材料为‘蓝色大花’百子莲（Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ
ｐｒａｅｃｏｘｓｓｐ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ‘Ｂｉｇ　Ｂｌｕｅ’）胚性愈伤组织。
１．２　试验方法
１．２．１　百子莲胚性愈伤组织诱导及保持
百子莲胚性愈伤组织诱导方法参照范现丽［４］，
并加以优化，诱导率达１００％。以花梗作为外植体
材料，消毒后接种于培养基（ＭＳ＋２．０ｍｇ／Ｌ　ＰＩＣ＋
３％蔗糖＋０．３％植物凝胶）上诱导愈伤组织的形成
（图１）。愈伤组织产生后再转移到胚性愈伤组织增
殖培养基（ＭＳ＋１．５ｍｇ／Ｌ　ＰＩＣ＋３％蔗糖＋０．３％
植物凝胶）上继代培养。
图１　百子莲胚性愈伤组织的诱导
Ｆｉｇ．１　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ　ｏｆ
Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ｐｒａｅｃｏｘ
７７
上 海 交 通 大 学 学 报 （农 业 科 学 版） 第３２卷
１．２．２　百子莲胚性愈伤组织玻璃化法超低温保存
百子莲胚性愈伤组织玻璃化法超低温保存方法
参照吴元玲［５］大苞鞘石斛原球茎超低温保存方法而
建立。
（１）预培养：选取疏松、生长状态良好的百子莲
ＥＣ，分别接种到含０．３、０．５和０．７ｍｏｌ／Ｌ蔗糖的
ＭＳ固体培养基上，在４℃条件下分别暗培养１、２、
３、４ｄ，比较不同预培养蔗糖浓度和时间对百子莲
ＥＣ超低温保存后相对存活率的影响。
（２）装载：将预培养后的百子莲ＥＣ放入２ｍＬ
冻存管中，加入装载液（ＭＳ＋０．４ｍｏｌ／Ｌ蔗糖＋２
ｍｏｌ／Ｌ丙三醇＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＮＯ３），在室温下分别
处理２０、４０、６０、８０ｍｉｎ，比较不同装载时间对百子
莲ＥＣ超低温保存后相对存活率的影响。
（３）脱水：将冻存管中的装载液置换成玻璃化
冷冻保护液ＰＶＳ　２（ＭＳ＋０．４ｍｏｌ／Ｌ蔗糖＋３０％丙
三醇＋１５％乙二醇＋１５％ ＤＭＳＯ），在０℃下脱水
处理２０、４０、６０、８０ｍｉｎ，比较不同脱水时间对百子
莲ＥＣ超低温保存后相对存活率的影响。
（４）快速冷冻与解冻：将冻存管迅速投入液氮
中，１ｈ后于４０℃水浴中快速解冻９０ｓ。
（５）洗涤：在室温下用洗涤液（ＭＳ＋１．２ｍｏｌ／Ｌ
蔗糖＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＮＯ３）洗涤３０ｍｉｎ，每１０ｍｉｎ
更换１次新鲜的洗涤液。
（６）恢复培养：将洗涤处理后的百子莲ＥＣ接
种在恢复培养基（同继代培养基）上，培养２４ｈ后用
于测定细胞相对存活率。
１．２．３　相对存活率检测
（１）氯化三苯四氮唑（ＴＴＣ）染色法：采用ＴＴＣ
法检测细胞相对存活率。称取５０ｍｇ百子莲ＥＣ于
１０ｍＬ离心管中，加入２ｍＬ　０．８％ ＴＴＣ溶液（５０
ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液溶解，ｐＨ７．４），于２５℃避光染
色２０ｈ。除去ＴＴＣ染色液，用无菌水冲洗３次后再
加入５ｍＬ　９５％酒精，于８０℃水浴５０ｍｉｎ。用紫外
分光光度计测定上清液在４８５ｎｍ处吸收值。用吸
光度的比值表示各处理在超低温保存后细胞的相对
存活率。计算公式如下：
相对存活率ＴＴＣ＝（处理样品吸光度值／未处
理样品吸光度值）×１００％
（２）伊文思蓝（Ｅｖａｎｓ　ｂｌｕｅ）染色法：称取５０ｍｇ
百子莲ＥＣ于５ｍＬ离心管中，加入０．５ｍＬ　０．０５％
伊文思蓝溶液，染色３０ｍｉｎ。用３ｍＬ无菌水冲洗４
次后，加入１％ＳＤＳ（十二烷基硫酸钠）溶液２ｍＬ，分
别在液氮和１００℃水浴中反复冻融２次，用紫外分
光光度计测定上清液６００ｎｍ处吸收值。用吸光度
的比值表示各处理在超低温保存后细胞的相对存活
率。计算公式如下：
相对存活率＝（１－处理样品吸光度值／未处理
样品吸光度值）×１００％
１．２．４　多因素正交试验
利用正交设计助手ＩＩ　ｖ３．１，将预培养蔗糖浓度
（０、０．３、０．５、０．７ｍｏｌ／Ｌ）、预培养时间（１、２、３、４ｄ）、
装载时间（２０、４０、６０、８０ｍｉｎ）和脱水时间（２０、４０、
６０、８０ｍｉｎ）设计４因素、４水平正交试验，试验采用
Ｌ１６（４）５正交试验表设计，第５个因素设为空白。冻
后相对成活率通过ＴＴＣ法测定。
１．２．５　遗传稳定性分析
研究采用的 ＡＦＬＰ分子标记实验程序主要参
照张荻［１］。ＡＦＬＰ分子标记技术主要包括以下几个
过程：选用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ／ＭｓｅＩ对目的基因
组ＤＮＡ进行双酶切、连接、预扩增、选择性扩增、变
性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染检测。引物和接头设
计序列见表１。以继代培养２０ｄ后正常生长的百子
莲ＥＣ作为对照，选取经玻璃化法超低温保存后恢
复培养５５ｄ的百子莲ＥＣ（图２）进行遗传稳定性比
较分析。采用改良的ＣＴＡＢ法提取百子莲ＥＣ总
ＤＮＡ，－２０℃保存备用。
图２　超低温保存前后的百子莲胚性愈伤组织
Ａ：继代培养２０ｄ；Ｂ：超低温保存后恢复培养５５ｄ
Ｆｉｇ．２　Ｎｏｎ－ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ　ａｎｄ　ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ
Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ
Ａ：Ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｆｏｒ　２０ｄ；Ｂ：Ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｆｏｒ　５５ｄ
１．３　数据处理与分析
每个试验处理重复３次。采用Ｅｘｃｅｌ软件进
行数据整理和作图，用ＳＡＳ　９．１数据分析软件进
行ＬＳＤ多重比较，相同小写字母代表差异性不显
著，不同小写字母代表具有显著性差异（Ｐ＜
０．０５）。
８７
第５期 陈冠群，等：百子莲胚性愈伤组织玻璃化法超低温保存体系建立及遗传稳定性分析
表１　用于ＡＦＬＰ检验的接头和引物列表
Ｔａｂ．１　Ａｄａｐｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ
接头和引物
Ａｄａｐｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｐｒｉｍｅｒｓ
备注
Ｃｏｍｍｅｎｔｓ
代号
Ｃｏｄｅ
碱基序列
Ｂａｓｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ＥｃｏＲＩ接头 酶切连接 ＥｃｏＲＩ　ａｄａｐｔｏｒ　 ５’ＣＴＣＧＴＡＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣ３’
５’ＰＡＡＴＴＧＧＴＡＣＧＣＡＧＴＣＴＡＣ３’
ＭｓｅＩ接头 酶切连接 ＭｓｅＩ　ａｄａｐｔｏｒ　 ５’ＧＡＣＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧ３’
５’ＰＴＡＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＡＴ３’
ＥｃｏＲＩ－００ 预扩增 Ｅ００　 ５’ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣ３’
ＥｃｏＲＩ－ＡＡＣ 选择性扩增 Ｅ１　 ５’ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣ　ＡＡＣ　３’
ＥｃｏＲＩ－ＡＡＧ　 Ｅ２　 ５’ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣ　ＡＡＧ　３’
ＥｃｏＲＩ－ＡＣＡ　 Ｅ３　 ５’ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣ　ＡＣＡ　３’
ＥｃｏＲＩ－ＡＣＴ　 Ｅ４　 ５’ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣ　ＡＣＴ　３’
ＥｃｏＲＩ－ＡＣＣ　 Ｅ５　 ５’ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣ　ＡＣＣ　３’
ＥｃｏＲＩ－ＡＣＧ　 Ｅ６　 ５’ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣ　ＡＣＧ　３’
ＥｃｏＲＩ－ＡＧＣ　 Ｅ７　 ５’ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣ　ＡＧＣ　３’
ＥｃｏＲＩ－ＡＧＧ　 Ｅ８　 ５’ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣ　ＡＧＧ　３’
ＭｓｅＩ－００ 预扩增 Ｍ００　 ５’ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡ３’
ＭｓｅＩ－ＣＡＡ 选择性扩增 Ｍ１　 ５’ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡ　ＣＡＡ　３’
ＭｓｅＩ－ＣＡＣ　 Ｍ２　 ５’ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡ　ＣＡＣ　３’
ＭｓｅＩ－ＣＡＧ　 Ｍ３　 ５’ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡ　ＣＡＧ　３’
ＭｓｅＩ－ＣＡＴ　 Ｍ４　 ５’ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡ　ＣＡＴ　３’
ＭｓｅＩ－ＣＴＡ　 Ｍ５　 ５’ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡ　ＣＴＡ　３’
ＭｓｅＩ－ＣＴＣ　 Ｍ６　 ５’ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡ　ＣＴＣ　３’
ＭｓｅＩ－ＣＴＧ　 Ｍ７　 ５’ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡ　ＣＴＧ　３’
ＭｓｅＩ－ＣＴＴ　 Ｍ８　 ５’ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡ　ＣＴＴ　３’
２　结果与分析
２．１　预培养蔗糖浓度和时间对百子莲ＥＣ超低温
保存后相对存活率的影响
预培养的目的是提高愈伤组织抗冻力，减少或
避免冷冻伤害［６－７］。本研究采用的是低温－高渗预
培养方法。ＴＴＣ染色法和Ｅｖａｎｓ　ｂｌｕｅ染色法检测
结果（图３）均显示经过蔗糖预培养后的百子莲ＥＣ
超低温保存后相对存活率比对照高，且随着预处理
中蔗糖浓度的增加，相对成活率逐渐上升，其中０．５
ｍｏｌ／Ｌ蔗糖预处理后的百子莲ＥＣ超低温保存后相
对存活率最高，分别为２５．５％（ＴＴＣ法）和２４．８％
（Ｅｖａｎｓ　ｂｌｕｅ法）；当蔗糖浓度提高至０．７ｍｏｌ／Ｌ时，
细胞相对成活率反而下降至５．７％（ＴＴＣ法）和
５．２％（Ｅｖａｎｓ　ｂｌｕｅ法），表明０．５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖预培养
有利于百子莲ＥＣ的超低温保存。
不同的预培养时间对百子莲ＥＣ超低温保存后
相对存活率也有较大影响（图３）。预培养１～３ｄ后
其相对存活率较高，但无显著性差异；当预培养４ｄ
后，百子莲ＥＣ的相对存活率则明显下降至１０．６％
（ＴＴＣ法）和９．５％（Ｅｖａｎｓ　ｂｌｕｅ法）。以上结果说明
百子莲ＥＣ的预培养处理适宜时间是１～３ｄ，其中２
ｄ为最佳时间，相对成活率分别为２５．５％（ＴＴＣ法）
和２４．８％（Ｅｖａｎｓ　ｂｌｕｅ法）。
２．２　装载时间对百子莲ＥＣ超低温保存后相对存
活率的影响
由图４可以看出，随着装载处理时间的延长，百
子莲ＥＣ相对存活率显著提高，其中处理６０ｍｉｎ时
相对存活率最大，ＴＴＣ法和Ｅｖａｎｓ　ｂｌｕｅ法检测结果
分别为５６．９％和４３．３％；但处理８０ｍｉｎ后，其相对
存活率反而下降。以上结果说明装载６０ｍｉｎ最有
利于百子莲ＥＣ超低温保存。
９７
上 海 交 通 大 学 学 报 （农 业 科 学 版） 第３２卷
图３　不同预培养蔗糖浓度及时间对百子莲ＥＣ超低温保存后相对存活率的影响
Ｆｉｇ．３　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｓｕｃｒｏｓｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｉｍｅｓ　ｆｏｒ　Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅｓ
图４　不同装载时间对百子莲ＥＣ超低温保存后
相对存活率的影响
Ｆｉｇ．４　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｏｓｍｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅｓ　ｆｏｒ　Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ
ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅｓ
２．３　脱水时间对百子莲ＥＣ超低温保存后相对存
活率的影响
脱水是超低温保存过程中的关键步骤之一。
ＰＶＳ　２溶液处理时间对百子莲ＥＣ超低温保存后相
对存活率有很大影响（图５）。当脱水处理４０ｍｉｎ
后，百子莲ＥＣ相对存活率最高，ＴＴＣ法和Ｅｖａｎｓ
ｂｌｕｅ法检测结果分别为５６．９％和４３．３％；若脱水时
间超过４０ｍｉｎ，由于ＰＶＳ　２中含有高浓度的蔗糖和
ＤＳＭＯ，会对细胞产生严重的脱水胁迫和离子毒害，
使其相对存活率显著下降，甚至导致细胞死亡。
２．４　不同因素对百子莲ＥＣ超低温保存后相对成
活率的交互作用
尽管单因素随机区组试验设计能够筛选出同一
因素下多个水平对百子莲ＥＣ超低温保存后相对存
活率的差异，但却无法确定不同因素下不同水平之
间对百子莲ＥＣ超低温保存后相对存活率的交互作
用。因此，通过多因素、多水平正交试验可以明确不
同因素对百子莲ＥＣ超低温保存后相对成活率的影
图５　不同脱水时间对百子莲ＥＣ超低温保存后
相对存活率的影响
Ｆｉｇ．５　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅｓ　ｆｏｒ　Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ
ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅｓ
响，并筛选出理论上的最优配比组合。从表２中可
以看出，由于各个因素的极差不同，对百子莲ＥＣ超
低温保存后相对存活率影响因素大小依次为脱水时
间＞装载时间＞预培养蔗糖浓度＞预培养时间；根
据Ｋ值的不同，不同水平间最优组合为预培养蔗糖
浓度为０．５ｍｏｌ／Ｌ、预培养时间为４ｄ，装载时间为
６０ｍｉｎ，脱水时间为６０ｍｉｎ。经过对多因素、多水平
正交试验筛选出的最优组合进行超低温保存试验验
证发现，百子莲ＥＣ实际的相对存活率（ＴＴＣ值）为
４２．９７％，反而比单因素随机试验筛选出的超低温保
存体系的相对存活率低２４．５％，这可能与百子莲
ＥＣ本身的生长特性和状态有关。
２．５　遗传稳定性检测
应用 ＡＦＬＰ分子标记技术对超低温保存前后
的百子莲ＥＣ进行遗传稳定性检测分析，８对引物共
扩增出可统计条带３　０８６条，其中有６条差异条带，
变异率为０．２％（图６）。以上结果说明对照与超低
温处理样品之间基因组序列基本保持一致。
０８
第５期 陈冠群，等：百子莲胚性愈伤组织玻璃化法超低温保存体系建立及遗传稳定性分析
表２　正交试验设计和结果
Ｔａｂ．２　Ｔｈｅ　ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ
试验处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
预培养蔗糖浓度
／（ｍｏｌ·Ｌ－１）
Ｓｕｃｒｏｓｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
预培养时间／ｄ
Ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｉｍｅｓ
装载时间／ｍｉｎ
Ｏｓｍｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅｓ
脱水时间／ｍｉｎ
Ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅｓ
空白列
Ｂｌａｎｋ
细胞存活率／％
（平均值±标准误）
Ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅ
１　 ０．０　 １　 ２０　 ２０　 １　 ３．１８±０．０１ｆｇ
２　 ０．０　 ２　 ４０　 ４０　 ２　 ７．６０±０．０１ｆ
３　 ０．０　 ３　 ６０　 ６０　 ３　 ２６．４８±０．０１ｂ
４　 ０．０　 ４　 ８０　 ８０　 ４　 １８．５６±０．０７ｄ
５　 ０．３　 １　 ４０　 ６０　 ４　 ２５．０１±０．０４ｂｃ
６　 ０．３　 ２　 ２０　 ８０　 ３　 １２．６６±０．０２ｅ
７　 ０．３　 ３　 ８０　 ２０　 ２　 ５．４０±０．０２ｆｇ
８　 ０．３　 ４　 ６０　 ４０　 １　 ２０．９０±０．０６ｃｄ
９　 ０．５　 １　 ６０　 ８０　 ２　 ３６．３０±０．０４ａ
１０　 ０．５　 ２　 ８０　 ６０　 １　 ３５．２８±０．０３ａ
１１　 ０．５　 ３　 ２０　 ４０　 ４　 １６．２５±０．０４ｄｅ
１２　 ０．５　 ４　 ４０　 ２０　 ３　 ６．４８±０．０１ｆｇ
１３　 ０．７　 １　 ８０　 ４０　 ３　 ２．４７±０．０１ｇ
１４　 ０．７　 ２　 ６０　 ２０　 ４　 １２．４５±０．０１ｅ
１５　 ０．７　 ３　 ４０　 ８０　 １　 ２．２８±０．０１ｇ
１６　 ０．７　 ４　 ２０　 ６０　 ２　 ２６．８０±０．００ｂ
Ｋ１ ５５．８２　 ６６．９６　 ５８．８９　 ２７．５１　 ６１．６４
Ｋ２ ６３．９７　 ６７．９９　 ４１．５６　 ４７．２２　 ７６．１
Ｋ３ ９４．３１　 ５０．４１　 ９６．１３　 １１３．５７　 ４８．０９
Ｋ４ ４４．００　 ７２．７４　 ６１．７１　 ６９．８　 ７２．２７
ｋ１ １３．９６　 １６．７４　 １４．７２　 ６．８８　 １５．４１
ｋ２ １５．９９　 １７．００　 １０．３９　 １１．８１　 １９．０２
ｋ３ ２３．５８　 １２．６０　 ２４．０３　 ２８．３９　 １２．０２
ｋ４ １１．００　 １８．１９　 １５．４３　 １７．４５　 １８．０７
极差 １２．５８　 ５．５９　 １３．６４　 ２１．５１　 ７．００
最优组合 ０．５　 ４　 ６０　 ６０　 ４２．９７±０．０２
３　讨论
玻璃化法超低温保存是目前发展较快、应用较
广的一种超低温保存新技术，已经成为一种较为理
想的长期保存植物种质资源的方法［８］。玻璃化法超
低温保存步骤包括预培养、装载、脱水、快速冷冻、快
速解冻、洗涤和恢复培养［９］，因而，影响玻璃化法超
低温保存效果的因素很多，如保存材料的特性、细胞
状态等。胚性愈伤组织细胞较小、细胞核大、原生质
浓厚、无液泡，常富含淀粉粒，且分化能力强，非常适
合作为玻璃化法超低温保存的材料［１０］，其中冷冻前
的处理对材料的成活率影响较大。
３．１　适当的超低温保存方法对于提高百子莲冻后
存活率至关重要
一些研究表明，保存材料的生理状态对保存效
果的影响甚至比其他因素更重要［１１］，而预培养是改
善材料生理状态、提高超低温保存后成活率的有效
手段［１２］。众所周知，预培养（高渗培养和低温锻炼）
的主要目的是减少细胞内自由水含量，增强细胞
１８
上 海 交 通 大 学 学 报 （农 业 科 学 版） 第３２卷
图６　超低温保存前后百子莲ＥＣ基因组ＤＮＡ聚丙烯酰胺凝胶图谱
奇数条带为超低温保存前样品，偶数条带为超低温保存后样品。
Ｆｉｇ．６　Ｐｒｏｆｉｌｅｓ　ｏｆ　ＡＦＬＰ　ｉｎ　Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
Ｎｏｎ－ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｏｄｄ　ｎｕｍｂｅｒ　ｌａｄｄｅｒｓ，ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｅｖｅｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ｌａｄｄｅｒｓ
的抗寒力［１３］。一般来说，高渗培养主要是向培养基
中添加高渗透性物质作为保护物质，由于蔗糖对于
提高植物组织的抗寒性有着重要的作用［１４］，因此一
般添加浓度为０．１～１．０ｍｏｌ／Ｌ的蔗糖［１５］进行预培
养；低温锻炼一般是在２～５℃进行培养，因为在这
个温度范围内植物材料具有较好的内在适应机
制［１６］。本试验结合两种预培养方法，采用低温－高
渗的方法将百子莲ＥＣ接种到含有０．５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖
的 ＭＳ培养基中，４℃冰箱中预培养２ｄ，发现保存
效果较好。
装载即脱水预处理是脱水前必不可少的一步，
一般装载液的浓度为６０％ＰＶＳ　２溶液，以诱导细胞
对渗透胁迫产生一定的适应性［１７］；此外，装载液处
理的时间对于冻后相对存活率也有很大的影响，过
短或过长都会对材料造成伤害而降低成活率。本研
究发现百子莲ＥＣ在室温下装载液处理６０ｍｉｎ后，
相对成活率最高。玻璃化法超低温保存植物最关键
的步骤就是玻璃化保护剂ＰＶＳ　２的脱水处理，而最
重要的环节就在于严格控制植物材料的脱水时间。
脱水时间取决于材料的特性，包括植物的基因型、抗
冻性及细胞的年龄、生理状态等［１８］。由于玻璃化溶
液中含有较高浓度的ＤＭＳＯ和蔗糖，处理时间较短
可能无法使自由水完全渗透到细胞中，导致投入液
氮后产生大的冰晶颗粒伤害细胞；若处理时间过长，
会产生离子毒害和过度脱水，直接引起细胞活性降
低甚至死亡。因此，合适的脱水时间要根据不同植
物细胞膜特性、细胞大小、细胞的脱水耐受性及保护
剂的渗透性等多种因素综合考虑。就已有的报道来
看，不同材料的最佳处理时间相差很大，白芨
（Ｂｌｅｔｉｌｌａ　ｓｔｒｉａｔａ）合子胚在ＰＶＳ　２中最佳脱水时间
是３ｈ［１９］，玉米（Ｍａｉｚｅ）愈伤组织的最佳脱水时间为
４０ｍｉｎ［２０］。从本试验结果来看，在０℃下将百子莲
ＥＣ在玻璃化溶液ＰＶＳ　２中处理４０ｍｉｎ达到较好
的效果，保存后细胞的相对存活率达到了５６．９％
（ＴＴＣ法）和４３．３％（Ｅｖａｎｓ　ｂｌｕｅ法）。
３．２　多因素、多水平正交试验结果验证了单因素随
机区组实验结果
由于在超低温保存过程中，影响植物材料冻后
相对存活率的因素很多，并且存在相互作用，因此可
通过多因素、多水平正交试验的方法明确各个关键
因素间的交互作用。试验结果表明，在超低温保存
过程中脱水时间对于冻后相对成活率影响最大，装
载时间和预培养蔗糖浓度的影响次之，而预培养时
间则是对冻后相对成活率影响最弱的因素。多因
素、多水平正交试验结果与单因素随机区组试验结
果基本一致，但是稍有不同之处在于预培养的时间
及脱水时间。在百子莲ＥＣ超低温保存的实际操作
中，预培养２ｄ后胚性愈伤组织的状态与正常继代
的相近，而预培养４ｄ后则明显下降，甚至部分出现
褐化的现象，这可能是由于百子莲是热带植物，其
ＥＣ对于低温比较敏感的缘故。脱水时间的筛选结
果不同可能是由于百子莲ＥＣ自身的生长特性及继
２８
第５期 陈冠群，等：百子莲胚性愈伤组织玻璃化法超低温保存体系建立及遗传稳定性分析
代培养过程中分化程度不一致而引起的。因此，多
因素、多水平正交试验的结果也辅助证明了此为最
优的百子莲ＥＣ超低温保存体系。
３．３　ＴＴＣ法与Ｅｖａｎｓ　ｂｌｕｅ法在检测植物细胞活性
中可以相互印证、补充
从图２中可观察到，超低温保存后恢复培养５５
ｄ的百子莲ＥＣ呈现淡黄色的颗粒状，表层细胞半
透明，并且增殖迅速，证明了这一保存体系的可靠
性。由于直接观察冻后材料的恢复生长率耗时较
长，因此在超低温保存后可通过细胞染色的方法检
测冻后细胞的活性。目前常用的检测细胞活性的方
法有ＴＴＣ法、ＦＤＡ法、Ｅｖａｎｓ　ｂｌｕｅ法等。本文主要
对比分析了ＴＴＣ法和Ｅｖａｎｓ　ｂｌｕｅ法两种定量分析
方法的差异。ＴＴＣ法主要应用于植物种子、细胞活
性的检测，而Ｅｖａｎｓ　ｂｌｕｅ法则多应用于动物细胞活
性检测。刘楠等对比了不同胁迫处理的拟南芥
（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）叶片的Ｅｖａｎｓ　ｂｌｕｅ染色照
片和定量测定结果，表明Ｅｖａｎｓ　ｂｌｕｅ染色法是一种
安全、准确地检测植物细胞活性的方法［２１］。本研究
结果表明ＴＴＣ法与Ｅｖａｎｓ　ｂｌｕｅ法的定量测定结果
趋于一致，在检测植物细胞活性中可以相互印证、
补充。
３．４　玻璃化法超低温保存可以保持冻存材料的遗
传稳定性
植物种质资源保存方法要求保存材料的遗传稳
定性，否则保存就失去了意义。ＡＦＬＰ技术是检测
ＤＮＡ多态性常用的技术，应用该方法进行超低温
保存前后的遗传稳定性检测结果表明，超低温保存
过程没有对百子莲 ＥＣ 基因组造成变异。这与
Ｓｈａｎｅ等［２２］、朱文涛等［２３］和郝玉金等［２４］在袋鼠花
（Ａｎｉｇｏｚａｎｔｈｏｓ　ｖｉｒｉｄｉｓ）、五 叶 草 莓 （Ｄｒａｇａｒｉａ
ｐｅｎｔａｐｈｙ）、苹果（Ｍａｌｕｓ　ｐｕｍｉｌａ　Ｍｉｌ．）种质资源上
的研究结果相似，证明玻璃化法超低温保存是长期
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（下转第９４页）
３８
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Ｒｉｖｅｒ，
櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅
２００３．
（上接第８３页）
［１９］　Ｉｓｈｉｋａｗａ　Ｋ，Ｈａｒａｔａ　Ｋ，Ｍｉ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ
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櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅
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ｃｒｏｂｉｏｌ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ，１９９９，２２（１）：４１－６１．
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ｂｉｌｉｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　ｉｎ　ｏｕｔｂｒｅｄ　ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｃｏｍｐ
Ｍｅｄ，２００４，５４（５）：５７１－５７７．
［９］　Ｗｈａｒｙ　Ｍ　Ｔ，Ｆｏｘ　Ｊ　Ｇ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｒｅ－
ｓｅａｒｃｈ　ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｌａｂｏｒａ－
ｔｏｒｙ　ｒｏｄｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｌａｂ　Ａｎｉｍａｌ，２００６，３５（７）：２５－３６．
４９