全 文 ：【论著】
白黎芦醇对人皮肤成纤维细胞及
兔耳增生性瘢痕的影响
朱倩1 , 夏洪生2 , 张辛1 , 池晓霞1
【摘要】 目的 了解白黎芦醇对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖及兔耳增生性瘢痕的影响。方法 用 FCM 法检测
及建立兔耳增生性瘢痕动物模型 , 用不同浓度的白黎芦醇作用不同时间后 , 成纤维细胞的增殖指数及兔耳瘢痕增生指
数进行了研究。结果 ①随着白黎芦醇浓度增大和作用时间延长而人皮肤瘢痕组织成纤维细胞增殖指数呈下降趋势。
②白黎芦醇在 150 μmol/ L、 300 μmol/L、 400 μmol/ L 时能明显降低瘢痕增生指数 , 分别为对照组的 78.8%、 61.2%、
47.0%。结论 ①白黎芦醇降低成纤维细胞增殖指数是其抑制瘢痕增生的途径之一 , 且呈剂量时间依赖性。 ②随着白
黎芦醇浓度增大 , 兔耳瘢痕增生指数下降 , 与瘢痕的体外实验相吻合。
【关键词】 白黎芦醇;瘢痕;成纤维细胞;动物模型
Effect of Resveratrol on Human Scar Fibroblasts and Scar-derived Fibroblasts of Rabbit Ears ZHU Qian , XIA Hong -
sheng , ZHANG Xin , et al.The Second People s HOSpital of Shenzhen , Guangdong 518031 , China
【Abstract】 Objective To study the effects of resveratrol on viability of fibroblasts and scar-derived fibroblasts of rabbit ears.
Methods ①Various concentrations of resveratrol were added into the medium and co-incubated with FB for difierent time period.FCM
assay was employed to detect proliferation of fibroblast.②To find animal model , various concentrations of resveratrol were tested for hy-
pertrophic scar of rabbit ears. Results ①the data of the present study demonstrated that resveratrol in various concentrations inhibite
proliferation of fibroblast.②resveratrol in concentrations of 150、 300、 400 μmol/L inhibited index of hypertrophic scar.Compared with
controls , the index of hypertrophic scar were decreased by 78.8%、 61.2%、 47.0%. Conclusions Resveratrol may inhibit viabil-
ity of fibroblasts and there is a dose-time-effect trend.
【Key words】 Resveratrol;Scar;Fibroblasts;Animal model
病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩 , 其形成
是由于创伤愈合过程成纤维细胞合成胶原能力增强 ,
导致细胞外基质 (FCM)增多和过度沉积 , 胶原为其
主要成分〔1〕 。因此 , 从抑制成纤维细胞增殖和胶原代
谢的水平寻找治疗和预防瘢痕增生的方法是一重要途
径。本研究以人病理瘢痕体外培养的成纤维细胞和兔
耳增生性瘢痕为研究对象 , 研究白黎芦醇对人皮肤瘢
痕成纤维细胞和兔耳增生性瘢痕的影响 。
1 材料和方法
1.1 材料
实验所用标本取自 2004年 5 ～ 8月临床手术切除
的病理性瘢痕组织 , 伴有痒痛 、 增厚等增生活跃表
现。取材部位有颜面 、 四肢及前胸等 , 患者年龄 10
岁至 50岁 , 病程为 5个月至 24年 , 所有病例皆未接
受过抗瘢痕药物治疗 。
基金项目:深圳市科技局立项课题 (200405104)
作者单位:1.深圳市第二人民医院一门诊部 , 广东 518031;
2.深圳市中西医结合临床研究所
1.2 方法
1.2.1 原代和传代培养:于患者手术切除瘢痕同期
切取标本。将手术切取瘢痕组织约 2 ～ 3 mm3 , 去除
皮下脂肪和结缔组织 , 无菌条件下放入含 20% FBS
的 DMEM 培养液中 , 立即进行原代培养 , 约 3 ～ 4 周
后 , 即行传代 , 每 7 ～ 10 d 传代 1次 , 取第 3 ～ 18代
的成纤维细胞用于实验。
1.2.2 FCM检测白黎芦醇成纤维细胞周期〔2〕的影响:
不同浓度的白黎芦醇 (0 μmol/L 、 75 μmol/L 、 150
μmol/L 、 300μmol/L)作用不同时间 (0 h 、 24 h 、 48
h 、 72 h)的成纤维细胞 。用 FCM 在氩激光光源 、 激
发波长为 488 nm 、 变异系数小于 2%条件下检测细
胞核中 PI (增殖指数)荧光强度:
PI=(S+G2)/ (G1+S+G2)
1.2.3 兔耳增生性瘢痕动物模型的建立〔3〕:兔适应
性喂养 24 h , 用氯胺酮肌注麻醉 , 用量为 1 μg/kg 。
在兔耳双侧腹侧分别做 2 个边长为 1 cm 的正方形切
口 , 完整切除全层皮肤 , 直至软骨膜表面。用灼热铁
丝烧灼创缘四周皮肤 , 创面贴敷创可贴 。观察瘢痕形
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成情况 , 21 d 后将兔耳瘢痕随机分为 4组 , 每组 n=
12。分别于瘢痕内基底部及瘢痕灶内注射不同浓度的
白黎芦醇 (150μmol/L 、 300μmol/L 、 400 μmol/L)或
生理盐水 , 注射用量为 40 μl。继续喂养 , 28 d 后 ,
同样在麻醉条件下切取瘢痕组织标本于 4%甲醛固
定 , 石腊包埋 , 作 HE 染色。检测瘢痕增生指数 HI:
HI=SH/DH
SH 为瘢痕的高度 , DH 为正常的皮肤高度。
2 结 果
2.1 FCM 检测结果 (表 1)
表 1 不同浓度白黎芦醇对成纤维细胞周期的影响
浓度
(μmol/ L) G1(%) S(%) G2(%) PI(%)
0 58.20±1.05 18.81±3.14 21.38±2.27 40.89±0.88
75 75.60±2.01 8.62±0.86 14.62±1.39 22.86±1.69
150 87.58±0.36 5.10±0.19 8.01±0.21 12.71±0.27
300 95.13±0.22 2.19±0.78 9.11±0.67 5.60±0.38
注:经方差分析 , F=69.7, P<0.05。
可见随着白黎芦醇浓度增大成纤维细胞 G 期细
胞百分数增多 , 而 S 、 G 期的细胞含量逐渐减少且在
最高浓度 (300μmol/L)作用组出现凋亡。可见 , 随
着浓度增大而成纤维细胞增殖指数呈下降趋势。
表 2 150 μmol/ L白黎芦醇在不同时
相对成纤维细胞周期的影响
时间
(h) G1(%) S(%) G2(%) PI(%)
0 58.83±1.09 19.13±3.07 21.33±2.42 41.10±0.95
24 86.73±0.40 6.15±1.37 6.88±1.94 12.73±0.31
48 90.96±0.53 4.08±0.42 4.50±0.26 8.73±0.51
72 93.89±0.50 3.16±1.29 2.53±0.98 5.77±0.34
注:经方差分析 , F=2 654.7 , P<0.05。
表 2 结果显示随着白黎芦醇作用时间延长成纤
维细胞 G期细胞百分数增多 , 而 S 、 G 期的细胞含量
逐渐减少。在 72 h 作用组 , G 期细胞占总量的
(94.33 ±0.4)%, S 、 G/M 期 分别 为 (3.26 ±
1.28)%、 (2.43±0.94)%。G 期变异系数 (CV)也
增加 , 从对照组的 5.4 增加为 11.7。增殖指数呈下
降趋势。
2.2 白黎芦醇对增生性兔耳瘢痕的影响
表 3 结果显示白黎芦醇的浓度分别为 150 μmol/
L 、 300μmol/L 、 400μmol/L时 , 作用于兔耳瘢痕组织
7 d 后 , 瘢痕增生指数分别为 78.8%、 61.2%、
47.0%。采用方差分析和 q 检验 , 各剂量组与对照
组之间以及各剂量组之间差异均有统计学意义 (P <
0.01)。
表 3 兔耳瘢痕增生指数表
编号
(n=12) A 组 HI D 组 HI C组 HI D 组 HI
1 2.50 1.80 1.50 0.98
2 2.51 1.86 1.34 1.20
3 2.52 1.93 1.33 1.12
4 1.94 1.73 1.51 1.06
5 2.29 1.64 1.41 0.95
6 2.35 1.81 1.43 1.23
7 2.41 1.84 1.38 1.03
8 2.23 2.02 1.46 1.15
9 2.66 1.79 1.22 0.80
10 1.98 1.87 1.62 1.07
11 2.23 1.88 1.47 1.38
12 2.43 1.78 1.37 1.11
平均 2.32 1.83 1.42 1.09
注:A 为对照组 , B、 C 、 D 组分别为加入 150 μmol/ L 、
300μmol/ L 、400μmol/L 白黎芦醇 , 与对照组相比 , P<0.01。
3 讨 论
创面成纤维细胞的过度增殖以及大量胶原蛋白的
合成是病理性瘢痕形成的重要基础 , 从抑制成纤维细
胞增殖和胶原代谢的水平寻找治疗和预防瘢痕增生的
方法是一个重要途径 。可以认为 , 能够对过度增生的
成纤维细胞和胶原合成有制约作用 , 是任何一种成功
疗法的关键所在 。白黎芦醇是一种天然活性成分 , 广
泛存在于各种活血化瘀类中药中 , 目前至少在虎杖 、
葡萄等 21 个科 、 31 个属的 72 种植物中发现有白黎
芦醇活性成分存在〔4 , 5〕 。它具有抗肿瘤及增生性疾病
的作用 , 且其药效强 , 副作用小。研究表明它能通过
多种途径抑制细胞增殖 , 诱导凋亡 , 并因此起到抗肿
瘤及增生性疾病的作用〔6〕 。我们已经应用 MTT 检测
法和 mRNA 原位杂交法研究了白黎芦醇对成纤维细
胞增殖 、 胶原代谢以及Ⅰ 、 Ⅲ型前胶原基因表达的影
响 (另文介绍), 已经证实白黎芦醇对人瘢痕组织成
纤维细胞增殖以及 Ⅰ 、 Ⅲ型前胶原 mRNA 有明显抑
制作用 , 本研究进一步通过 FCM 来检测受白黎芦醇
作用后瘢痕成纤维细胞的细胞周期和凋亡的变化 。
FCM 的原理是根据细胞 DNA 双链能与某些荧光
物质 (如 PI 、 EB等)结合 , 且荧光强度与 DNA 含量
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相关 , 因而可以对单个细胞进行 DNA 含量测定 , 从
而对细胞周期 、 DNA 非整倍体进行研究。FCM 检测
技术具有不受细胞分裂相多少的影响等优点 。研究表
明 , 不同浓度白黎芦醇分别处理成纤维细胞 24 h ,
150μmol/L 浓度分别处理 24 h 、 48 h 、 72 h 后 , 随着
用药浓度的增加和作用时间的延长 G1期细胞数量增
多 , S 、G2期细胞含量逐渐减少 (P <0.01), 且在最
高浓度组上出现凋亡峰。MTT 和 FCM 检测均证实白
黎芦醇能抑制成纤维细胞增殖 , 且随着浓度增加和作
用时间延长 , 其抑制率越高。由于白黎芦醇是从多种
可食用天然植物中提取出来的 , 毒副作用小 , 因而白
黎芦醇可望发展成为一种临床治疗病理性瘢痕的
药物 。
以往对病理性瘢痕的研究手段 , 主要有 3 种途
径:一是瘢痕的组织学 , 特别是通过细胞培养 , 尤其
是成纤维细胞培养技术;二是将人的病理性瘢痕组织
移植到裸鼠的皮下 , 期望在不被排斥的情况下研究有
关因素对瘢痕组织作用产生的变化;三是通过药物临
床实践来总结有关防治瘢痕的经验〔7〕。这些方法已经
取得了巨大的成绩。然而 , 没有动物本身产生的瘢痕
模型 , 已经成为更深入地研究瘢痕发生发展及其转归
的重大缺憾 !本实验成功地建立兔耳瘢痕动物模型 ,
使瘢痕防治的研究手段进入了新阶段 , 对于瘢痕的研
究产生重大的影响。本实验结果显示 , 白黎芦醇的浓
度分别为 150 μmol/L 、 300 μmol/L 、 400 μmol/L 时 ,
作用于兔耳瘢痕组织 7 d 后瘢痕增生指数分别为
78.8%、 61.2%、 47.0%, 与生理盐水对照组间差异
有统计学意义。这与瘢痕的体外实验结果相吻合 。
参 考 文 献
〔1〕 Kielty CM , Hopkinson I , Grant ME.The collagen fami ly:structure ,
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and its Heritable Disorders.New York:Wiley Liss , 1999.103-147.
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版社 , 2000.171-172.
〔3〕 Morris DE , Wu L , Zhao LL , et al.Acute and chronic animal models
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〔4〕 姜会庆 , 陈一飞 , 汪涌 , 等.丹参素对成纤维细胞生物学作用
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〔6〕 Ahmad N , Adhami VM , Aftaq F , et al.Resveratrol causes WAF-1/
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7:1466-1473.
〔7〕 李会元.建立增生性瘢痕动物模型.第四军医大学学报 , 1998 ,
19:655-657.
(收稿日期:2005-10-10)
【基层园地】
博乐地区农村医疗机构消毒卫生状况监测报告
宋咏凤 , 陶晓燕 , 古丽 , 张文芹
随着社会的发展和医疗卫生改革的深入 , 农村医疗机构
日益庞大。但由于医疗队伍人员素质参差不齐 , 设备 、 环境
相对滞后 , 卫生状况存在巨大隐患。为了解博乐地区农村医
疗机构卫生现状 , 我们于 2003 年 4～ 10 月对本区 5 个乡 、 镇 、
场 145 个卫生院 、 所消毒卫生状况进行监测 , 结果如下。
1 对象和方法
针对博乐辖区范围内所有农村医疗机构。 依据 《消毒管
作者单位:博乐市疾病预防控制中心 , 新疆 833400
理办法》 、 《医疗消毒技术规范》 、 GB 15982-1995 《医疗消毒
卫生标准》 有关规定进行检测与评价。
2 结 果
调查 145 个卫生院 、 所房屋设施陈旧简陋 , 消毒器械配
备极差。所有一次性用品均未进行消毒毁形处理。压力蒸气
灭菌器 、 紫外线灯配备量不能满足基本工作需要。
消毒效果主要对空气 、 手 、 桌面 、 消毒液 (75% 酒精)
的细菌总数进行监测 , 空气合格最低 (6.0%), 消毒液最高
(71.4%), 手和桌面合格率仅半数。
(收稿日期:2005-04-12)
·9·中国自然医学杂志 2006年 3 月第 8卷第 1 期 Chin J Nat Med , March 2006 , Vol.8 No.1