全 文 ：中国药房 2007年第 18卷第 4期 China Pharm acy 2007 Vol.18 N o.4 · 265·
*主管药师,博士。研究方向:临床药理与中药新药。电话:020-
61627286。E-mail:liuyg 1999@163.com
白黎芦醇体外抗肝纤维化实验研究
刘永刚 1 *,刘永忠 2 ,谢少玲 1(1.武警广东总队医院药剂科 ,广州市 510507;2.西安市中心医院药剂科 ,西安
市 710003)
中图分类号 R965 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2007)04-0265-02
摘 要 目的:探讨白黎芦醇体外抗肝纤维化的作用机制。方法:原位灌流分离大鼠肝细胞 ,以维生素 E作阳性对照 ,检测不同浓
度白黎芦醇对四氯化碳(CCl4)损伤后肝细胞中丙二醛(M DA)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性和肝细胞存活率的影响;并用肝星状
细胞(HSC)与次氮基三醋酸铁共同培养产生氧应激后 ,检测不同浓度白黎芦醇对 HSC 增殖和Ⅰ型胶原生成的影响 ,并测定细胞培
养液中MDA 、超氧化物歧化酶(SOD)活性 。结果:白黎芦醇明显改善 CCl4损伤后肝细胞存活率 ,抑制 CCl4引起的 ALT 、M DA 活
性升高 ,并能明显抑制 HSC氧应激后MDA 活性升高和 SOD 活性的降低 ,抑制 HSC增殖和 Ⅰ型胶原的生成 。结论:白黎芦醇抗肝
纤维化作用可能与其抗脂质过氧化有关 。
关键词 白黎芦醇;肝细胞;肝纤维化;作用机制
Study on Resveratrol to Anti-hepatic Fibrosis in Vitro
LIU Yonggang , XIE Shaoling(Dept.o f Pharmacy , Guangdong Provincial Armed Police Forces Corps Hos-
pital , Guang zhou 510507 , China)
LIU Yong zhong(Dept.of Pharmacy , Xian Central Hospital , Xian 710003 , China)
ABSTRACT OBJECT IVE:To investigate the m echanism of resvera tro l on hepa tic fibrosis in vit ro.METHODS:T he hepa-
tocy tes o f rats were separa ted by perf usion in situ.af te r the ra t hepatocy te w as injuried by CCl4 , the level o f ALT , M DA and
cell v iability af ter cultiva tion fo r 3 h were de termined respective ly ;HSC -T were incubated w ith fe rric nitrilot riacetate com-
plex(FeNTA).M T T colorime try w as used fo r assaying prolifera tion of HSC.Collagen type Ⅰ accummulation in t he culture
media w as measured by ELISA.Intracellular m alonildialdehyde(M DA)、 SOD leve l in the cult ure media were m easured by
their reagent boxes.RESULTS:Resverat rol significantly im proved ce ll v iability , inhibited the increase o f A LT , MDA induced
by CCl4 ;HSC incuba tion w ith FeNTA resulted in a significant production of intracellula r MDA associated w ith decrease SOD
activity .Exposure of HSC to FeN TA significantly enhanced the number of prolife rating HSC and collagen type Ⅰ levels in the
culture medium.All these e ffects were reversed by the antiox idant resvera tro l.CONCLUS ION :The mechanism of resveratrol
on fibrosis m ay be related to inhibit lipid perox ida tion.
KEY WORDS Resverat rol;Hepat ocy te;Hepatic fibrosis;Mechanism
白藜芦醇 (Resveratrol , Res)是广泛存在于葡萄皮 、百合
科 、蓼科 、豆科 、花生和多种药用植物中的一种多酚类化合物 ,
已在 72种植物中被发现 ,以虎杖中含量最高 [ 1 ]。近年研究 [1 ]表
明 ,白藜芦醇有显著的抗氧化 、抗炎作用 。笔者在进行抗肝纤维
化中药筛选时发现 , 白藜芦醇对二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化
有抑制作用(另文报道)。本实验通过研究 Res对体外培养肝细
胞受到四氯化碳 (CCl4)损伤后的保护作用和对次氮基三醋酸
铁 (FeNTA)诱导肝星状细胞 (HSC)氧化应激的影响 , 探讨
Res对抗肝纤维化的作用机制。
1 材料
1.1 动物
Wistar ♂大鼠 , 体重(210±10)g , 8 ～ 10w k龄 , 由南方医
科大学实验动物中心提供 ,粤检证号:2004A067 。
1.2 试药
肝星状细胞系 (HSC-T 6 , 美国加利福尼亚旧金山总医院
肝病研究中心 Frideman 教授惠赠), 为 sv40转染 SD 大鼠
HSC;白黎芦醇、 Ⅳ型胶原酶 、M TT 均购自美国 Sigma公司;
DM EM 培养基(美国 Gibco 公司);丙氨酸氨基转移酶(ALT)、
丙二醛(M DA)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒均购于南京建
成生物工程公司 , 批号:030706 、 031210 、 031019;维生素 E
(VitE , 美国 Sigma公司), 作阳性对照 , 用少量二甲基亚砜
(DM SO)溶解 ,加入到培养液后其终浓度为 50μmol ·L -1。
2 方法
2.1 分离 、培养肝细胞
采用原位灌注酶消化法 [2 ]分离肝细胞 , 调节细胞数为 5×
10
5个 ·mL -1。本实验经台盼蓝染色后计数活细胞数>90%。
细胞分别接种于 24孔板和 96孔板 ,36h后换液 。
2.2 白藜芦醇对 CCl4损伤肝细胞的影响 [3 ,4 ]
正常原代肝细胞培养 36h后 , 加入白黎芦醇培养液 , 终浓
度分别为 10 、20 、40 、80μmol ·L -1 ,以 VitE作阳性对照 , 继续
培养 12h , 将培养板置于密封盒内 , 盒内放入 0.4mL ·L -1的
CCl 4 , 37℃下损伤 60min , 移出培养板继续常规培养 3h后收集
细胞及检测上清液M DA 、ALT 活性 。其中一板于损伤前加入
0.5%M TT 20μL , 损伤 1h 后在 5%二氧化碳(CO 2)培养箱中
37℃下继续培养 3h , 小心吸去上清液 , 每孔加入 100mL DM-
SO -乙醇(1∶1)溶液 ,在微型振荡器上振荡 10min ,用酶标仪
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于 570nm 波长处测光密度(OD)值 。
2.3 细胞增殖试验
采用含 3%小牛血清的 DM EM 培养传 1代培养的 HSC
为 1×105个 ·mL -1细胞悬液 , 接种于 96孔板 , 每孔 100μL ,
待细胞长至近单层后分组:空白对照组仍用含 3%小牛血清的
DM EM 培养液;模型组换含终浓度 0.1mmol ·L -1 FeNTA 和
3%小牛血清的 DMEM 培养液 ;阳性对照组换含终浓度
0.1mmol ·L -1 FeNTA 、50μmol ·L -1 VitE和 3%小牛血清的
DM EM 培养液 ;其余各组换含终浓度 0.1mmol · L -1 FeN-
TA 、不同浓度的白黎芦醇(10 、20 、40 、80μmol ·L -1)(在预实验
中 10μmol· L -1以下剂量效果不是很理想 , 故在这里确定以
10μmol ·L -1为下限)和 3%小牛血清的 DM EM 培养液 。每组
设 5个复孔 , 24h后每孔加 0.5%M TT 贮备液 20μL 继续孵育
4h ,弃上清液并每孔加 100μL DM SO 溶解细胞内结晶 ,以酶标
仪于 570nm 波长处测定 OD 值 。
2.4 MDA 、SOD及 Ⅰ型胶原的测定
采用含 3%小牛血清 DM EM 培养传 1代培养的 HSC 24h
后 ,按“2.3”项下方法制备 ,每组设 5个复孔 , 培养 4h 后 ,收集
上清液 , 按测试盒推荐方法检测MDA 、 SOD并以酶联免疫吸
附法测定 Ⅰ型胶原 [5 ] 。
2.5 统计学方法
计量资料以均数±标准差 (x ±s)表示 , 用统计软件
SPSS10.0进行单因素变量的方差分析 。
3 结果
3.1 白藜芦醇对 CCl 4损伤后肝细胞存活率及 ALT 、MDA活
性的影响
各组 CCl4损伤后肝细胞存活率及 ALT 、 MDA 活性测定
结果详见表 1。
表 1 各组 CCl4损伤后肝细胞存活率及 ALT 、 MDA活性测
定结果(x ±s , n=5)
Tab 1 Effects of resveratrol on ALT , MDA of hepatocyte
injuried by CCl4 in each group(x ±s , n=5)
组别 剂量/μmo l· L- 1 AL T/ IU · L- 1 MDA/μmo l· L- 1 OD值 /570nm
空白对照组 - 11.39±2.04* * 0.33±0.088* * 0.43±0.078* *
模型组 - 33.83±4.18 0.83±0.18 0.19±0.047
白黎芦醇组 10 31.76±5.89 0.76±0.15 0.21±0.041
白黎芦醇组 20 26.71±2.86* * 0.71±0.086* 0.24±0.055*
白黎芦醇组 40 22.64±3.11* * 0.62±0.11* * 0.28±0.047* *
白黎芦醇组 80 20.54±2.16* * 0.53±0.17* * 0.32±0.084* *
阳性对照组 50 17.67±3.98* * 0.57±0.13* * 0.36±0.071* *
与模型组比较:*P<0.05 , **P<0.01
vs.model group:*P<0.05 , * *P<0.01
由表 1可知 , CCl4损伤肝细胞后 ,促进肝细胞内酶的释放 ,
模型组的细胞存活率仅为空白对照组的 44.81%, 其 ALT 、
MDA 活性明显升高;与模型组比较 ,白藜芦醇除 10μmol ·L -1
组外 ,其余各剂量组细胞存活率明显升高 ,A LT 、M DA 活性显
著性降低 , 存在明显剂量-效应关系 。
3.2 白藜芦醇对 FeNTA诱导氧应激后 HSC增殖 、培养液中
的MDA 、SOD活性及Ⅰ型胶原的影响
各组 FeNTA 诱导氧应激 HSC增殖 、培养液中的MDA 、
SOD 活性及 Ⅰ型胶原测定结果详见表 2。
由表 2可知 ,与空白对照组比较 ,模型组 HSC增殖 、M DA
活性及 Ⅰ型胶原水平明显升高 , SOD 活性显著降低;与模型组
比较 ,白藜芦醇各剂量组不同程度抑制M DA 活性升高和 SOD
表 2 各组 FeNTA诱导氧应激HSC增殖 、培养液中的MDA 、
SOD活性及 Ⅰ型胶原测定结果(x ±s , n=5)
Tab 2 Effects of resveratrol on level of MDA , SOD and
collagen type Ⅰ of HSC undergoing oxidative stress(x ±s ,
n=5)
组别 剂量/μmol ·L- 1
OD值/
570nm
MDA/
μmo l· L- 1
SOD/
μmol ·L - 1
Ⅰ型胶原 /
ng ·mg- 1 pro
空白对照组 - 0.603±0.028* 0.37±0.041* * 26.37±3.04* * 183.76±11.64* *
模型组 - 0.712±0.017 0.98±0.18 5.83±1.68 376.24±19.87
白黎芦醇组 10 0.678±0.041 0.86±0.19 6.71±3.09 281.98±23.68* *
白黎芦醇组 20 0.564±0.055* * 0.73±0.22* 10.65±2.08* * 233.86±28.49* *
白黎芦醇组 40 0.486±0.047* * 0.59±0.14* * 13.54±2.11* * 209.68±19.63* *
白黎芦醇组 80 0.401±0.034* * 0.48±0.16* * 20.42±4.67* * 159.48±26.45* *
阳性对照组 50 0.431±0.071* * 0.39±0.12* * 28.48±4.68* * 136.98±12.66* *
与模型组比较:*P<0.05 , **P<0.01
v s.model g roup:*P<0.05, * *P<0.01
活性降低 ,抑制 HSC 的增殖和 Ⅰ型胶原的生成 ,呈明显剂量-
效应关系 。
4 讨论
肝纤维化是慢性肝病的共同病理学基础 , 虽然不同肝病的
致病机制不完全相同 , 但肝纤维化发生的最终共同途径是
HSC的激活 , 转化为成纤维细胞 。近年的研究表明 , 在肝纤维
化形成过程中氧自由基及其引起的脂质过氧化具有重要作
用 。脂质过氧化产物不仅可活化枯否氏细胞 , 分泌多种细胞因
子 ,继而激活 HSC , 还可直接激活 HSC , 介导 HSC的分化 、增
殖和胶原合成 。本实验用 CCl4诱导肝细胞坏死性损伤造模并
用 FeNTA 与 HSC 在体外共同培养 , 引起铁超载 , 诱导氧应
激[ 6 ] ,是较理想的肝纤维化的体外模型 。
研究结果表明 , 白黎芦醇对 CCl4损伤的原代培养大鼠肝
细胞有显著的保护作用 ,对 CCl4引起的 ALT 、M DA 活性的升
高有显著的抑制作用 , 并显著提高肝细胞的存活率;白黎芦醇
对 FeNTA 诱导 HSC 氧化应激也有明显的抑制作用 , 表明白
黎芦醇抗肝纤维化的作用机制可能与其能抑制 HSC 的增殖和
活性 ,抑制脂质过氧化有关 。
参考文献
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(收稿日期:2006-05-15 修回日期:2006-07-21)