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汞对斜生栅藻的急性毒性研究



全 文 :- 22 -
上海农业科技 2010-3
汞对斜生栅藻的急性毒性研究
曹维维 王 恒 (扬州大学动物科学与技术学院,江苏省扬州市 225009)
李湘鸣 罗方妮* (扬州大学医学院,江苏省扬州市 225009)
藻类通过对污染物的吸收及光合放氧供微生物进行好氧
代谢,达到净化污水的目的。目前研究藻类对污水的净化特
别是重金属(如Hg2+)对净化效率影响的报道非常多[1~4],
但未见有汞对斜生栅藻的急性毒性作用及斜生栅藻对汞的富
集作用方面的报道。斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)系
绿藻门(Chlorophyta)绿藻纲(Chlorophyceae)绿球藻目
(Chlorococcales)栅藻科(Scenedsmaceae)斜生栅藻属
(Scenedesmus obliquus),为普生性单细胞藻,具有生长速
度快、光合效率高、无性繁殖和适应性强等特点,多用来作
为科研材料。如今它们的应用价值越来越广泛[5,6],可在废
水处理、改良水质中发挥巨大的作用。然而由于环境受污染,
含有农药、重金属物质的废水进入自然水体,对水中生物造
成无可估量的伤害[7~9]。其中汞是一种最常见的环境重金属
污染物,无机汞和有机汞均能在生物体内积累,通过食物链
和生物富集作用使其危害性增强。环境中任何形式的汞均可
在一定条件下转化为剧毒的甲基汞。为探讨重金属离子对水
生生物的生物学效应,本试验选用斜生栅藻对Hg2+的急性
毒性进行了研究,现将研究结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 斜生栅藻培养 取50mL消毒锥形瓶,加入不含Hg2+
的斜生栅藻培养液50mL,接种斜生栅藻(购自武汉水生生
物研究所)进行扩大培养。培养条件:每天光照14h,光照
强度为2000~2500Lx,温度为28±1℃,每天8~20h,间
隔4h振摇培养瓶1次,以利于斜生栅藻的均匀生长,使细胞
浓度达2×105/mL。
1.2 实验设计 根据预试验结果,设计8个Hg2+浓度梯度
组,每组设3个平行样,浓度梯度设计为5.0×10-4、5.0×
10-5、5.0×10-6、5.0×10-7、5.0×10-8、5.0×10-9、5.0
×10-10和0(空白)mol/L。将一定浓度的斜生栅藻接种于
50mL含有不同浓度Hg2+的培养液中,置入DG-2C多功能
恒温箱(杭州天成光电有限公司)培养,分别培养24h、48h
和96h后,用棱光722N可见分光光度计(上海精密仪器有
限公司)测其光密度(OD650nm)。
1.3 汞含量的测定 (1)试剂的配制及测量方法:按照水
质分析方法国家标准汇编中的方法进行[10]。设计6个汞标准
系列,分别为0、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0μg/L,采用SYG-
II型智能冷原子荧光测汞仪测定其汞的吸光度,用Excel绘
制标准曲线。(2)斜生栅藻培养液汞含量测定:选用汞浓度
为5×10-9mol/L(1.005μg/L)和5×10-10mol/L(0.1005
μg/L)的斜生栅藻培养液,分别在72h、96h、120h和144h,
用0.45μm滤膜滤去微藻细胞,用测汞仪测定各组滤液中
的汞含量,方法同汞标准系列,以探讨汞对微藻是否具有富
集作用。每组均设两个平行样。同时各浓度组设相应对照,即
培养液除加斜生栅藻外,其余操作同受试浓度组。
1.4 统计方法 实验数据用Excel和SPSS8.0软件进行处
理。本试验汞浓度的对数与斜生栅藻生长抑制率呈S形曲线,
故用Logist方程进行拟合[10],求IC50即50%抑制率所对应的
浓度。Logist回归方程模型:N=k/(1+ea+blgx),式中a、b
为常数,X为汞浓度,K为Logistic回归模型的极限值,即
为100,N为各浓度组的抑制率。抑制率计算公式:抑制率
=(A-B)/A×100%,式中A为对照组OD650nm,B为试验
组OD650nm。
2 结果与分析
2.1 汞对斜生栅藻生长的抑制 从图1可见,抑制率随Hg2+
浓度的增加而呈明显的上升趋势,Hg2+浓度从5×10-10mol/
L开始增大时,24h、48h、96h的抑制率也开始增加;当Hg2+
浓度达到5×10-4mol/L时,抑制率也接近于最大值,变化趋
势经用SPSS8.0软件中的Logstic回归方程拟合,均呈S型
曲线。但Hg2+浓度在5×10-5mol/L以下时,24h的抑制率
变化曲线位于48h、96h上方,说明斜生栅藻在24h内对Hg
的反应较大,而随作用时间的延长,斜生栅藻对Hg出现了
耐受性和适应性,结果使48h、96h的抑制率曲线几乎完全
———————
收稿日期:2009-07-22
基金项目:江苏省环境监测科研基金项目“构建绿色荧
光蛋白(G F P)发光细胞快速监测突发性水污染的研究”(编
号:0714)资助。
*为通讯作者。
摘 要:为研究水体中汞对斜生栅藻生长的影响,将斜生栅藻在含有不同浓度汞的培养液中培养,分别在24h、
48h和96h测650nm的吸光度值,并对斜生栅藻中的汞浓度做了检测。结果表明,培养液中汞的存在对斜生栅藻生
长均有抑制作用,并随浓度的递增,抑制作用增强,同时表明斜生栅藻对汞具有一定的富集作用。经Logist回归分
析,求得24h、48h和96h汞抑制斜生栅藻生长的半数抑制浓度(IC50),分别为9.4471×10-6、8.8156×10-6和7.4648
×10-6mol/L。
关键词:斜生栅藻;生长抑制;半数抑制浓度(I C50);急性毒性
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重合,在此浓度的作用范围内,作用时间对抑制率的影响不大。
根据Logistic回归模型,用此函数Ln[(K-N)/N]=a-
blgx对图1方程线性化,可见此时a表示直线在Y轴(Ln[(K-
N)/N])的截距,b表示直线斜率。
图1 汞对斜生棚藻生长的抑制
以汞浓度的对数(lgX)为横坐标、Ln[(K-N)/N]为纵
坐标绘图(见图2),可见Logist回归曲线线性化。将线性化
数据经SPSS8.0软件处理,求出汞对斜生栅藻24h抑制率的
线性化方程:Ln[(K-N)/K]=-0.6573lgX-3.4688,r=0.
9915(P<0.001);48h的线性化方程:Ln[(K-N)/K]=-
0.8238lgX-4.1644,r=-0.9986(P<0.001);96h的线性
化方程:Ln[(K-N)/K]=-0.9931lgX-5.0916,r= 0 9898
(P<0.001)。
图2 汞对斜生棚藻抑制率Logist回归线性变换
由此看出,当抑制率N=50%时,Ln[(K-N)/K]=0,故
汞作用24h对斜生栅藻的IC50可用下式计算:-0.6217logX-
3.151=0,logX=-5.068,X(IC50)=8.66×10-6。同理可计
算,48h时:-0.8238lgX-4.1644=0,IC50为8.81×10-6;
96h时:-0.9931lgX-5.0916=0,IC50为7.46×1-6。
2.2 斜生栅藻对汞的富集作用 由图3可见,汞的光密度
值(X)与汞浓度(μg/L)呈直线相关关系,回归方程为
y=0.021x-0.7283,r=0.9935(P<0.01),说明整个试验操
作过程较为可靠。
图3 汞的标准曲线
由表1可见,斜生栅藻对汞具有一定的富集作用,含汞
1.005ug/L的藻液经72h培养后,其中的汞含量降至0.9964
μg/L,随培养时间的延长,藻液中汞浓度逐渐下降,至144h
后其中的汞含量下降至0.9006ug/L,而对照组的汞浓度没
有明显改变。含汞0.1005ug/L的藻液中,汞含量亦有类似
改变,培养至144h后其中的汞含量下降至0.0589ug/L。由
此可得出,斜生栅藻对汞具有一定的富集作用。
表1 斜生栅藻汞的含量
3 讨 论
3.1 一定浓度的Hg2+对斜生栅藻生长具有明显的影响,试
验中发现,在Hg2+浓度为5×10-4mol/L的斜生栅藻锥形瓶
中,随培养时间延长,培养液颜色由黄绿逐渐变为浅黄绿,底
层出现絮状浅黄色沉淀物。说明斜生栅藻在浓度较高的Hg2+
溶液中细胞生长受到严重抑制,甚至出现死亡。随Hg2+浓度
的降低对藻细胞生长的抑制有所缓和。
3.2 从图1可见,5×10-10mol/L的Hg2+对斜生栅藻生长
几乎无抑制作用,当浓度达到5×10-8mol/L时抑制率达到
14.50%。当汞浓度达5×10-4mol/L时抑制率达到最大,为
88.55%。说明对斜生栅藻生长的抑制仅与Hg2+浓度有关,
而与暴露时间关系不明显。中国饮用水汞含量的限定值标准
为5×10-8mol/L,由于汞可通过食物链富集,人食用了这
些鱼、贝类后,可引起慢性中毒。基于汞的毒性,考虑到食
物链的富集作用,因此,渔业水质标准(GB 11607-89)[11]
中对汞含量的限定值更严,约为10-9mol/L。但该浓度对斜
生栅藻可产生轻度的生长抑制且不明显,从这个意义上讲,
斜生栅藻可在一定程度上修复水体中重金属汞离子的污染。
藻类吸收汞后积累在体内,通过光合作用导致光合色素损失
和叶绿素含量降低,以及改变藻类细胞渗透性甚至诱发畸
变,抑制藻类的生长或引起死亡。张征[12]报道鱼腥藻在汞浓
度为5×10-6mol/L时,生长显著受到抑制;小球藻在汞浓
度为5×10-7mol/L时,生长受到抑制,在汞浓度为10-6mol/
L时,完全停止生长,说明这3种藻类对汞的耐受力依次是
鱼腥藻>小球藻>斜生栅藻。
3.3 从图2分析,氯化高汞抑制斜生栅藻生长的24h-IC50、
48h-IC50和96h-IC50分别为9.4471×10-6、8.8156×10-6、
7.4648×10-6mol/L。时间越长,IC50越低,药物浓度越高,
抑制的效应产生得越快。说明汞对斜生栅藻的毒性不单随浓
度的变化而变化,与效应时间的长短也有一定关系。张传永[13]
报道重金属对水生生物的毒性不仅取决于其总量、形态, 其
毒性也受物理化学因素(如温度、pH、硬度、碱度、游离离
子浓度以及和无机、有机试剂的络和作用等)和生物因素(如
时间
(h)
72
96
120
144
光密度均值
82.0
80.5
79.0
77.5
汞浓度
0.9964
0.9645
0.9325
0.9006
对照组Ⅰ
1.005
1.005
1.004
1.005
光密度均值
40.0
40.0
38.5
38.0
汞浓度
0.0910
0.0981
0.0701
0.0589
对照组Ⅰ
.1005
0.1005
0.1004
0.1004
1.005μg/L 0.1005μg/L
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布、贮藏量、年生产量、年需要量等,并对今后发展和需求
的趋向进行分析预测。这对药用植物资源有计划地开发和利
用、并向社会提供咨询和预测等具有战略意义,同时可让生
产者了解各药用植物的详细信息,以供决策者参考。
4.2 加强药用植物的“道地性”研究[4] 对药用植物资源
中的“道地性”进行多学科的专题研究,内容涉及生物学、药
学、化学等,人员不仅是中医中药系统的学者,还应包括其
它行业系统的专家,将其当作一项系统工程来研究,并制定
长远的计划,使之在短期内有个良好的结果。
4.3 建立药用植物资源库,重视良种繁育 有关部门要加
大投入,建立药用植物品种基因库,引进良种,驯化野生品
种,为相关技术的研究和深入开发提供技术支撑。根据品种
特性,建立相应的种子、种苗繁育基地,培育名、优、特产
品,发展地方特有的药用植物。运用现代生物技术,对药用
植物资源库中的珍稀濒危物种进行离体保护,建立现代化的
离体保存基因库。对于那些活性强、含量低、资源匮乏以及
化学方法难以合成的植物次生代谢产物,可利用组织细胞培
养技术进行大规模的生产。而利用药用植物资源库中野生品
种筛选出的优良目的基因,实现药用植物杂交强优组合,将
成为今后药用植物育种的重要方向之一。
4.4 加强药用植物质量控制和评价的研究 把有关研究人
员跨学科地组织起来,对药用植物质量的控制及相关问题进
行更深入系统的研究,使其成为对药用植物质量进行控制和
评价的法定方法,为中药开发利用提供法律依据,确保中药
开发行业更加规范化和合理化,使其发展更加成熟和稳定。
4.5 加快新技术和新方法的推广 药用草资源的开发利用
是与新技术、新方法的使用分不开的,药用草的开发利用仍
要广泛使用新技术、新方法。比如珍稀濒危药用植物资源的
保护和细胞工程、基因工程及发酵工程相结合,使药用植物
资源的开发利用上一个新的台阶,有一个质的飞跃。
4.6 建立无公害药材栽培基地,实施品牌战略[5] 选派有
经验的科技人员深入农村,指导农户按照绿色食品生产标准
进行生产,合理施肥,科学防治病虫害,禁止使用化学合成
的肥料和农药,应用无公害的有机肥,采用生物技术防治病
虫害,从而保证所生产的中药材符合绿色新产品标准,创立
品牌药材。
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生物种类、大小、重量、生长期、耐受性、摄食水平等)决
定。如汞在自然界以金属汞、无机汞和有机汞的形式存在,有
机汞的毒性比金属汞和无机汞要大。
3.4 藻类对重金属的生物吸附特点是易于观察的,因此常
用来指示水体生态系统中某些重金属的化学行为。深入研究
这一方面,具有较好的经济价值和社会效益。由本研究得知,
斜生栅藻对重金属汞具有一定的富集作用,可能是因藻类细
胞壁带有负电荷和氨基、羟基等官能团,这些结构特点决定
了能吸引富集带有正电荷的金属离子[14]。就本研究而言,对
于两者作用时间的选择、富集作用的最佳条件以及在何种浓
度下富集作用最明显等方面还有待于进一步探索。
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