全 文 ：213※分析检测 食品科学 2011, Vol. 32, No. 02
坛紫菜降血压活性肽的分离纯化及
分子质量测定
刘淑集 1 ,2，王 茵 1，吴成业 1 ,*，苏永昌 1，刘智禹 1
(1.福建省水产研究所，福建 厦门 361012；2.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002)
摘 要：用AS.1398中性蛋白酶酶解制备坛紫菜(Porphyra haitanesis)ACE抑制肽，并经超滤膜、Sephadex G-15凝
胶层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离纯化，纯化产物测定其氨基酸组成，并运用基质辅助激光解吸电离飞行
时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定分子质量。结果显示：坛紫菜酶解液经超滤分离获得分子质量小于 2000D的组分
ACE抑制活性最高，IC50为 0.73mg/mL；该组分进行 Sephadex G-15凝胶层析分离得 6个组分，组分 E的 IC50最小，
为 0.67mg/mL。组分 E经 RP-HPLC分离得峰 6对ACE的抑制率最高，达到 89.54%；峰 6再次过 RP-HPLC，又洗
出 2个蛋白峰，说明峰 6并不是单一物质，还需进行多次反复纯化。测定峰 6的氨基酸组成主要含有 Tyr、Val和
Phe，同时采用MALDI-TOF-MS分析发现有 8个主要的质子峰，信号最强的质子峰为m/z 861.17，有 4个峰聚集
在m/z 860左右，说明峰 6平均分子质量大约为 860D，推算出紫菜降血压肽含有 3个Val、2个 Phe、1个 Tyr，
N端为 Val，可能的排序顺序有 18种。
关键词：坛紫菜；降血压肽；A C E 抑制活性；分离；纯化；分子质量
Isolation, Purification and Molecular Weight Determination of Antihypertensive Peptides Derived from
Porphyra haitanesis
LIU Shu-ji1,2，WANG Yin1，WU Cheng-ye1,*，SU Yong-chang1，LIU Zhi-yu1
(1. Fisheries Research Institute of Fujian, Xiamen 361012, China；
2. College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)
Abstract ：Porphyra haitanesis was hydrolyzed with AS.1398 neutral protease, and the hydrolysate was filtrated sequentially
through ultra-filtration membranes with molecular weight cutoff (MWCO) 2000 D and 8000 D to obtain the fraction with the
highest ACE-inhibitory activity, of which the molecular weight was below 2000 D. The fraction was then purified by Sephadex
G-15 gel permeation chromatography into 6 peaks, in which peak E had the strongest ACE inhibitory activity with an IC50 of
0.67 mg/mL, and peak E was further fractionated by RP-HPLC to obtain peak No.6 with the highest ACE-inhibitory activity,
reaching up to 89.54%. In the end, peak No.6 was injected into RP-HPLC system once again, and two protein peaks were
observed in the chromatogram, suggesting that peak No.6 is not a single component and is still in need of further purification. The
amino acid composition of peak No.6 was mainly composed of Tyr, Val and Phe. Meanwhile, the MALDI-TOF-MS spectrum
of peak No.6 displayed 8 major proton peaks, the peak with the strongest signal intensity was m/z 861.17, and 4 of them were
fluctuated around m/z 860, indicating that the mean molecular weight of peak No.6 is approximately 860 D. We speculated that
antihypertensive peptides derived from Porphyra haitanensis consisted of 3 Val residues, 2 Phe residues and 1 Tyr residue, of
which at the N-terminal Val was located, and that the number of possible ranking sequences was 18.
Key words：Porphyra haitanensis；antihypertensive peptide；isolation；purification；molecular weight
中图分类号：S985.4 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2011)02-0213-05
收稿日期：2010-03-17
基金项目：福建省科技计划重点项目(2008N0202)
作者简介：刘淑集(1981—)，女，助理研究员，硕士，主要从事海洋生物学利用研究。E-mail：cute506636@163.com
*通信作者：吴成业(1953—)，男，研究员，学士，主要从事水产品加工利用研究。E-mail：wcy@fjscs.ac.cn
2011, Vol. 32, No. 02 食品科学 ※分析检测214
坛紫菜(Porphyra haitanesis)是福建省养殖的大宗藻
类，含有丰富的人体必需氨基酸，蛋白质含量达 30%
左右[ 1 ]，还含有大量维生素、矿物质、微量元素以及
降血压、降低胆固醇、血脂和活化血管的生物活性物
质和药用成分[2]，是深受消费者喜爱的健康食品。当前
从生物中开发活性功能肽，特别是利用蛋白酶酶解产物
制备生物活性肽正成为科学家们研究的热点。其中，降
血压活性肽是目前研究较多的一类，即血管紧张素转换
酶抑制肽(angiotensin converting enzyme inhibitory
peptides，ACEIPs)。食源性蛋白降血压肽由于其无毒、
无副作用、安全性高，可开发成降压药物或者降压保
健品[3]。其研究开始于 1979年Oshima等[4]从明胶蛋白中
获得了 6条ACE抑制活性较强的多肽，分子质量均小于
1500D；Nakamura等[5]从日本酸奶中分离出 2种降血压
肽，原发性高血压大鼠( SH R )长期服用可抑制血压上
升；Saito等[6]从日本清酒和酒糟中分离出 9种具有ACE
抑制活性的多肽。据统计，现已证实上百种天然食物
蛋白中存在具有抑制 ACE活性的片段，如大豆[7-8]、玉
米[ 9]、卵清蛋白[1 0]、小麦[1 1]、沙丁鱼[12]、鲣鱼[13]、海
蛰[ 14 ]、大蒜[ 15 ]、花生[ 16 ]、奶酪[ 17 ]等等。
本研究以坛紫菜为原料，利用AS.1398中性蛋白酶
进行水解[ 1 8 ]，制备紫菜降血压活性肽。采用超滤膜过
滤、凝胶过滤色谱 Sephadex G-15和反相高效液相色谱
(RP-HPLC)对紫菜酶解产物进行分离纯化，并测定氨基
酸组成及分子质量，从而为新型降血压药物或者保健品
的研制提供了新途径[19]。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
马尿酰组氨酰亮氨酸(Hip-His-Leu，HHL) 美国
Sigma公司；Sephadex G-15 美国 Pharmacia公司；乙
腈(色谱纯)、三氟乙酸 TFA(TEDIA) 美国 Tedia公司；
血管紧张素转换酶(ACE) 自制；乙酸乙酯 国药集团化
学试剂有限公司。
Prostar 240型高效液相色谱 美国 Varian公司；
ReflexⅢ型MALDI-TOF质谱仪 德国Bruker公司；HD-
1型核酸蛋白检测仪、SBS-100型数控计滴自动部分收集
器 上海沪西分析仪器厂有限公司；LZB-4型超滤装置
上海摩速科学器材有限公司；LGJ-2型冷冻干燥机 宁
波新芝生物科技股份有限公司；R205型旋转蒸发仪 上
海申生科技有限公司；SP-75型紫外分光光度计 上海
光谱仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 原料预处理及膜分离
坛紫菜烘干，绞碎。取 250g坛紫菜粉末用AS.1398
中性蛋白酶酶解，料液比 1 :2 0 (g /m L)、加酶量 7%、
温度 50℃、酶解 10～12h，100℃加热 15min灭活。酶
解液 8000r/min离心 15min，收集上清液。上清液经过
孔径为 10μm 的微孔滤膜微滤，然后依次通过截留分
子质量 8000D和 2000D的超滤膜进行分级超滤，收集
3种组分：Ⅰ(M＞ 8000D)、Ⅱ(2000D＜M＜ 8000D)、
Ⅲ( M ＜ 2000 D )，浓缩后冻干，进行 A C E 抑制活性
检测。
1.2.2 Sephadex G-15柱层析分离
将样品配成质量浓度为 0.5g/mL溶液，取 0.5mL上
柱，去离子水洗脱，流速 2mL/min，280nm波长检测，
收集各峰冷冻干燥，进行 A C E 抑制活性检测。
1.2.3 反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离纯化
用 20%的 B 液(含 0.1% TFA的乙腈)平衡反相柱
(Microsorb-MV 100-5 C18)。将过层析柱分离出的活性组
分配成 50mg/mL样品溶液。将样品溶于A液(含体积分
数为 0.1% TFA的超纯水)，上样量为 20μL，用体积分
数为 5%～30%的B液梯度洗脱 40min，流速 0.5mL/min；
检测波长 220nm。
1.2.4 MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸电离飞行时
间质谱)分子质量分析
基质溶液的配制：基质α-CH-4-OH-肉桂酸(HCCA)
溶于 TA(0.1% TFA溶液:乙腈 =2:1，V/V)中，浓度为
0.1mol/L。取 5μL样品溶液和 5μL基质溶液混合均匀，
取 1μL 混合液滴于样品板上，在室温下晾干，待生成
均匀结晶后送至Reflex Ⅲ MALDI-TOF质谱仪中，采用
反射模式，离子源加速电压为 20kV，延时取出电压为
16.3kV，反射电压为 23kV，N2激光波长 337nm，真空
度 1.2× 10-5Pa，质量扫描范围为 500～1500D，用标准
Mark峰作为外标校正质谱峰，正离子谱检测。对肽质
量指纹图谱进行标峰，得质谱分析数据。
1.2.5 ACE抑制活性的测定
根据Cushman紫外分光光度法基本原理进行改进。
在 2mL的离心管中混合50μL抑制剂和 200μL 0.005mol/L
HHL(溶于含 0.3mol/L NaCl的硼酸缓冲液，pH8.3)；37℃
恒温水浴预热5min，然后加入50μL 0.4U/mL自制的ACE
启动反应，37℃恒温保持 30min，加入 0.2mL 1mol/L的
盐酸终止反应；加入 1.2mL冰冷的乙酸乙酯，用力振荡
混合，3500r/min离心 5min后，取出 0.8mL酯层移入试
管中，在 85℃的烘箱中烘干(约 1h)，再加入 4mL的去
离子水振荡 2min溶解马尿酸，溶液在 228nm波长处测
定吸光度 A；对照组除不加入抑制剂、空白组除在反应
前先加入 0.2mL 1mol/L的盐酸以终止反应外，其余操作
与反应管完全相同。
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Aa－Ab
抑制剂对ACE活性的抑制率 /%=————× 100

Aa
式中：Aa为对照组的吸光度；Ab为样品组的吸光度。
半数抑制浓度(IC 50)：指当抑制率为 50%时，所需
抑制剂的质量浓度 /(mg/mL)，IC50值越小说明抑制剂活
性越大。计算方法为：检测多个质量浓度梯度下降血压
肽的抑制率，通过 SPSS软件的概率系统(Probit)分析获
得 I C 5 0 值。
2 结果与分析
2.1 坛紫菜降血压活性肽的粗分离
坛紫菜经AS.1398中性蛋白酶酶解后，酶解产物依
次通过截留分子质量为 8000D和 2000D的超滤膜，得 3
个组分，各组分抑制 ACE活性的 IC 50结果见表 1。从
表 1 可以看出，组分Ⅱ和Ⅲ的 IC 50 均小于酶解产物的
IC50，组分Ⅲ的 IC50最小，为 0.73mg/mL，约为酶解产
物 IC 50的 1/2，说明经过超滤分离，坛紫菜酶解产物中
具有活性的降血压肽得到浓缩，集中分布于分子质量小
于 2000D的范围。
组分 酶解产物 Ⅰ(M＞8000D) Ⅱ(2000D＜M＜8000D) Ⅲ(M＜2000D)
IC50/(mg/mL) 1.27 2.02 1.09 0.73
表 1 超滤对紫菜降血压肽活性的影响
Table 1 AC-inhibitory IC50 of hydrolyzed Porphyra haitanesis and its
ultra-filtration fractions
图 1中组分 A B C D E F G H I
IC50/(mg/mL) 9.61 7.46 6.63 4.49 0.67 1.37 0.93 5.34 13.65
表 2 Sephadex G-15层析分离组分的 ACE抑制活性
Table 2 AC-inhibitory IC50 of Sephadex G-15 separated peaks 图 2中峰号 1 2 3 4 5 6 7 8
抑制率 /% 6.84 6.51 20.09 31.33 72.51 89.54 65.16 61.60
表 3 RP-HPLC分离组分 E的 ACE抑制活性
Table 3 ACE inhibition rate of various RP-HPLC separated fractions
of peak E
2.2 坛紫菜降血压肽凝胶层析分离纯化
胶层析柱分离，得 9 个组分 A、B、C、D、E、F、
G、H、I (图 1 )，每个峰抑制 A C E 的 IC 50 见表 2。其
中组分 E的 IC50最小，为 0.67mg/mL，反映了其ACE抑
制活性最高；其次是组分G，其 IC50为 0.93mg/mL。因
此说明Sephadex G-15凝胶层析柱将超滤后小于2000D的
组分进行了进一步的纯化，将组分 E 冷冻干燥备用。
2.3 坛紫菜降血压肽RP-HPLC分离纯化
将组分 E样品经RP-HPLC分离，洗下多个蛋白峰，
分别收集 8 个峰，标为 1、2、3、4、5、6、7、
8(图 2)，进行 ACE抑制活性测定，由于收集样品量少，
活性鉴定用抑制率表示，结果见表 3。从表 3可以看出，
峰 6对 ACE的抑制率最高，达到了 89.54%；其次是峰
5；峰 7和 8的抑制率均在 60%以上。说明RP-HPLC能
够进一步分离纯化组分 E。将峰 6再次进行RP-HPLC又
可洗出 2个峰(图 3)，说明经过一次 RP-HPLC还未能完
全纯化出单一组分的物质，需经过多次纯化。
2.4 坛紫菜降血压肽氨基酸组成及分子质量测定
经过HPLC分离到的峰 6测定其氨基酸组成，结果
图 1 Sephadex G-15层析分离结果
Fig.1 Sephadex G-15 separation profile
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
A
A
28
0n
m
时间 /h
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0
B
C
D
E
F G H I
图 2 组分 E的 RP-HPLC图谱
Fig.2 RP-HPLC chromatogram of Sephadex G-15 separated peak E
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
A
U
时间 /min
10 20 30 40
1
2 3
4
5
6
7 8
图 3 峰 6的 RP-HPLC图谱
Fig.3 Second RP-HPLC chromatogram of RP-HPLC separated peak
No.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
A
U
时间 /min
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
将组分Ⅲ配成 0.5g/mL溶液，进行 Sephadex G-15凝
2011, Vol. 32, No. 02 食品科学 ※分析检测216
见表 4。可以看出，氨基酸总量为 66.09mg/100mL，其
中以酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)和缬氨酸(Val)为主，
三者含量占了 80.6%。
峰 6进行MALDI-TOF-MS分析获得其质量指纹图
谱，截取出峰较为集中的m/z范围(600～1200)反射图谱
(如图 4所示)。图谱中有 8个主要的质子峰，其中有 4个
峰聚集在m/z 860左右，信号最强的质子峰m/z 861.17；
其余的 4个质子峰m/z 694.03、747.30、952.25、1078.05。
说明峰6中还含有8种以上的单质，其中分子质量为860D
左右的物质含量居多。
氨基酸 Asp Thr Ser Glu Gly Ala Cys Met Ile Leu Tyr Phe Lys Arg Pro Val
含量 /(mg/100mL) 1.27 0.90 1.35 1.15 2.06 2.07 1.56 0.02 0.45 0.59 25.32 14.41 0.24 0.49 0.66 13.55
总量 /(mg/100mL) 66.09
表 4 氨基酸组成测定结果
Table 4 Amino acid profile of peak No. 6
据已有的研究表明，具有活性的降血压肽分子质量
均在 1000D左右。张宇昊等[20]采用超滤技术对花生降血
压肽进行分离发现分子质量小于 1000D 的组分对抑制
ACE IC 50为 0.4mg/mL。本实验选取截留分子质量为
2000D和 8000D的醋酸纤维素超滤膜对紫菜酶解产物进
行分离，发现各组分抑制 ACE的活性随分子质量的减
小而增大。小于 2000D 的组分抑制活性最大，IC 50为
0.73mg/mL，而超滤前酶解产物的 IC 50 1.27mg/mL。
Sephadex G-15分离组分 E IC50为 0.67mg/mL；组分A和
Ⅰ的活性很低，可能是因为组分 A 分子质量较大，可
能大于 150 0D，而组分 I 分子质量则偏小。因此，推
断降血压肽对分子质量的要求有一定的范围。采用 RP-
HPLC进一步分离纯化，但由于制备型色谱收集的量甚
少，浓度很低，不能采用冷冻干燥浓缩测定抑制 AC E
的 IC 50，因此，氮吹浓缩后采用对 ACE的抑制率为指
标，测定峰 6对 ACE的抑制率为 89.54%；再次经 RP-
HPLC还可形成 2个峰，并非单一组分。说明RP-HPLC
对于极性不同的物质起分离作用，可能存在 1个洗脱峰
中含有极性相同的多种物质的情况，所以RP-HPLC还不
能完全达到分离纯化单一物质的效果。
测定峰 6主要氨基酸有 Tyr、Val和 Phe，分子质
量集中在 860D左右。根据蛋白质分子质量 =氨基酸相
对平均分子质量× n－ 18×(n－ 1)；(n：氨基酸数目)，
计算得 n=6.16，3种氨基酸相对分子质量分别为Val(V)：
117.1 5；Tyr (T)：181 . 19；Phe (P)：165 . 19。因为
860－V－T－ P=396.47，2V+P=399.49，推测紫菜降血
压肽含有 3个 Val，2个 Phe，1个 Tyr。根据 Cheung
等[21]提出的降血压肽模型学说，多肽的C端氨基酸为芳
香族氨基酸(包括 Trp、Tyr、Phe)和 Pro时，降血压肽
的 ACE抑制活性较高；而 N 端氨基酸为疏水性氨基酸
(如 Val、Leu、Ile)或碱性氨基酸时与 ACE的亲和力较
强，抑制活性较高[2 2]，确定坛紫菜降血压肽的 N 端为
Val；C端为 Tyr或 Phe。由于 N端为Val，其他 5个氨
基酸进行排列组合计算，序列可能有 C 42·C 31·C 22=18
种排列顺序。具体属于哪一种顺序的降血压肽，还有
待于下一步研究。
3 结 论
采用 AS.1398中性蛋白酶酶解制备坛紫菜 ACE抑
制肽，经过超滤膜、Sephadex G-15凝胶层析和反相
高效液相色谱(RP-HPLC)分离纯化，获得纯化产物峰 6
对 A C E 的抑制率为 8 9 . 5 4 %，平均分子质量大约为
860D，由 3 个 V a l、2 个 Ph e、1 个 Ty r 组成，N 末
端为 Val，推算出紫菜降血压肽含有可能的排序顺序有
18种，为人工合成 ACE抑制肽新型降血压药物提供了
科学依据。
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图 4 峰 6的 MALDI-TOF-MS图谱
Fig.4 MALDI-TOF/MS spectrum of peak No. 6
11000
10000
9000
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
丰
度
m/z
700 800 900 1000 1100 1200
69
4.
03
46
74
7.
29
93
84
5.
17
14
86
1.
16
67
86
7.
07
64
87
7.
10
38
95
2.
24
58
10
78
.0
50
6
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