全 文 ：第 33卷 第 6期
2008年 12月　　
昆明理工大学学报(理工版)　htp://www.kustjournal.com/
JournalofKunmingUniversityofScienceandTechnology(ScienceandTechnology)
Vol.33　No.6
　Dec.2008
收稿日期:2008-04-06.基金项目:昆明理工大学青年基金资助项目(项目编号:校青 2006-76).
第一作者简介:李涛(1970-), 男 ,硕士 , 高级实验师.主要研究方向:生物资源开发.E-mail:litao0316@sina.com
苦石莲蛋白分离纯化及抗肿瘤作用探讨
李　涛 1 ,余旭亚1 ,陈云俐 2
(1.昆明理工大学 生命科学与技术学院 ,云南 昆明 650224;2.昆明理工大学 实验室管理处 ,云南 昆明 650093)
摘要:运用硫酸铵分级沉淀 、阳离子交换和凝胶层析等方法 ,分离 、纯化得到了一种苦石莲蛋白 ,
其分子量约为 29.64kD.采用 MTT法考察了其抗肿瘤作用.结果表明 ,苦石莲蛋白对小鼠黑色素
瘤细胞(B16)的体外增殖有明显抑制作用 ,呈现出明显的量 -效关系和时 -效关系.作用 48h,
该蛋白对 B16细胞的半抑制浓度(IC50)约为 136μg/mL.
关键词:苦石莲;分离纯化;肿瘤细胞;生长抑制
中图分类号:Q503 文献标识码:A 文章编号:1007-855X(2008)06-0091-03
PrimaryStudyonProtein sIsolationandPurificationfrom
CaesalpiniaMinaxHanceandItsAnti-TumorEfect
LITao1 , YUXu-ya1 , CHENYun-li2
(1.FacultyofLifeScienceandBiotechnology, KunmingUniversityofScienceandTechnology, Kunming650224, China;
2.LaboratoryManagementOffice, KunmingUniversityofScienceandTechnology, Kunming650093, China)
Abstract:TheCaesalpiniaminaxHanceprotein(molecularweightbeing29.64kD)isobtainedbyisolatingand
purifyingstepsofproteinprecipitationwithammoniumsulfate, cationicexchangingchromatographyandgelfiltra-
tion.MTTisadoptedtoinspectitsanti-tumorefect.ItisshownthroughtheresultsthattheproteinofCaesal-
piniaminaxHancehasaperfectinhibitionefectontheproliferationofmouse smelanomacels(B16 cels),
whichpresentsanobviousquantity-efectrelationshipandtime-efectrelationship.Within48 hours, thepro-
teinhasanIC50 about136μg/mLonB16 cels.
Keywords:CaesalpiniaminaxHance;isolationandpurification;tumorcel;inhibitionofgrowth
0引 言
近年来 ,天然抗肿瘤活性成分的研究方兴未艾 ,许多从植物中提取的活性蛋白相继报道.苦石莲 ,拉丁
文:CaesalpiniaminaxHance,别名南蛇勒 ,喙果云实 ,老鸦枕头 ,打鬼棒;生长于山坡林中或灌木中 ,主要分
布在西双版纳 、德宏州一带 ,当地居民用其根 、嫩叶 、籽入药 ,具有解热祛风 、消肿散结的功效 [ 1] .其粗提物
被用于治疗皮肤病 ,但对其药理作用机制研究甚少.
目前 ,对该植物的研究主要集中在生物小分子部分 , RenWang-Jiang等人从中分离了二萜类化合物 、
呋喃二萜内酯 、三萜酮 ,并对其抗病毒活性及其结构进行了研究[ 2-5] .除此之外 ,对苦石莲抗肿瘤活性蛋白
的研究国内外少见报道.
本研究利用从苦石莲籽中分离纯化出的一个蛋白质 ,通过体外实验 ,以小鼠黑色素瘤细胞(B16)为研
究对象 ,考察该蛋白对肿瘤细胞的增殖抑制作用.
1材 料
苦石莲籽购自云南德宏州;CM-SephadexC-25, SephadexG-75凝胶和蛋白质相对分子量标准 ,
DOI :10.16112/j.cnki.53-1223/n.2008.06.018
Phammacia公司;RPMI1640培养基 ,小牛血清(FCS),购自 Gibco公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT),胰蛋白酶 ,
购自 BBI公司;其余试剂均为进口分装或国产分析纯.
快速蛋白分离系统(AKTAFPLC),瑞典 AmershamPharmacia公司;二氧化碳培养箱(ThermoForma
3110型),美国;倒置显微镜(NikonTE2000型),日本;紫外分光光度计(UV-1700);酶标仪(PowerWave
X);离心机(Beckman),美国;96孔培养板 , Costor公司 ,美国.
2方 法
2.1苦石莲蛋白的分离纯化
将苦石莲籽去壳取仁 ,研细 ,加 0.02M磷酸盐缓冲液(含 0.1mMEDTA和 0.2MNaCl, pH7.0)[ 1∶10
(w/v)] , 4℃浸泡过夜.次日匀浆后 ,用磁力搅拌器搅拌 , 4℃浸提 24h.离心 ,小心刮去上层油脂 ,过滤弃
残渣 ,收集上清液加入(NH4)2SO4至 60%饱和度 ,静置 4h后 ,离心收集沉淀.在离心后的上清液中再加入
固体(NH4)2SO4至 90%饱和度 , 4℃静置过夜.离心 ,收集沉淀.将沉淀溶于尽可能少的磷酸盐缓冲液中 ,
装入透析袋(能截留蛋白质分子量 10kD以上)中 ,用同一缓冲液进行透析除盐(磁力搅拌 , 4℃),每隔 3
～ 4小时更换缓冲液 ,透析 48h,用 10%氯化钡检测透析液 ,无白色沉淀产生即可.取出透析过的溶液 ,离
心弃去沉淀 ,上清即为蛋白质粗提液.浓缩后置冰箱冷冻备用.将粗蛋白经离子交换 CM-SephadexC-25
去除部分杂蛋白 ,收集洗脱峰 ,过葡聚糖凝胶 SephadexG-75柱进一步纯化 ,采用活性跟踪法 ,确定活性
峰 ,收集冻干 ,即得苦石莲蛋白.
2.2 SDS-PAGE凝胶电泳
用 15%的 SDS-PAGE凝胶电泳检测得到的苦石莲蛋白的纯度.当分子量在 15kD到 200kD之间时 ,
蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系 ,以标准蛋白的迁移率对分子量对数作图得一标准曲线 ,据此
可测出苦石莲蛋白的相对分子量 Mr.
2.3蛋白质浓度测定
苦石莲蛋白的浓度测定采用考马斯亮蓝染色法 [ 6] ,以牛血清白蛋白作标准.
2.4细胞培养
培养基为 RPMI1640,其中含 10%小牛血清(FCS),细胞系置于 37℃, 5%CO2 ,饱和湿度环境的培养箱
中培养.
2.5苦石莲蛋白对体外培养小鼠黑色素瘤细胞(B16)增殖
的抑制作用
按照改进过的文献 [ 7]的方法进行.将处于对数生长期
的细胞按 5×104个 /mL接入 96孔板 ,培养 24h,加入不同浓
度的苦石莲蛋白(终浓度为 2.4, 4.75, 9.5, 19, 37.5, 75, 150,
300μg/mL),对照组加入同浓度 PBS,培养 48h后 ,每孔加入
MTT(5mg/mL)20μL,继续培养 4h,弃除孔中培养液 ,加 170
μL二甲亚砜(DMSO)充分溶解蓝色结晶 ,在 490nm波长下
检测各孔的光吸收值 ,实验重复 6次.
2.6实验数据处理
所有结果以平均值 ±标准差表示 , n为实验次数 ,用
student-t检验两组数据之间的显著性差异 ,当 P<0.05时 ,
认为有显著性差异.
3结 果
3.1苦石莲蛋白的分离和纯化
结果如图 1所示 , SDS-PAGE电泳图谱显示为单一条
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带 ,达到电泳纯.经计算其相对分子量约为 29.64kD.
3.2苦石莲蛋白对 B16细胞的量效作用
为了研究苦石莲蛋白对肿瘤细胞的
量效作用 ,测定了不同蛋白浓度对 B16
细胞作用 48 h的生长抑制曲线 ,如图 2
所示.结果显示 ,该蛋白能明显抑制小鼠
黑色素瘤细胞 B16细胞系的体外增殖 ,
且随着浓度的增加 ,其对细胞的生长抑
制作用越强烈 ,具有明显的量效关系.作
用 48 h, 其半抑制浓度 IC50约为 136
μg/mL.
3.3苦石莲蛋白对 B16细胞的时效作用
为了研究苦石莲蛋白的时效作用 ,
测定了蛋白浓度为 150μg/mL对 B16细
胞作用 72h的生长抑制曲线 ,如图 3所
示.从图中可以看到该蛋白抑制 B16细
胞的体外增殖的作用明显 ,在 150μg/mL
浓度作用情况下 , B16细胞的增殖几乎处
于停顿 , 72h的抑制率为 88.91%.
4结 论
1)利用 CM-SephadexC25和 Seph-
adexG-75层析柱 ,通过浸提 、盐析 、离
子交换 、凝胶过滤层析等实验手段从苏
木科植物苦石莲籽中分离纯化得到一个
较高纯度的苦石莲蛋白 ,该蛋白经 SDS-
PAGE电泳检测呈单一条带 ,其分子量约
为 29.64kD.
2)苦石莲蛋白在一定浓度下可以显著抑制小鼠黑色素瘤细胞(B16细胞)的增殖活性 ,且呈现出明显
的量 -效关系和时 -效关系.随蛋白质浓度的增加 ,对细胞的增殖抑制作用明显加强.作用 48h,对 B16细
胞的半抑制浓度 IC50约为 136μg/mL.
3)苦石莲蛋白抑制细胞增殖的能力随时间的延长而增强 ,在 150μg/mL浓度作用 72h情况下 ,细胞
的增殖几乎处于停顿 ,对 B16细胞的抑制率约为 88.91%.
苦石莲蛋白对小鼠黑色素瘤细胞具有明显增殖抑制作用的结果表明 ,苦石莲可作为一种抗肿瘤药物
资源进行开发 ,该蛋白对其它肿瘤细胞的增殖抑制作用及机制有待于进一步研究.
参考文献:
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-2418.
(下转第 97页)
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道的用昂贵的 ABTS及 2, 5-二甲苯胺作为诱导剂[ 7] ,蔗渣的诱导效果更具有工业化应用的优势.
食用菌 XG8菌株自身的产漆酶能力不及目前报道的朱红密孔菌(Pycnoporuscinnabarinus)、毛栓菌
(Trametestrogi)[ 8]等 ,但其添加蔗渣 、乙醇及硫酸铜后 ,漆酶诱导效果显著 ,本研究结果可为新型漆酶诱
导物的开发提供一个新的思路.利用蔗渣诱导漆酶的产生将有利于漆酶降解蔗渣中所含的大量木素分子 ,
从而将被木素分子粘连的蔗渣纤维相互分离 ,实现了蔗渣的脱木素处理 ,对蔗渣造纸工业有重要的应用
价值.
4结 论
本试验选用木素 、蔗渣 、乙醇及不同铜离子浓度对食用菌 XG8菌株的产漆酶能力进行诱导研究 ,结果
表明蔗渣的诱导效果最明显 ,当利用蔗渣 、乙醇及硫酸铜同时进行诱导时 ,漆酶活性与对照相比 ,酶活性提
高了 10倍.
参考文献:
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