全 文 ： 2011, Vol. 32, No. 23 食品科学 ※生物工程186
蚕蛹蛋白酶解产物体外抗氧化和降血压活性
筛选及响应面工艺优化
赵钟兴 1，廖丹葵 1，孙建华 1，黄科林 2，孙果宋 2，秦伟嘉 1，吴志洪 2，童张法 1 , *
(1.广西大学化学化工学院，广西石化资源加工及过程强化技术重点实验室，广西 南宁 530004；
2.广西化工研究院，广西 南宁 530004)
摘 要：以蚕蛹蛋白为原料，使用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶对其进行酶解，采用 1,1-
一苯基 -2-三硝基苯肼自由基(DPPH自由基)法、超氧阴离子自由基(O2－·)法、羟自由基(·OH)法和血压紧张素转
化酶(ACE)法对酶解产物进行抗氧化和降血压活性分析，筛选同时具有较强抗氧化和降血压活性的酶解产物，并确
定获得较强活性时的水解度，再通过响应面对该水解度下酶解工艺条件进行优化。结果表明：碱性蛋白酶在水解度
为20%左右时获得的水解产物抗氧化和降血压效果较好，并由响应面分析结果表明酶解温度和加酶量之间存在显著的
交互作用，同时得到最佳酶解工艺条件为：酶解温度 51℃，pH值为 9.05，加酶量为 0 .38%，酶解时间 3h，在
此条件下，水解度为 20.53%，再通过实验验证其误差值小于 5%，说明采用响应面试验设计方法对蚕蛹蛋白酶解体
系进行优化具有较好的可靠性。此时酶解产物的DPPH自由基抑制率为 51.2%，ACE抑制活性为 50.3%。
关键词：蚕蛹蛋白；抗氧化肽；降血压肽；响应面；水解度
Screening for Optimal Enzyme for Preparation of Silkworm Pupae Protein Hydrolysate with in vitro Antixodiant
and Antihypertensive Activities and Process Optimization by Response Surface Methodology
ZHAO Zhong-xing1，LIAO Dan-kui1，SUN Jian-hua1，HUANG Ke-lin2，SUN Guo-song2，QIN Wei-jia1，
WU Zhi-hong2，TONG Zhang-fa1,*
(1. Guangxi Key Laboratory of Petrochemical Resources Processing and Process Intensification Technology,
School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China；
2. Guangxi Research Institute of Chemical Industry, Nanning 530004, China)
Abstract ：In the present study, silkworm pupae protein hydrolysates at different degree of hydrolysis were prepared with
alcalase, papain, trypsin, and bromelain, respectively and their scavenging activity against DPPH, superoxide anion and hy-
droxyl free radicals and antihypertensive activity were comparatively determined, with the result that hydrolyzing silkworm
pupae protein by alcalase to a degree of hydrolysis (DH) of 20% yielded a hydrolysate with better antixodiant and antihyper-
tensive activities. Three main process conditions for the hydrolysis of silkworm pupae protein by alcalase, including temperature,
pH and enzyme dosage were further optimized using response surface methodology. The results of response surface analysis
indicated that temperature and enzyme dosage had a significant interactive effect on the hydrolysis of silkworm pupae protein
and that the optimal hydrolysis conditions for achieving 20% DH and minimizing costs were 51.0 ℃, pH 9.05 and 0.38%
enzyme/substrate ratio. Under these conditions, the experimental DH was 20.53%, with an error of less than 5% as compared
with the predictive value, and the DPPH radical scavenging rate and ACE inhibitory rate of the obtained hydrolysate were
51.2% and 50.3%, respectively.
Key words：silkworm pupae protein；antioxidant peptide；ACE inhibitory peptide；response surface methodology；
degree of hydrolysis
中图分类号：Q566.3 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2011)23-0186-06
收稿日期：2011-01-27
基金项目：广西自然科学基金项目(2010GXNSFA013058)；广西研究生教育创新计划资助项目(105930901005)；
广西大学科研基金资助项目(XGL090021)
作者简介：赵钟兴(1979—)，男，讲师，博士研究生，研究方向为生物化工。E-mail：zzxx@gxu.edu.cn
*通信作者：童张法(1963—)，男，教授，博士，研究方向为化工分离与耦合。E-mail：zhftong@sina.com
187※生物工程 食品科学 2011, Vol. 32, No. 23
蚕蛹是养蚕业主要的副产物，蚕蛹蛋白质量占干蚕
蛹质量的 45%～50%[1]。蚕蛹蛋白质经测定含有 18种人
体所需的氨基酸，其中 8种人体必需氨基酸含量占氨基
酸总量 40%以上，这 8种人体必需氨基酸含量大约是猪
肉的 2 倍，牛奶和鸡蛋的 4 倍，且比例适当，超过了
联合国粮农和世界卫生组织(FAO&WHO)规定的 36%的
标准，是一种优质的蛋白源 [ 2 ]。但长期以来，蚕蛹大
多作为鱼、鸡、鸭、猪等的饲料，利用价值低 [ 3 - 4 ]。
随着生物技术和营养学的发展，发现分子质量介于蛋
白质和氨基酸的多肽具有极强的生物活性。从目前的
文献报道来看，已发现蚕蛹蛋白酶解后的多肽具有抗
氧化 [5 ]、抗疲劳[6 ]、降血压[7 ]、提高免疫力[8 ]和抑制癌
细胞扩散[9]等作用，但缺少对其酶解产物的多功能性综
合分析和工艺优化。本研究以蚕蛹蛋白为原料，采用
碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶等
4种蛋白酶对蚕蛹蛋白进行酶解，以清除DPPH自由基、
O 2
－·、·OH 为抗氧化性指标和 ACE抑制活性作为降血
压指标，筛选同时具有较强抗氧化和降血压活性的酶
解产物，并确定获得较强活性时的水解度，再以水解
度为检测指标通过响应面对该水解度下工艺条件优化用
以获得最佳经济效益，以期为蚕蛹的深加工综合利用
及抗氧化肽和降血压肽的广泛应用提供理论依据和实验
基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
蚕蛹蛋白粉为实验室自制，蛋白含量 85 .12%。
碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶 南宁庞博生物有限公
司惠赠；木瓜蛋白酶 广州远天酶制剂厂；胰蛋白酶
上海源聚生物科技公司；1 , 1 - 二苯基 - 2 - 三硝基苯肼
(DPPH)、血管紧张素转化酶(ACE)、马尿酰组氨酰亮氨
酸(HHL)、马尿酸(HA) 美国 Sigma公司；其他试剂均
为分析纯。
1.2 仪器与设备
1200高效液相色谱仪、Hypersil ODS-C18色谱柱 美
国 Agilent公司；510型 pH计 新加坡 Eutech公司；
4K15冷冻离心机 美国 Sigma公司；冷冻干燥器系统
美国Labconco公司；UV-2501紫外 -可见分光光度计 日
本 Shimadzu公司。
1.3 方法
1.3.1 分析方法
1.3.1.1 水解度(DH)测定
采用 pH-stat方法测定水解度[10]。

V×c 1 1
DH＝——— — —×100 (1)

mp α ht
式中：V为消耗 NaOH溶液体积 /L；c为 NaOH溶
液浓度 /(mol/L)；mp为蚕蛹蛋白质量 /g；α为氨基酸平
均解离度；h t为蚕蛹蛋白肽键总数，为 7.70mmol/g [11]。
1.3.1.2 抗氧化活性测定
抗氧化活性测定采用O2－·抑制率[12]、DPPH自由基
抑制率[13-14]及·OH抑制率[15]3种方法综合考虑酶解产物
抗氧化性能。
ΔA0－ΔA1
O2
－·抑制率 /%＝—————× 100 (2)
ΔA0
式中：ΔA 0 为邻苯三酚自氧化速率；ΔA 1 为添加
样品氧化速率；测定波长为 3 18 nm。

Ai－Aj
DPPH自由基抑制率 /%＝(1－————)× 100 (3)

Ac
式中：Ai为样品对DPPH自由基作用后于 509nm波
长处的吸光度；A j为样品自身于 509nm 波长处的吸光
度；A c为 DPPH自由基自身于 509nm波长处的吸光度。

Aa－Ab
·OH抑制率 /%＝————× 100 (4)

Ad－Ab
式中：A a为样品于 517nm波长处的吸光度；A b为
损伤管于 5 1 7 n m 波长处的吸光度；A d 为未损伤管于
517nm波长处的吸光度。
1.3.1.3 降血压活性测定
采用Matsui等[16]根据 Cushman等[17]检测原理改进的
方法检测酶解产物 ACE 抑制活性。

Ae－Af
ACE抑制率(IP)/%＝————×100 (5)

Ae
式中：Ae为空白样中马尿酸的峰面积 /(mAU·min)；
A f加入样品后马尿酸的峰面积 /(mAU·min)。
1.3.2 蚕蛹蛋白酶解液的制备
酶种类 pH 酶解温度 /℃ 酶活力 /(U/g)
碱性蛋白酶 9.5 45 400000
木瓜蛋白酶 7.0 50 250000
胰蛋白酶 8.0 40 210000
菠萝蛋白酶 7.0 50 65000
表 1 4 种蛋白酶最适酶解条件
Table 1 Optimal reaction conditions of alcalase, papain, trypsin and
bromelain
选用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝
蛋白酶 4 种酶进行酶解，其最佳酶解条件见表 1。蚕蛹
蛋白酶解液的制备条件为 4.00g蚕蛹蛋白粉，200mL蒸
馏水，加酶量为反应蛋白质量的 1%，在各蛋白酶最适
条件下，滴加 NaOH 溶液维持 pH 值恒定，每隔 1h 取
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样一次，离心冷冻干燥备用。酶活力测定参照 S B / T
10 31 7 — 19 99《蛋白酶活力测定法》。
1.3.3 响应面试验
在前期研究[18-19]的单因素多水平分析基础上，采用
响应曲面 Box-Behnken分析方法优化最佳蛋白酶水解工
艺条件，以 D H 为响应指标(Y )，以酶解温度(x 1)、p H
值(x 2)、加酶量(x 3)三因素为自变量进行试验，共 17 个
试验点，其中 1 2 个分析因子，5 个中心点估计误差。
影响因素水平及编码见表 2。每次实验重复两次，结果
取平均值。
编码
因素
x1酶解温度 /℃ x2 pH x3加酶量 /%
－ 1 35 8.5 0.3
0 45 9.5 0.7
1 55 10.5 1.1
表 2 Box-Behnken试验因素水平及编码设计
Table 2 Factors and their coded and actual levels involved in Box-
Behnken experimental design
2 结果与分析
2.1 蚕蛹蛋白酶解产物抗氧化活性和降血压活性的筛选
2.1.1 酶解产物对 O 2－·抑制率的影响
邻苯三酚自氧化过程为链式反应，在自氧化过程中
可产生 O 2－·。在 pH ＜ 9.0时，邻苯三酚自氧化速率与
生成的 O 2－·的量呈正相关，可通过紫外分光光度法定
量测定抗氧化剂在此体系中对 O 2－·的清除作用，间接
评价抗氧化剂的抗氧化能力，不同酶解产物 O 2－·抑制
率结果见图 1。
由图 1 可知，不同蛋白酶的酶解产物对 O 2－·清除
能力有较大的差异，未酶解的蚕蛹蛋白几乎没有清除能
力，木瓜蛋白酶水解 5h后抑制率可达到 10.11%，碱性
蛋白酶水解 5h后清除活性达到 6.55%，菠萝蛋白酶和胰
蛋白酶在整个酶解过程中的清除活性都很小。
2.1.2 酶解产物对DPPH自由基抑制率的影响
由图 2 可知，蚕蛹蛋白酶解产物具有较强的清除
DPPH自由基能力，其中碱性蛋白酶水解 2h后的抑制率
达到 52.50%，木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和胰蛋白酶的
最大抑制率分别为 42.53%、40.67%和 42.13%。
2.1.3 酶解产物对·O H 抑制率的影响
由图 3可知，碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解产物
具有一定的·OH 抑制活性，并分别在 4h 和 6h 时抑制
率达到最大值，分别为 14.75%和 13.55%。
2.1.4 酶解产物降血压活性测定
图 1 不同酶解产物清除 O 2－·的效果比较
Fig.1 Comparison of superoxide anion radical scavenging activity of
silkworm pupae protein hydrolysates prepared with different proteases
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
O
2－ ·
抑
制
率
/%
时间 /h
0 1 2 3 4 5 6 7 8
菠萝蛋白酶
碱性蛋白酶
胰蛋白酶
木瓜蛋白酶
图 2 不同酶解产物清除 DPPH 自由基的效果比较
Fig.2 Comparison of DPPH radical scavenging activity of silkworm
pupae protein hydrolysates prepared with different proteases
70
60
50
40
30
20
10
0
D
PP
H
自
由
基
抑
制
率
/%
时间 /h
0 1 2 3 4 5 6 7 8
菠萝蛋白酶
碱性蛋白酶
胰蛋白酶
木瓜蛋白酶
图 3 不同酶解产物清除·O H 的效果比较
Fig.3 Comparison of hydroxyl radical scavenging activity of silkworm
pupae protein hydrolysates prepared with different proteases
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
·
O
H
抑
制
率
/%
时间 /h
0 1 2 3 4 5 6 7 8
菠萝蛋白酶
碱性蛋白酶
胰蛋白酶
木瓜蛋白酶
100
80
60
40
20
0
A
C
E
抑
制
率
/%
时间 /h
0 1 2 3 4 5 6 7 8
碱性蛋白酶
菠萝蛋白酶
木瓜蛋白酶
胰蛋白酶
图 4 不同酶解产物 ACE抑制活性的比较
Fig.4 Comparison of ACE-inhibitory activity of silkworm pupae
protein hydrolysates prepared with different proteases
189※生物工程 食品科学 2011, Vol. 32, No. 23
血管紧张素转化酶(ACE)是导致体内血压升高的主要
因素，ACE能酶解马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL)生成马尿
酸(Hip)和二肽(HL)，降血压肽能作为抑制剂(ACEⅠ)抑
制该反应的发生，并且ACEⅠ的加入量与Hip的生成量
呈一定关系。图 4为不同酶解产物 ACE抑制活性结果。
从图 4 可以看出，未酶解的蚕蛹蛋白没有 ACE 抑
制活性，酶解后 4种酶解产物的ACE抑制活性排序为胰
蛋白酶＞碱性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞菠萝蛋白酶，其中
胰蛋白酶的 ACE抑制活性最高，碱性蛋白酶效果次之。
从图 1～3 可知，4 种酶解产物对 O 2－·和·O H 清除效
果一般，而对 DPPH自由基有较好的清除效果，对 4种
酶解产物的抗氧化活性进行排序，结果为碱性蛋白酶＞
木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶＞菠萝蛋白酶。综上，由于胰
蛋白酶的抗氧化活性较弱，不符合筛选要求而被排除，
最终选择碱性蛋白酶作为最佳蛋白酶。
2.1.5 水解度与抑制活性的关系
从图 2、4 的碱性蛋白酶分析结果可以看出在整个
酶解过程中，酶解产物都存在抗氧化和降血压活性。由
于实验的目标是筛选同时具有较强抗氧化和降血压活性
的酶解产物，所以将抗氧化活性和降血压活性的平均值
DPPH自由基抑制率 +ACE抑制率)作为抑制活性的指标
(简称综合抑制活性)与水解度进行对比，确定获得较高
综合抑制活性时的水解度范围。
图 5 蚕蛹蛋白水解度与其酶解产物抑制率的关系
Fig.5 Time course of alcalase-catalyzed hydrolysis of silkworm pupae
protein
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
综
合
抑
制
活
性
/%
时间 /h
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
综合抑制活性
水解度
30
25
20
15
10
5
0
水
解
度
/%
由图 5可知，综合抑制活性随酶解时间的增加呈先
增大后减少再增加的变化趋势，在水解度为 20%(酶解
2h)和 27%(酶解 7h)左右时的酶解产物分别达到最大抑制
活性。说明在酶解初始阶段，随酶解时间增加具有
DPPH 自由基和 ACE 抑制活性的多肽增多，但随水解
度加深，部分有生物活性的多肽不断被裂解导致酶解
产物抑制活性下降。而在酶解 7h 后综合抑制活性又上
升，这是由于 A C E 抑制肽多为分子质量较小的三肽、
四肽 [ 2 0 - 2 2 ]，随着酶解加剧有更多小肽分子生成，导致
ACE活性增加致使综合抑制活性加强所导致。综合考
虑酶解时间等因素的影响，最终选用水解度为 20%左
右时的碱性蛋白酶水解产物作为综合抑制活性最强产
物(其中为便于分析只采用 DPPH自由基抑制率作为抗
氧化指标 )。
2.2 酶解工艺条件优化试验
应用碱性蛋白酶水解蚕蛹蛋白，在水解度为 20%左
右时酶解产物的抗氧化和降血压活性效果最好，但在前
面的实验过程中并没有对酶解工艺条件进行优化，通过
响应面优化试验可以考察加酶量、酶解温度和 pH 值等
因素对水解度的影响，以期获得更经济的工艺条件。
2.2.1 响应面试验结果
对应变量 Y 和自变量 x 1、x 2、x 3，应用最小二乘
法假设拟合二次多元回归方程(模型)为：Y＝ A0＋ A1x1＋
A2x2＋ A3x3＋ A12x1x2＋A13x1x3＋A23x2x3＋A11x12＋A22x22＋
A 33x 32。为求次方程各项系数，利用统计软件 D e s i g n -
Expert 7.0.1进行试验设计。
2.2.2 回归方程的建立及方差分析
试验号 x1 x2 x3
Y DH/%
实际值 预测值
1 － 1 － 1 0 16.55 16.09
2 1 － 1 0 24.01 24.22
3 － 1 1 0 18.17 17.96
4 1 1 0 25.66 26.12
5 － 1 0 － 1 11.32 11.97
6 1 0 － 1 21.98 21.96
7 － 1 0 1 23.21 23.24
8 1 0 1 30.18 29.54
9 0 － 1 － 1 13.98 13.79
10 0 1 － 1 15.51 15.08
11 0 － 1 1 22.19 22.62
12 0 1 1 24.91 25.10
13 0 0 0 22.07 21.72
14 0 0 0 2.79 21.72
15 0 0 0 21.33 21.72
16 0 0 0 21.46 21.72
17 0 0 0 21.95 21.72
表 3 Box-Behnken试验设计方案和结果
Table 3 Box-Behnken experimental design and results
按照表 2的设计方案利用 Box-Behnken方法得到的
结果如表 3 所示。对表 3 中数据进行方差分析、参数
估计及显著性检验，具体结果见表 4，并通过回归分
析，得二次多元回归方程(模型)为：Y ＝－ 141.61 －
0.29x1＋ 30.29x2＋ 23.83x3＋ 0.00075x1x2－ 0.23x1x3＋
0.0095x12－ 1.57x22－ 6.24x32。
由表 4可知，所得水解度(Y)的回归方程极显著(P＜
0.0001)，失拟项 F检验不显著(P＝ 0.0588＞ 0.05)，说
明回归方程的拟合程度较好且模型调整确定系数 R2Adj为
0.9853，说明该模型能解释 98.53%响应值的变化，因
2011, Vol. 32, No. 23 食品科学 ※生物工程190
而实验误差小，说明该模型适合碱性蛋白酶 -蚕蛹蛋白
酶解体系中水解度的分析和预测。x 1、x 2、x 3、x 2 2、
x32对水解度的的影响极显著(P＜ 0.01)，二次项 x12和交
互项 x 1x3也对水解度有显著影响(P＜ 0.05)，而交互项
x1x2和 x2x3对水解度影响不显著(P＞ 0.05)，这表明响应
值的变化具有一定复杂性，各试验因素对响应值不是简
单线性关系，存在交互作用。
2.2.3 响应面分析
31
26
21
16
11
D
H
/%
x1温
度 /℃
1.10
0.90
0.70
0.50
0.30 35
40
45
50
55
x3加酶量 /%
图 6 酶解温度和加酶量交互影响水解度曲面图及其等高线图
Fig.6 Response surface and contour plots for the effects of temperature
and enzyme dosage on DH of silkworm pupae protein
1.10
0.90
0.70
0.50
0.30
x3
加
酶
量
/%
x1温度 /℃
35 40 45 50 55
DH/%
26.6067
23.6783
20.7500
17.8217
14.8933
由图 6 可知，随酶解温度增加，水解度不断增高，
这是因为在 35～55℃范围内，温度升高酶活不断增加的
缘故，而随加酶量增加，反应液中加酶量提高，单位
时间内可与酶结合生成[ES]中间体的数量提高，也会导
致水解度的增加。
2.2.4 最佳酶解工艺的确定和验证
因为实验的最终目标是获得具有较高抗氧化活性和
降血压活性并且水解度在 2 0 % 左右的酶解产物，通过
Design-Expert分析获得 30种能达到水解度 20%的解决方
案，再以生产成本最低化为筛选条件，把获得的解决
方案中各酶解条件按照加酶量＞ pH 值＞酶解温度的优
先顺序排序，最终确定最佳酶解工艺条件为：酶解温
度 51℃，pH值为 9.05，加酶量为 0.38%，酶解时间 3h。
再采用该最佳工艺条件进行实验验证，平行 3次实验取
平均值，得到水解度为 20.53%，与模型预测值和酶筛
选时的实验数据基本相符，说明回归方程可以应用于实
践。此时酶解产物 DPPH自由基抑制率为 51.2%、ACE
抑制活性为 50.3%。
3 结 论
以蚕蛹蛋白为原料，分别选用碱性蛋白酶、菠萝
蛋白酶、木瓜蛋白酶及胰蛋白酶进行水解，以 O 2－·、
DPPH自由基及·OH的抑制率和 ACE的抑制率作为抗
氧化活性和降血压活性的检测指标，发现碱性蛋白酶的
水解度在 20%左右时，其酶解产物同时具有较强的抗氧
化活性和降血压活性。
以水解度作为指标通过响应面试验设计，由显著性
检验分析表明酶解温度和加酶量之间存在显著的交互作
用，并且通过响应面分析获得具有较好的酶解工艺条
件：酶解温度 51℃，pH值为 9.05，加酶量为反应蛋白
质量的 0 .38%，酶解时间 3h，在此条件下，水解度为
20.53%，并通过实验验证其误差值小于 5%，说明采用
响应面试验设计方法对蚕蛹蛋白酶解体系进行优化具有
较好的可靠性。此时酶解产物的 DPPH自由基抑制率为
51.2%、ACE抑制活性为 50.3%。
参考文献：
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Aquaculture, 1997, 151(4): 37-45.
变异来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性
模型 339.31 9 37.70 120.69 ＜ 0.0001 **
x1 132.68 1 132.68 424.75 ＜ 0.0001 **
x2 7.07 1 7.07 22.63 0.0021 **
x3 177.66 1 177.66 568.74 ＜ 0.0001 **
x1x2 0.00 1 0.00 0.00 0.9793
x1x3 3.40 1 3.40 10.90 0.0131 *
x2x3 0.35 1 0.35 1.13 0.3224
x12 3.81 1 3.81 12.20 0.0101 *
x22 10.43 1 10.43 33.38 0.0007 **
x32 4.20 1 4.20 13.45 0.0080 **
残差 2.19 7.00 0.31
失拟项 1.79 3 0.60 5.96 0.0588
净误差 0.40 4 0.10 R2＝ 0.9936
总离差 341.49 16 R2Adj＝ 0.9853
表 4 回归方程方差分析表
Table 4 Variance analysis for the established regression model for DH
of silkworm pupae protein
注：*.差异显著(P＜ 0.05)；**.差异极显著(P＜ 0.05)。
191※生物工程 食品科学 2011, Vol. 32, No. 23
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