全 文 ：46 2014, Vol.35, No.22 食品科学 ※工艺技术
乙醇-硫酸铵双水相体系萃取坛紫菜多糖
张鉥孟，陈美珍*
（汕头大学理学院生物系，广东 汕头 515063）
摘 要：探究不同系线长度的乙醇-硫酸铵双水相体系对坛紫菜多糖萃取的影响。采用浊点滴定法绘制乙醇-硫酸铵
双水相相图，选取不同系线长度体系，测定其对紫菜多糖分配情况。结果表明：在乙醇质量分数27%、硫酸铵质量
分数18%（即系线长度为40）、体系相比R为1.1时，紫菜多糖的回收率可达79.8%，分配系数K为0.23；其蛋白去除
率明显高于传统醇沉法（双水相萃取多糖蛋白含量为1.20%，醇沉多糖蛋白含量为6.17%），且具有较好的脱色效
果，可用于紫菜多糖的分离纯化。
关键词：双水相；系线长度；坛紫菜；多糖
Extraction of Polysaccharides from Porphyra haitanensis Using Ethanol-Ammonium Sulfate Aqueous Two-Phase System
ZHANG Shu-meng, CHEN Mei-zhen*
(Department of Biology, College of Science, Shantou University, Shantou 515063, China)
Abstract: The effect of tie line length (TLL) of ethanol-(NH4)2SO4 aqueous two phase system (ATPS) on the extraction
of polysaccharides from Porphyra haitanensis was investigated. The phase diagram was obtained by cloud point titration,
and then different TLLs of ATPS were selected and partition coefficients of polysaccharides were detected. The yield
and partition coefficient of polysaccharides were 79.8% and 0.23, respectively, using a system consisting of 27% ethanol
and 18% (NH4)2SO4 (forming a TLL of 40) with a top/bottom phase volume ratio of 1.1. The removal rate of protein was
significantly higher than that reported with traditional ethanol precipitation method (1.20% vs 6.17%). Meanwhile, the
proposed method had good decolorization effect. Thus, it can be used for the separation and purification of polysaccharides
from Porphyra haitanensis.
Key words: aqueous two-phase system; tie line length (TLL); Porphyra haitanensis; polysaccharides
中图分类号：Q547 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）22-0046-04
doi:10.7506/spkx1002-6630-201422009
收稿日期：2014-05-08
基金项目：广东省科技计划项目（2013B0203012005）；汕头市科技计划项目（2011-156）；
2013年汕头大学实验教学示范中心项目
作者简介：张鉥孟（1988—），男，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：30434390@163.com
*通信作者：陈美珍（1956—），女，教授，本科，研究方向为活性物质研究与开发。E-mail：chenmz@stu.edu.cn
紫菜多糖属半乳聚糖硫酸酯，主要由半乳糖、3,6-内
醚半乳糖和硫酸基等组成，其基本结构单位为3-β-D-半乳
糖苷-1,4-α-L-3,6-内醚半乳糖组成的二糖[1-2]。紫菜多糖是
一种多组分的水溶性多糖，含有大量的酸性多糖，糖链
残基上不同程度地连接着硫酸根、甲氧基等基团[3-4]。研
究[5-9]表明紫菜多糖具有抗凝血、降血脂、抗氧化、抗衰
老、抗肿瘤和增强免疫功能等多种生物活性。多糖传统
提取工艺存在着操作繁琐、破坏多糖结构、多糖损失率
高、蛋白去除效果差等问题，因此，寻求一种高效、温
和、操作简便的方法显得至关重要。
双水相萃取技术是利用组分在两个互不相溶的水
相中的溶解度不同而达到分离的技术[10]。由于其具有高
效、温和、操作简便、容易放大、回收率高，不存在有
机溶剂残留及不会引起生物活性物质失活或变性等优点[11-13]，
现已广泛应用于生物、医学、环境科学等各大领域，如
抗生素分离、酶、蛋白质分离提纯和其他生物活性物质
萃取以及药物分析和金属分离等[14-16]。
聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-盐系统已用于
萃取芦荟、双孢菇、香菇、毛木耳以及葡萄籽多糖[17-21]，
同样也用于分离血红蛋白样品、人参皂苷、凝集素、结
构类似蛋白等其他物质[22-25]，但聚合物存在难以回收、
价格高等问题，于是醇-盐系统受到了人们的关注。有研
究[26-30]报道使用乙醇-盐系统萃取螺旋藻多糖、灵芝酸、
白藜芦醇、醌类化合物、重组人血清白蛋白等，而国内
外还未见有关于双水相萃取紫菜多糖的报道，因此采用
乙醇-硫酸铵这种廉价的双水相体系，探讨不同系线长度
※工艺技术 食品科学 2014, Vol.35, No.22 47
（tie line length，TLL）的体系对紫菜多糖萃取的影响，
以期建立萃取分离紫菜多糖的最佳工艺条件。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
市售坛紫菜购于汕头市。
苯酚、无水乙醇、硫酸铵、H3PO 4、浓硫酸（分
析纯） 西陇化工股份有限公司；KBr、考马斯亮蓝
G-250、牛血清白蛋白（分析纯） 美国Sigma公司。
1.2 仪器与设备
高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；
UV-2100C型紫外-可见分光光度计 美国Unico公司；
UV-1800PC型分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；
OSB-2100型旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司；DK-S22
型电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；IR200型
傅里叶变换红外光谱仪 美国Thermo Nicolet公司。
1.3 方法
1.3.1 乙醇-硫酸铵双水相相图绘制
参照文献[14,26]，采用浊点滴定法测定乙醇-硫酸铵
双水相相图中双节线的组成，反复重复操作并记录溶液
出现混浊（即转变为两相区）至溶液澄清（即单相）过
程中所加入的乙醇溶液和水的质量，并计算出各组分的
质量浓度，绘制相图。
1.3.2 半乳糖标准曲线绘制
精密称取20 mg干燥至恒质量的半乳糖标准品，配成
40 µg/mL的标准液。分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、
1.4、1.6、1.8 mL，各以蒸馏水补至2.0 mL，然后加入6%
苯酚1.0 mL及浓硫酸5.0 mL，混匀冷却，静置30 min以后
于490 nm波长处测量吸光度，以2.0 mL蒸馏水按同样显
色操作为空白，横坐标为半乳糖质量浓度，纵坐标为吸
光度，得标准曲线。
1.3.3 牛血清白蛋白标准曲线绘制
称取考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇
中，加入100 mL 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1 000 mL，
滤纸过滤得考马斯亮蓝溶液；结晶牛血清白蛋白预先经微
量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15 mol/L
NaCl配制成1 mg/mL牛血清白蛋白标准溶液。
分别加入0、10、20、30、40、50 µL标准蛋白溶
液，以蒸馏水补至50 µL，均加入2.5 mL考马斯亮蓝试剂
后混匀，5 min以后测量其吸光度，以吸光度为纵坐标，
蛋白质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。
1.3.4 紫菜多糖液的制备
采用热水浸提法[31]，温度80 ℃、料液比1∶40、时间
2 h。4 500 r/min，5 min 离心取上清液，得紫菜粗多糖
液，浓缩至1/3体积得浓缩液，置于4 ℃冰箱待用。
1.3.5 双水相萃取紫菜多糖体系的优化
根据乙醇-硫酸铵双水相相图，选取5 个不同体系测
定其对紫菜多糖分配的影响。预先配制质量分数为40%
的硫酸铵母液，然后按照表1配制100 g体系，置于分液
漏斗中振荡摇匀，静止一段时间使其分相完全后，测定
上下相体积并计算相比（R）；分别取上下相测定其多
糖和蛋白含量，计算紫菜多糖的分配系数（K）和收率
（Y）。参数计算见式（1）～（3）：
R˙ VϞVϟ （1）
K˙ ρкρл （2）
Y/%˙ RK1ˇRKh100 （3）
式中：R为上下相体积比；V上和V下分别为双水相体
系的上下相体积/mL；K为紫菜多糖在双水相体系中的
分配系数；ρ上和ρ下分别为紫菜多糖在双水相体系中上、
下相的质量浓度/（µg/mL）；Y为紫菜多糖在下相中的
收率。
表 1 乙醇-硫酸铵双水相体系
Table 1 Ethanol-ammonium sulfate aqueous two phase system
TLL 无水乙醇/g 多糖浓缩液/g 蒸馏水/g 40%硫酸铵/g
55 28.0 15 4.0 53.0
50 27.6 15 7.4 50.0
45 27.0 15 10.5 47.5
40 27.0 15 13.0 45.0
35 27.0 15 15.5 42.5
注：以上为100 g体系中各组分的质量。
1.3.6 双水相萃取和乙醇沉淀法的比较
取上述紫菜多糖浓缩液，分别采用优化后的双水相
体系和乙醇沉淀法[32]制备紫菜多糖并测定其多糖、蛋白
含量。双水相萃取的多糖液经4 ℃冰箱放置一段时间，结
晶析出大部分硫酸铵后再经透析、浓缩及真空冷冻干燥
后得样品。
1.3.7 紫外检测
配制1 m g / m L的多糖液，以蒸馏水为对照，于
200～400 nm进行全波段扫描，检测其是否有核酸、蛋白
特征吸收峰。
1.3.8 红外光谱分析
取多糖样品1～2 mg按1∶100比例与KBr研磨压片，以
KBr为参照物。用红外光谱仪测定，于400～4 000 cm－1
范围内进行扫描。
2 结果与分析
2.1 乙醇-硫酸铵双水相相图
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100 403020
10
0
50
40
30
20 ഛⳌऎঠ∈Ⳍऎ ঠ㡖㒓Э䝛䋼䞣ߚ᭄/% ⸿䝌䫉䋼䞣ߚ᭄/%
图 1 乙醇-硫酸铵双水相相图
Fig.1 Phase diagram of ethanol-ammonium sulfate aqueous two-phase system
由图1可知，乙醇与硫酸铵在较大质量分数范围内均具
有较好的成相能力，且必须保持一定的配比，质量分数过
大或过小均不能形成双水相体系，与文献[27]报道一致。
2.2 多糖及蛋白标准曲线
半乳糖标准曲线回归方程为：y=0.010 1x－0.013 8
（R2=0.995，y为半乳糖质量浓度/（µg/mL），x为吸光
度）；牛血清白蛋白标准曲线回归方程为：y=0.589 6x－
0.005 7（R2=0.999 4，y为蛋白质量浓度/（mg/mL），x为
吸光度）。
2.3 双水相体系优化结果
表 2 双水相体系萃取紫菜多糖结果
Table 2 Extraction of polysaccharides from Porphyra haitanensis by ATPS
TLL 相比（R） 多糖分配系数（K） 收率（Y）/%
55 1.1 0.52 63.2
50 1.1 0.84 51.8
45 1.1 0.80 52.9
40 1.1 0.23 79.8
35 1.2 0.89 48.1
注：以上为3 次重复实验结果平均值。
TLL
0.9
0.7
1.0
0.5
0.3
0.2
0.4
㊪㲟ⱑ
0.6
0.8
分
配
系
数
355055 45 40
图 2 蛋白及多糖分配系数图
Fig.2 Partition coefficient graphs of proteins and polysaccharides
静止分相后，上相颜色较深，为乙醇相；下相基本
透明，为盐相；表明色素在上相得到富集。由表2可知，
多糖均富集于下相，可能是由于上相乙醇质量分数高，
多糖更易分配于下相所致。以多糖回收率为主要指标同
时考察蛋白的分配情况，结果如图2及表2所示，得最优
体系为：乙醇质量分数27%、硫酸铵质量分数18%（即
TLL为40）。因此，乙醇-硫酸铵双水相体系萃取多糖的
同时兼有脱色素效果。
2.4 传统醇沉及双水相萃取紫菜多糖比较结果
传统醇沉法制备的样品中多糖含量为30.83%，蛋白含
量高达6.17%；而乙醇-硫酸铵双水相体系制备的样品中多
糖含量达90%以上，蛋白含量仅为1.20%。相比传统醇沉
法，乙醇-硫酸铵双水相体系具有较好的除蛋白效果。
2.5 紫外扫描结果
双水相萃取的紫菜多糖样品在260、280 nm波长处均
没有特征吸收峰，而传统醇沉的多糖在280 nm波长处有
吸收峰。
2.6 红外光谱结果
3 5004 000 2 000
3
54
8.
27
3
46
7.
89
3
41
3.
30
3
23
7.
07
3
23
7.
53
2
02
7.
20
2
02
7.
35
1
63
7.
91
1
61
7.
74
1
61
7.
66
1
63
7.
66
1
56
6.
66
1
13
7.
66
1
15
9.
05
1
07
4.
27
1
07
0.
93
87
5.
30 6
15
.7
0
47
6.
34
47
8.
20
61
7.
82
84
7.
67
1
55
3.
40
1
42
0.
65
1
42
2.
98
3
54
8.
53
3
46
8.
99
3
41
2.
88
2 500 1 0003 000 1 500 500
b
a
100ˉ40ˉ20060804020䘿ݹ⦷/% ⌒ᮠ/cmˉ1
a.醇沉法制备的多糖；b.双水相萃取的多糖。
图 3 多糖红外图谱
Fig.3 Infrared spectra of polysaccharides
由图3可知，两种多糖红外图谱基本一致，均含有多
糖类特征吸收峰，表明双水相萃取和传统醇沉法制得的
多糖结构一致。
3 结 论
本实验探究了紫菜多糖在乙醇-硫酸铵双水相体系中
的分配情况，实验结果表明：当乙醇质量分数27%、硫
酸铵质量分数18%时，多糖分配系数K为0.23，富集于下
相，收率Y可达79.8%。
在乙醇-硫酸铵双水相体系中，紫菜多糖更易分配
于下相，而色素等杂质在上相富集。相比传统醇沉法，
乙醇-硫酸铵双水相体系萃取的多糖样品中蛋白含量仅为
1.20%，具有较好的除蛋白效果及脱色素作用。因此，可
以利用其精制紫菜多糖，大大提高了多糖的纯度，具有
较好的应用价值。
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