全 文 ：文章编号:1004-2490(2011)02-0172-09
孔石莼在干出胁迫下上调表达基因
消减 cDNA文库的构建及分析
　　收稿日期:2011-01-11
基金项目:中国科学院实验海洋生物学重点实验室开放基金资助项目
作者简介:李世国(1982-),男 , 辽宁沈阳人 ,汉族 , 博士研究生 ,从事海藻发育与分子生物学研究。 E-mail:Shigli@
126.com
通讯作者:侯和胜.Tel:0411-82159112, E-mail:Hesheng hou@126.com
李世国 , 杨　帆 , 吴倩倩 , 乔　坤 , 佟少明 , 侯和胜
(辽宁师范大学生命科学学院 , 辽宁省植物生物技术重点实验室 , 大连　116029)
摘　要:利用抑制消减杂交技术构建了潮间带绿藻孔石莼(Ulvapertusa)在干出胁迫状态下上调表达基因的
消减 cDNA文库。获得的阳性克隆经测序得到 150条上调表达的 EST片段 , 其中 21条为冗余序列(RS), 137
条非冗余序列(NRS)。片段中最长 833 bp,最短 106bp, 平均长度 364 bp。 参与比对的 EST片段按照其注释
功能可分类为:细胞生长与发育 、蛋白合成与分解 、代谢过程 、胁迫应答 、光合作用与光诱导 、转录调节 、信号转
导等相关基因。未知功能和无对比结果序列共 60条 , 占非冗余序列的 43.80%。比对相似度主要分布在
20% ～ 60%之间 ,主要与已经完成基因组测序的藻类或高等植物的氨基酸序列具有较高的相似性。孔石莼对
密码子第三位碱基的使用偏好无显著差别(P>0.05), GC使用总频率为 50.66%, 而对终止密码子则明显偏
好 TGA。实时荧光定量结果表明 , 部分分离的基因在干出胁迫状态下表达量上调。 这些不同功能基因的表
达构成了复杂的调控网络 ,能够为揭示孔石莼抵御潮间带不良环境的分子机制提供多方面的切入点。
关键词:孔石莼;潮间带;干出状态;抑制消减杂交;cDNA文库
中图分类号:Q786　　　文献标识码:A
ConstructionandanalysisofsubtractivecDNAlibraryof
up-regulatedgenesfromUlvapertusaunderemersedstress
LIShi-guo, YANGFan, WUQian-qian, QIAOKun, TONGShao-ming, HOUHe-sheng
(ColegeofLifeSciences, LiaoningNormalUniversity, KeyLaboratoryof
PlantBiotechnologyofLiaoningProvince, Dalian　116029, China)
Abstract:ThesubtractivecDNAlibraryofup-regulatedgenesfromUlvapertusaunderemersedstresswas
constructedbysuppresionsubtractivehybridization(SSH)technology.150 ESTfragmentsofup-regulated
geneswereisolatedaftersequencingthepositiveclones, inwhich21 fragmentswereredundant(RS)and
other137fragmentswerenon-redundantsequences(NRS).PCRanalysisindicatedthatthelengthoftheEST
insertswereintherangeof100 to900 bp.Thelongestwas833 bp, andtheshortestwas106 bpandthe
averagelengthwas364 bp.Basedonthefunctionalsimilaritywithhomologousgenesinalgaeandhigher
plants, theESTfragmentscouldbedividedintoseveralfunctions:celgrowthanddevelopment, protein
DOI :10.13233/j.cnki.mar.fi sh.2011.02.010
第 2期 李世国等:孔石莼在干出胁迫下上调表达基因消减 cDNA文库的构建及分析
synthesisanddegradation, metabolism, stressresponse, photosynthesisandphotoinduction, transcription
regulationandsignaltransduction.60sequenceswithunknownfunctionsornocomparativeresultsaccounted
for43.80% oftotalnon-redundantsequences.Thecomparisonsimilarityvaluesweredistributedbetween20%
and60% andthesequenceshadhighersimilaritywiththeaminoacidsequencesofalgaeandhigherplants
whosegenomesequencinghadbeencompleted.Nocontigsbutwholesingletonsrepresentedinthepredicted
ESTfragmentswiththesamefunction.Itwasshownthatthecodonusageinthethirdcodonposition
showednosignificantdiference(P>0.05)inU.pertusaandtheGCfrequencyofcodonusagewas50.
66% ofthetotal.ThestopcodonusagepreferredTGAespecialy.Real-timefluorescencequantitative
PCRdemonstratedthattherelativeexpressionabundanceofpartialgeneswasisolatedfromthelibraryup-
regulatedatmRNAlevel.Theexpressionofthesediferentgenesconstitutedacomplexregulatory
network, andwouldprovidewiderangeentrypointstodemonstratethemechanismofstresstolerancefor
U.pertusaemersedinintertidalzone.
Keywords:Ulvapertusa;Intertidalzone;Emersedstate;Suppressionsubtractivehybridization(SSH);
cDNAlibrary
　　潮间带作为海洋生态系统的重要组成部分 ,在海洋潮汐节律性交替的过程中环境变化十分剧烈。
低潮干出是潮间带大型海藻必须忍耐的一种非生物胁迫 ,这种胁迫并不是某一单一环境条件的作用 ,而
是盐度 、温度 、离子浓度 、光照强度 、渗透压等众多影响因素共同构成的复杂胁迫体系 。潮间带海藻在漫
长的进化历史过程中 ,逐步适应了这种胁迫环境的变化节奏 ,产生了一系列可以抵御上述不良环境的生
理和分子机制。孔石莼(Ulvapertusa)是潮间带植被生态分布中占据着优势地位的海藻 ,广泛生长在太
平洋沿岸海域的中 、低潮带的岩石和石沼上 ,具有食用 、药用和工业生产等多种应用价值 [ 1] ,是海岸带
生态系统的重要海藻物种 ,对于涨潮时的海水淹没和退潮时的干出状态具有很强的适应性 。对于羊栖
菜(Sargasumfusiforme)、石莼(Ulvalactuca)、坛紫菜(Porphyrahaitanensis)等一些典型的经济海藻在干
出状态下藻体的生长发育 、光合作用等生理生化过程已经进行了系列研究[ 2-4] 。 Person等[ 5]构建了在
模拟干出条件下 (高温及干旱脱水)2种墨角藻 (Fucusserratus和 Fucusvesiculosus)差异表达基因的
cDNA文库 ,分离鉴定了多种胁迫后上调表达的相关基因。
抑制消减杂交(Suppressionsubtractivehybridization, SSH)是由 Diatchenko等 [ 6]于 1996年以 mRNA
差别显示技术为基础建立起来的筛选未知差异表达基因的新技术 ,具有效率高 、假阳性率低 、敏感程度
高等优点 ,能够分离出丰度较低的基因。利用此技术 ,科研工作者分别构建了杜氏盐藻 (Dunaliela
salina)[ 7] 、条斑紫菜(Porphyrayezoensis)[ 8-9] 、龙须菜(Gracilariopsislemaneiformis)[ 10] 、海带(Laminaria
japonica)[ 11] 、坛紫菜 [ 12]和三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)[ 13]等不同海藻特异表达基因的消减
文库 ,分离得到了大量在海藻中差异表达的基因并对这些基因的序列特点及功能进行了初步的分析 ,进
一步证明了 SSH技术在海藻研究领域的有效性。
实验选用孔石莼为材料 ,在室内进行干出胁迫处理 ,利用 SSH技术分离胁迫诱导后上调表达的基
因 ,并对构建的基因文库进行了初步检验和分析。期望通过对这些基因的分离与功能鉴定能够为阐释
潮间带海藻耐受不良环境胁迫的调控网络和分子机制提供一定的理论依据 。
1　材料与方法
1.1　孔石莼采集与胁迫处理
孔石莼于大潮时采集自大连付家庄海域的礁石上 ,取个体完整并淹没于海水中的藻体 ,盛于采集箱
中立即运回实验室。采集地点海水表面温度 5±1℃,盐度 35±1。在下述条件的光照培养箱中预培养
10 d:光照强度 100μmol/m2·s、温度 5±1℃、光周期 12∶12h(L∶D)、灭菌海水中通气培养 ,每天全量更
换海水 。实验时用灭菌海水清洗藻体表面去除杂质 ,平铺在直径 90 mm的灭菌培养皿中 ,置于光
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海　洋　渔　业 2011年
照培养箱中进行干出胁迫处理:光照强度 100μmol/m2·s、温度 15±1 ℃、光周期 12 h∶12 h(L∶D)。由
于孔石莼主要分布在潮间带中 、低潮带附近的岩石上或石沼中 ,因此推测其在自然条件下每天暴露于空
气中的时间大约在 6h左右 ,所以收集材料的时间点选择分别在处理后 0.5、1、2、4、6 h,样品立即置于
研钵中用液氮研磨成粉末 , -80 ℃冰箱保存。采用预培养的新鲜藻体作为未处理的对照样品 。
1.2　实验方法
1.2.1　总 RNA提取与 mRNA分离
将研磨好的孔石莼样品按照 QIAGEN公司的 RNeasyPlantMiniKit流程提取总 RNA,混合所有提取
的总 RNA,利用 TAKARA公司的 OligotexTM-dT30(Super)mRNAPurificationKit分离 mRNA,方法依据
说明书进行 。 1%琼脂糖凝胶电泳分析所分离的总 RNA和 mRNA的完整性 ,紫外分光光度计检测其浓
度及纯度 ,并调整 mRNA浓度至后续实验所需用量。
1.2.2　抑制消减杂交
根据 CLONTECH公司 PCR-SelectTM cDNA试剂盒方法 , 以干出胁迫处理后孔石莼叶片分离的
mRNA为检测方 ,对照样品 mRNA为对照方进行抑制消减杂交反应 。正向消减 PCR产物克隆入 pGEM-
TEasy载体(PROMEGA),转化至大肠杆菌 DH5α感受态细胞(TAKARA), 构建 cDNA消减文库。
1.2.3　阳性克隆的筛选 、测序及获得基因片段的比对分析
挑取构建的正向消减文库中的阳性克隆 ,摇菌后进行菌液 PCR检测 , 1%琼脂糖凝胶电泳确定插入
片段大小。去除假阳性结果 ,将含有插入 EST片段的 160份菌液送北京华大基因科技股份有限公司测
序 。测序结果用 DNAMAN软件寻找扩增引物去除低质量序列 ,统计冗余序列 (Redundantsequence,
NR)和非冗余序列(Non-redundantsequence, NRS)、重叠群(Contigs)、独立 EST序列(Singletons)的数
量;Vecscreen在线功能去除载体序列 (htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html);
Blast2go软件与 NCBI的 Blastx(htp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)相结合进行序列相似性比对 ,
确定基因的功能及其分类;CodonW软件分析部分序列的密码子使用频率及 GC含量。
1.2.4　实时荧光定量分析部分基因的相对表达量
选取文库中获得的 lhcp和 pcs两条 EST片段为模板进行实时荧光定量(Real-timePCR, RT-PCR)反
应 ,检测在干出胁迫前后基因 mRNA水平相对表达量的变化 。以孔石莼 β-Tubulin为内标基因 ,干出胁
迫处理后混合材料的 cDNA为模板 ,未处理样品的 cDNA为对照模板。所用引物序列如下:UpTubulin-
1:CAATGTGCAGAACAAGAACTCGTCC, UpTubulin-2:TTGCTCAGACACACGCTTGAACATC;Uplhcp-1:
AACTGGGAAGGTAACATTGACGG, Uplhcp-2: CATCCCTGAGTGTGAAAGTTCCC; Uppds-1:
CGGACAGCACTGTGAAGCACC, Uppds-2:TTGAAGAAAGCCATCTTTGACCAT。RT-PCR反应在 TAKARA
公司 ThermalCyclerDice· RealTimeSystem(TP-800)实时荧光定量 PCR仪上进行 ,体系及反应条件:10
μLSYBRGreenPCRMasterMix、上下游引物各 0.8 μL(10μmol/L)、2μL模板 , 6.4μLRNasefreeH2O
至 20μL。 95 ℃ 10 s, 95℃ 5s, 60℃ 30s, 40个循环;95℃ 15s, 60℃ 60s, 95℃ 15s。所得的数据利
用 2-■■Ct法 [ 14]计算相对表达量 ,并分析差异显著情况 。
2　结果与分析
2.1　消减 cDNA文库的构建
利用 RNeasyPlantMiniKit方法提取的孔石莼总 RNA虽含有部分基因组 DNA,但经消化处理后可
以将其全部去除 。处理后总 RNA的 28s和 18s条带清晰可辨 ,无蛋白质等杂质污染 ,分离的 mRNA浓
度和纯度较高 ,能够满足建库的质量要求(图 1, A和 B)。正向消减杂交产物电泳后呈弥散状态 ,条带
大小位于 250 ～ 2 000bp之间 ,主要集中在 300 ～ 1 000bp范围(图 1, C-2)。转化感受态细胞 DH5α,蓝
白斑筛选共获得约 1 000个阳性菌斑 。经 PCR鉴定 ,插入片段大小位于 250 ～ 1 000 bp之间(图 1, D),
从中随机选取 160个阳性克隆进行测序。抑制消减杂交技术利用四碱基的限制性内切酶酶切反转录
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第 2期 李世国等:孔石莼在干出胁迫下上调表达基因消减 cDNA文库的构建及分析
图 1　孔石莼干出胁迫消减文库琼脂糖凝胶电泳
Fig.1　Agarosegelelectrophoresisofsubtractive
cDNAlibraryconstructedfromUlvapertusa
underemersedstress
A:总 RNA(1:干出处理材料;2:未处理材料);B:干出处理材料
mRNA;C:抑制消减杂交 cDNA文库(2:正向消减文库);D:菌液
PCR;M:DL2000Marker
A:TotalRNA(1:Materialsunderemersedstress;2:Control);B:
mRNAofemersedstressmaterials;C:SSHcDNAlibrary(2:
ForwardsubtractivecDNAlibrary);D:BacterialPCR;M:DL2000
marker
而来的 cDNA,使得片段大小集中在 600 bp左右 ,
从而能够提高扩增产物的代表性 , 实验中所得的
结果符合这一特性 。
2.2　消减文库基本信息分析
测序结果共得到可利用的 EST片段 150条 ,占
总测序样品的 93.8%。其中 21条为冗余序列
(RS),拼接冗余部分后得到共 137条非冗余序列
(NRS),且全部为独立 EST序列(Singletons)。结合
软件分析与比对结果可知 ,片段长度集中在 100 ～
900bp之间 ,其中最长 833 bp,最短 106 bp,平均长
度 364bp(图 2, A),总体 E值大于 1e-95(图 2, B)。
与已知功能蛋白的氨基酸序列相似度均大于 20%,
主要集中在 20% ～ 60%之间 ,这一范围内的 EST片
段占总数的 67%(图 2, C)。参与比对的 EST片段
按其功能注释可分为以下几大类:细胞生长与发育
相关 ,占 22.63%;蛋白合成与分解相关 ,占 5.84%;
代谢相关 ,占 7.30%;胁迫相关 ,占 5.11%;光合作
用与光诱导相关 , 占 5.11%;转录调节相关 , 占
3.65%;信号转导相关 ,占 6.57%;未知功能 ,占 24.09%;无对比结果 ,占 19.71%(图 2, D)。不能确定
功能的 EST片段占到非冗余序列总数的 43.80%。 22条 EST序列的功能比对结果见表 1,主要与已经
完成基因组测序的藻类或高等植物的氨基酸序列具有较高的相似性。
图 2　消减 cDNA文库比对结果分析
Fig.2　BlastresultsanalysisofsubtractivecDNAlibrary
A:序列长度;B:E值分布;C:相似度分布;D:功能分类
A:Sequencelength;B:Evalue;C:Similarity;D:Functionalclassification
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海　洋　渔　业 2011年
表 1　部分 EST序列功能比对结果
Tab.1　FunctionalblastresultsofpartialESTsequences
序列编号
No.
长度(bp)
Length
同源比对
Homologcomparison
相似度(%)
Similarity
相似物种
Similarspecies
1 225
细胞周期蛋白 B
B-typecyclin 38
杨树
Populustomentosa
2 179
质体 ADP/ATP转位酶
PlastidicADP/ATPtranslocase 86
莱茵衣藻
C.reinhardti
3 364
胡萝卜素合成相关蛋白
Carotenebiosynthesis-relatedprotein, cbr 86
裂片石莼
Ulvafasciata
4 700
八氢番茄红素脱氢酶
Phytoenedesaturase, pds 78
雨生红球藻
Haematococcuspluvialis
5 441
细胞分裂控制蛋白
Celdivisioncontrolprotein 34
玉米
Zeamays
6 181
集体蛋白
Basalbodyprotein 68
莱茵衣藻
C.reinhardti
7 294
谷胱甘肽硫转移酶
GlutathioneS-transferases, gst 37
单细胞绿藻
Ostreococcustauri
8 469
捕光叶绿素 a/b结合蛋白
Chlorophyla/bbindingprotein, lhcp 86
碟状藻
Acetabulariaacetabulum
9 560
胁迫相关叶绿素 a/b结合蛋白
StressrelatedChlorophyla/bbindingprotein, srcp 60
莱茵衣藻
C.reinhardti
10 377
微管蛋白
Beta-tubulin 96
莱茵衣藻
C.reinhardti
11 458
内膜转位酶
innermembranetranslocase 37
单细胞绿藻
Ostreococcuslucimarinus
12 354
14-3-3蛋白
14-3-3-likeprotein, 1433s 73
杜氏盐藻
D.salina
13 453
丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶
Serine/threonine-proteinkinase, stpk 62
拟南芥
Arabidopsisthaliana
14 311
渗透胁迫活化的蛋白激酶 /盐诱导蛋白激酶基因
Osmoticstress-activatedproteinkinase/salt-inducible
proteinkinase, osak/sapk
46
烟草
Nicotianatabacum
15 301
TATA-box结合蛋白
TATAbox-bindingprotein 57
水稻
Oryzasativa
16 272
叶绿体甘油醛三磷酸脱氢酶
Chloroplastglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase 81
莱茵衣藻
C.reinhardti
17 391
ATP合酶
ATPsynthasesubunitbeta 76
莱茵衣藻
C.reinhardti
18 318
帕金共同调节基因
Parkin-co-regulatedgene 85
莱茵衣藻
C.reinhardti
19 590
钙调蛋白结合蛋白
Calmodulinbindingprotein 90
烟草
N.tabacum
20 608
ATP依赖性 RNA解旋酶
DEAD-boxATP-dependentRNAhelicase36 55
水稻
O.sativa
21 364
早期光诱导蛋白
Earlylight-inducedprotein, elp 31
玉米
Z.mays
22 255
GTP结合蛋白
GTP-bindingprotein 73
玉米
Z.mays
2.3　部分基因在干出胁迫前后的相对表达量变化
如图 3所示 ,在干出胁迫处理前后 ,孔石莼 pds和 lhcp基因 mRNA水平的相对表达量均表现出上调
趋势 ,其中 pds基因在胁迫后的表达量为对照样品中的 2.11倍 , lhcp基因在胁迫后的表达量为对照样品
中的 1.25倍 。RT-PCR检测的结果进一步证实了该文库构建的准确性 ,并且说明抑制消减杂交技术具
有较高的灵敏度 。
176
第 2期 李世国等:孔石莼在干出胁迫下上调表达基因消减 cDNA文库的构建及分析
图 3　干出胁迫条件下 pds和 lhcp基因的相对表达量
Fig.3　Therelativeexpressionabundanceofpdsand
lhcpgeneunderemersedstress
2.4　密码子偏好性分析
将表 1中的 22条 EST序列在 CodonW软件中
进行密码子偏好性计算以及 GC含量分析 ,所得结
果如表 2。共包含 3 055个密码子 ,出现频数最高的
为亮氨酸(Leu)273次 ,占密码子总数的 8.94%;其
次为丙氨酸(Ala)227次 ,占 7.43%;精氨酸(Arg)
224次 ,占 7.33%。密码子第三位碱基使用频率:A
24.21%, G26.09%, C24.57%, T25.13%,对各碱
基的使用偏好无显著差别(P>0.05), G的使用频
率略高于 C, GC使用总频率为 50.66%。终止密码
子 TAA、TAG和 TGA的使用频率分别为 15.71%、
14.29%和 70.00%,表明孔石莼终止密码子的使用
明显偏好 TGA。
表 2　孔石莼密码子使用频率统计表
Tab.2　StatistictableofcodonusagefrequencyinU.pertusa
氨基酸
Aminoacid
密码子
Codon
频数
Frequency
比例(%)
Proportion
氨基酸
Aminoacid
密码子
Codon
频数
Frequency
比例(%)
Proportion
Phe TTT 33 42.86 Ser TCT 41 22.90
TTC 44 57.14 TCC 46 25.70
Leu TTA 9 3.30 TCA 61 34.08
TTG 54 19.78 TCG 31 17.32
CTT 58 21.25 Pro CCT 54 26.47
CTC 52 19.05 CCC 44 21.57
CTA 22 8.05 CCA 71 34.80
CTG 78 28.57 CCG 35 17.16
Ile ATT 35 30.17 Thr ACT 37 20.67
ATC 60 51.73 ACC 50 27.93
ATA 21 18.10 ACA 50 27.93
Met ATG 73 100.00 ACG 42 23.47
Val GTT 47 28.48 Ala GCT 68 29.96
GTC 41 24.85 GCC 49 21.59
GTA 20 12.12 GCA 77 33.91
GTG 57 34.55 GCG 33 14.54
Try TAT 24 64.86 Cys TGT 64 53.78
TAC 13 35.14 TGC 55 46.22
TER TAA 11 15.71 TER TGA 49 70.00
TAG 10 14.29 Trp TGG 47 100.00
His CAT 62 53.91 Arg CGT 23 19.33
CAC 53 46.09 CGC 21 17.65
Gln CAA 68 52.71 CGA 36 30.25
CAG 61 47.29 CGG 39 32.77
Asn AAT 44 45.83 Ser AGT 34 36.56
AAC 52 51.17 AGC 59 63.44
Lys AAA 37 34.58 Arg AGA 51 48.57
AAG 70 65.42 AGG 54 51.43
Asp GAT 57 54.81 Gly GGT 48 25.95
GAC 47 45.19 GGC 48 25.95
Glu GAA 61 57.55 GGA 58 31.35
GAG 45 42.45 GGG 31 16.75
注:下划线部分为起始和终止密码子
Notes:Theunderlinepartdisplaysstartandstopcodons
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海　洋　渔　业 2011年
3　讨论
抑制消减杂交技术是一种高通量筛选特异表达基因的有效手段 ,准确性可以高达 90%以上[ 15] 。
从已建立的 2种墨角藻 、杜氏盐藻 、龙须菜 、海带和坛紫菜等藻类消减文库中鉴定出的功能基因片段分
别占到该文库中分离的 EST片段总数的 48.4%、40%、40%、30%和 28.6%[ 5, 7, 10-12] ,实验中构建的孔石
莼干出胁迫消减文库的功能基因片段所占比例为 56%,与上述结果相比略高(图 2)。由于绿藻与高等
植物之间进化关系较近 ,在比对过程中氨基酸序列的匹配程度可能要高于其他藻类 。构建消减文库所
用的孔石莼总 RNA及 mRNA质量较高 ,文库包含的信息量大(图 1),经实时荧光定量分析显示部分分
离的基因表达量上调(图 3),符合上调表达文库构建的规律 ,具有一定的可信度和代表性 。
密码子的简并性造成了不同物种对密码子使用存在偏好 ,这一现象的产生与基因的性质 、结构和表
达调控等多种因素有关。通过分析基因的密码子偏好性可以选择合适的表达系统 ,提高外源基因表达
的效率 [ 16-17] 。陆广琴等[ 18]的分析表明 ,对于亲缘关系相近甚至是同属海藻的密码子使用的偏好也存
在着差异。实验中分析得知 ,孔石莼对亮氨酸 、丙氨酸和精氨酸的使用偏好较大 ,而第三位碱基的使用
则无明显区别。对终止密码子使用明显偏好 TGA(70.00%),这与对海带的密码子偏好性分析结果一
致 [ 18] ,与掌状海带(L.digitata)有较大差别 [ 19] 。第三位碱基 GC的使用频率低于其他几种已报道的藻
类 ,总的排列顺序为条斑紫菜(79.40%)[ 20-21] >坛紫菜(79.10%)[ 22] >凋毛藻(Grifithsiaokiensis)(76.
50%)[ 23] >海带(74.60%)[ 18] >小定鞭藻(Prymnesiumparvum)(64.30%)[ 24] >缘管浒苔(Ulvalinza)
(57.69%)[ 25] >孔石莼(50.10%),基本上符合红藻 >褐藻 >金藻 >绿藻的排列顺序 ,具有一定的规
律 。
与孔石莼相似 ,在对 2种墨角藻 [ 5] 干旱胁迫处理后 ,捕光叶绿素 a/c结合蛋白基因(Fucoxanthin
chlorophyla/c-bindingprotein, fcp)、14-3-3s基因 、gst基因等的表达量也发生变化 ,这些基因很可能在藻
类抵御环境胁迫的过程中发挥着重要的作用。多数海藻细胞中不具有液泡结构 ,但是却表现出更强的
忍受干出状态下水分散失而引起的渗透胁迫的能力 ,当组织失水高达 90%时在 1 ～ 2h内能够迅速恢复
光合作用[ 5] ,紫菜(Porphyralinearis)则在干出暴露 3周后仍然能够存活 [ 26] 。干出胁迫时孔石莼很可能
优先表达与光合作用密切相关的基因 ,实验中分离得到了 lhcp基因 、srcp基因和 elp基因。捕光叶绿素
a/b结合蛋白与相应色素组合形成的色素蛋白复合体是一类捕获光能并把能量迅速传至反应中心引起
光化学反应的一类重要元件 ,在各种光照环境的适应过程中起着重要的作用。在轻微脱水状态下多数
藻类光合速率会增加 ,达到某一峰值后随着脱水比例的增加而逐渐下降 [ 2-4] ;杜氏盐藻 lhcp基因受到高
光诱导后在 2 h内迅速提高表达量 ,但是随着作用时间积累超出 2h后表达量逐渐下降[ 27] ;海带雌雄配
子体 lhcf基因也分别在光照强度为 40和 80 μmol/m2·s时达到最高转录水平 ,高于此水平后转录量明
显下降 [ 28] 。虽然对这种现象的作用机制尚未阐明 ,但可以肯定的是在干出暴露处理前期孔石莼并未达
到光合作用的饱和状态 , lhcp等基因的上调表达有利于光合作用效率的加快(图 3)。
目前从组织 、细胞和分子水平已经对高等植物忍耐干旱胁迫的机制进行了深入的探讨 [ 29-30] ,提供
了可借鉴的基础和前提条件。实验中分离的 cbr基因 、pds基因 、gst基因等在多种高等植物[ 31-32]中的同
源基因都受干旱胁迫诱导表达。同时从杜氏盐藻 [ 33-34] 、雨生红球藻(Haematococuspluvialis)[ 35] 、条斑
紫菜[ 36]等海藻中克隆的上述基因异源表达后能够明显提高宿主抵抗不良环境的能力 。cbr和 pds基因
表达量的提高最终将有助于提高孔石莼的抗胁迫能力(图 3),保证了其在潮间带分布的位置能够正常
生存。与细胞生长和发育 、细胞代谢相关的基因被有效的富集 ,对于启动干出胁迫下细胞分裂活动起到
调控作用。消减文库中富集了大量与孔石莼细胞信号转导相关的基因 ,如 stpk基因 、osak/sapk基因 、14
-3-3s基因等 ,可见 ,孔石莼感受干旱 、高盐和高光照等干出胁迫信号后 ,经过一系列传递过程 、诱导与
生长 、发育和代谢相关基因的表达 ,从而控制细胞结构变化 ,诱导抗性相关基因的表达而产生防御反应 ,
在信号转导途径中形成了复杂的调控网络 ,在胁迫应答反应机制中也占有极其重要的地位 。
有 60条序列没有比对结果或功能未知 ,可能是孔石莼中与干出胁迫相关的新基因 ,其性质和功能
178
第 2期 李世国等:孔石莼在干出胁迫下上调表达基因消减 cDNA文库的构建及分析
还有待于进一步深入研究 。探讨多种基因在干出胁迫时的协同作用方式 ,能够为揭示孔石莼抵御潮间
带不良环境的分子机制提供多方面的切入点。
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