全 文 ：半边旗二萜类化合物 5F 对瘢痕疙瘩成纤维细胞
凋亡及 Fas蛋白表达的影响
蔡康荣1　　蔡　春1　　唐旭东2　　周克元2
广东医学院　1分析中心 , 　2生物化学与分子生物学研究所 , 湛江　524023
　　摘要　目的　观察中药半边旗二萜类化合物 5F 对瘢痕疙瘩成纤维细胞 (keloid fibrolast , KFB)凋亡及对Fas蛋白
表达的影响。方法　体外培养 KFB , ①收集以浓度为 32 μg/ ml的 5F 作用 12 、 24 、 36 、 48 h后的细胞;②收集分别用
浓度为 8 、 32、 64 、 128 μg/ml 5F作用 48 h 后的细胞 , 应用流式细胞仪 (FCM)检测成纤维细胞的凋亡率及 Fas 蛋白
的表达。结果　 ① 5F 作用 12～ 48 h 成纤维细胞出现明显的凋亡 (P<0.01), 对照组成纤维细胞未见明显凋亡;②
随着药物浓度的增大 Fas蛋白表达也增高 (P<0.01)。结论　5F 可以诱导 KFB 细胞凋亡 , 促进 Fas 蛋白的表达。
关键词　瘢痕疙瘩;　成纤维细胞;　半边旗;　细胞凋亡;　Fas 蛋白
中图法分类号　R 619.6
Effects of 5F from Pteris semipinnata L on Apoptosis and Expression
of Fas in Keloid Fibroblasts
Cai Kang rong1 , Cai Chun1 , Tang Xudong2 et al
1Analytic Center , 2 Inst itute of Biochem istry and Molecular Biology ,
Guangdong Medical Col lege , Zhanj iang 524023
Abstract　Objective　To observe the ef fect of 5F from Pteris semipinnata L on the apoptosis and the ex-
pression of Fas in keloid fibroblasts.Methods　Keloid fibrolasts were treated w ith 32 μg/ml 5F for 12 , 24 , 36
o r 48 h and w ith different concentrations of 5F (8 , 32 , 64 , and 128μg/ml)for 48 h.The apoptosis and the ex-
pression of Fas in keloid fibroblasts w ere detected by flow cytometry (FCM).Results　Obviously apoptot ic cells
w ere found when keloid fibroblasts were t reated w ith 32 μg/ml 5F fo r 12—48 h , but no apoptotic cells w ere
found in the normal control g roups.The expression of Fas w as enhanced af ter the f ibroblasts w ere treated w ith
5F in a concentration-dependent manner (P <0.01).Conclusion　5F could induce the apoptosis of keloid f i-
broblasts and enhance the expression of Fas.
Key words　keloid;　fibroblasts;　Pteris semipinnata L ;　apoptosis;　Fas protein
蔡康荣 , 男 , 1962 年生 , 实验师
　　半边旗 (Pteris semipinnata L , PS L)是真蕨
目凤尾蕨科植物 , 其提取物二萜类化合物 5F 具有
显著的体内外抗肿瘤活性 , 且毒副作用小[ 1] , 但
迄今尚未见有关其在瘢痕的研究报道。近年来研究
认为:成纤维细胞是瘢痕形成 、增生 、 挛缩的功能
性细胞 , 其增殖 、活化 、 分化 、凋亡的调控异常直
接导致瘢痕疙瘩的形成。因此 , 如何有效地调节控
制成纤维细胞的增殖 、凋亡和功能活性 , 成为瘢痕
研究领域的一大热点 。目前已知细胞凋亡过程受多
种凋亡相关基因的控制 , 如促进凋亡的基因 Fas或
抑制凋亡的基因 bcl-2 等[ 2] 。本实验用流式细胞术
(f low cy tometry , FCM)检测 5F 诱导下瘢痕疙瘩
成纤维细胞 (keloid fibroblast , KFB)凋亡情况及
对凋亡基因 fas表达的影响 , 初步探讨 5F 对 KFB
的作用机制 。
1　材料与方法
1.1　标本
本实验所用的瘢痕疙瘩组织取自广东医学院附
属医院整形外科手术患者 , 均经病理诊断证实 。
1.2　试剂及仪器
半边旗二萜类化合物 5F 为本院生化研究所惠
赠 , DMEM 培养基 (Gibco 公司), 碘化丙啶
(PI)、 RNase A (Sigma 公司), Annexin Ⅴ-FITC
第 33卷第 4期第 416页
2004年 8月 　　　　
华中科技大学学报 (医学版)
J Huazhong Univ S ci Tech [ Heal th Sci] 　　　　
Vol.33　No.4　P.416
Aug.　2004
(美国 BV 公司), Fas M cab (IgG1) (美国 EA 公
司), 流式细胞仪 (EPICS XL 型 , 美国 Coulter 公
司)。
1.3　成纤维细胞培养
将手术切下的瘢痕疙瘩组织即刻在无菌条件下
切除其表皮及皮下组织 , 在少量胎牛血清中将标本
切成 1 mm3左右组织块 , 置于培养瓶中 , 于 5%
CO2 、 37 ℃、饱和湿度条件下培养 6 ～ 8 h。细胞附
壁后 , 加入适量含 15 %胎牛血清的 DMEM 培养
基继续培养 , 3 ～ 4 d 换液 1 次 , 2 ～ 3周后 , 原代
细胞生长成单层 , 用 0.25%胰蛋白酶消化后 , 按 1
∶3的比例传代培养 , 此后每 2 ～ 3 d换液 1次 , 每
4 ～ 5 d传代 1次 , 实验用第 6 ～ 10代细胞。
1.4　FCM检测凋亡细胞
采用噻唑蓝比色分析法 (MTT)观察药物抑
制试验 , 对成纤维细胞具有 50%抑制率的 5F 浓度
为 32 μg/ml , 收集其作用 12 、24 、36 、 48 h后的细
胞 , 同时 , 设未用药的成纤维细胞为空白对照组 ,
离心清洗 2次 , 70%冷乙醇固定 , 4 ℃保存 , 检测
时离心弃乙醇 , 制成单细胞悬液 , 用流式细胞仪测
定:① 碘化丙啶 (PI)染色 (含 PI 50 μg/ml 、
RNase A 1 mg/ml), 检测 “亚 G1峰” 细胞;细胞
周期分析用 MultiCycle 软件处理 , 亚二倍体细胞峰
(亚 G1峰)的量代表细胞凋亡数量;② Annexin
Ⅴ-FITC 法检测早期凋亡细胞比例。
1.5　FCM检测 Fas蛋白的表达
收集分别用浓度为 8 、 32 、 64 、 128 μg/ml的
5F 作用 48 h后的细胞 , 离心清洗 2 次 , 调整其细
胞数达 1×106个/ml , 吸取 100 μl细胞悬液 , 加入
10 μl Fas-FITC 抗体 , 用同型 IgG1-FT IC 抗体作阴
性对照 。
1.6　统计学处理
所有数据均使用 SPSS 8.0统计软件进行分析 ,
多个样本均数的比较采用单因素方差分析 , 实验组
与对照组的两两比较采用 LSD 分析 。
2　结果
2.1　5F作用不同时间对成纤维细胞凋亡的影响
FCM 检测发现 , 最初用药 12 h 出现 “亚 G1
峰” 即凋亡峰 , 凋亡细胞比例为 (12.8±1.1)%,
而在 24 h凋亡细胞增多为 (21.0±1.3)%, 到 36
、 48 h细胞碎片增多 , 凋亡细胞与坏死细胞并存 ,
凋亡细胞逐渐减少比例为 (16.4±1.2)%、 (11.2
±1.1)%, 见表 1。
表 1　5F 作用不同时间对成纤维细胞细胞周期和凋亡的影响 ( x ±s , n=6)
　　　组别 　　 细胞周期 (%)　　G1　　　　　　　　　S　　　　　　　　 　G 2　　 　　　　　　亚 G1　　
对照组　　 　 42.4±2.4 　 49.7±2.2 　 7.5±1.1 　 1.5±0.3
实验组 12 h 49.9±2.5＊ 41.0±2.8＊ 9.0±1.5 12.8±1.1＊
　　　24 h 53.0±2.9＊ 42.1±2.8＊ 4.9±1.0＊ 21.0±1.3＊　　　36 h 61.2±2.7＊ 31.3±2.7＊ 7.5±1.1 16.4±1.2＊
　　　48 h 67.4±3.0＊ 25.2±2.4＊ 7.5±1.3 11.2±1.1＊
　　　　　与对照组比较＊ P<0.01
2.2　5F作用不同时间对成纤维细胞早期凋亡的影响
从表 2 可见 , 早期凋亡细胞比例 12 h 最高 ,
随着 5F 作用时间增加凋亡细胞的比例逐渐降低 ,
和对照组比较差异均有极显著性意义(P<0.01)。
表2　5F 作用不同时间成纤维细胞早期凋亡细胞
比例 ( x ±s , n =6)
组别 时间 (h) Annexin Ⅴ-F ITC (%)
对照组 　　　3.66±0.82
实验组 12 25.50±2.41＊
24 18.10±2.12＊
36 12.40±1.71＊
48 8.49±1.36＊
　与对照组比较＊Р<0.01;实验组之间比较 Р<0.05
2.3　不同浓度 5F对瘢痕疙瘩成纤维细胞 Fas蛋白表达的
影响
　　FCM 检测结果显示 , 在对照组中 Fas蛋白表
达率为 (5.66±0.82)%, 5F 用药浓度在 8 μg/ml
时表达率小幅上升为 (7.67±0.52)%;32 μg/ml
时表达率为 (13.45±1.12)%, 用药剂量增大至
64 μg/ml 时 , Fas 蛋白表达率增加到 (24.90 ±
1.71)%, 最高浓度 128 μg/ml时表达率达 (30.57
±1.66)%, 与对照组比较差异均有极显著性意义
(P<0.01)。实验组两两之间比较差异亦有极显著
性意义(P<0.01)。
3　讨论
有研究表明 , 若细胞受刺激后 DNA 损伤 , 用
·417·蔡康荣等.半边旗二萜类化合物 5F 对瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡及 Fas蛋白表达的影响
单细胞作琼脂糖凝胶电泳呈现典型的彗星带 (梯状
条带), 和 FCM 检测 (亚 G1峰)结果相一致[ 3] ,
从而说明应用 FCM 检测凋亡细胞是准确的。本实
验结果可见 5F 能抑制 KFB 增殖 , 当药物浓度在
32μg/ml作用 12 h , KFB 的凋亡率为 (12.8 ±
1.1)%, 继续作用到 24 h , 凋亡细胞增多 , 48 h
时KFB凋亡率明显减少 , 细胞坏死增加 。凋亡的
早期改变之一是质膜上磷脂分布的不对称性被破
坏 , 使正常位于细胞膜内层表面的磷脂酰丝氨酸
(phosphatidylserine , PS)暴露在细胞膜外层表面 ,
PS一旦出现于细胞膜外层表面就很容易与 Annex-
in Ⅴ结合而被标记[ 4] 。本实验用 Annexin Ⅴ-FITC
检测暴露在凋亡细胞表面的 PS , 发现实验组比对
照组的早期凋亡细胞显著性增加 , 通过 FCM 检测
DNA含量分析 , 在 32 μg/ml 5 F 作用下 KFB于短
期内有 “亚 G1峰” 的出现 , 这是细胞凋亡的特征
性表现 。同时发现 , 5F 作用时间越长 G1期细胞逐
渐增多 , S期的细胞减少 , 由此提示 5F 诱导细胞
S 期凋亡 , 致处于 S 期的细胞减少 , 随着用药时间
的延长 , 坏死细胞增多 , 阻滞于 G1期时相的细胞
比例增多 , 而凋亡峰随着 G1期停滞细胞的增加而
减少 。提示一定浓度的 5F 可抑制 KFB增殖与诱导
KFB凋亡 。
促进凋亡的基因 Fas抗原 , 又称为 CD95 , 是
细胞凋亡过程中重要的死亡信号传递分子 , Fas主
要以膜受体形式存在 , 在调控细胞增殖和凋亡中起
重要作用 。它的天然配体 FasL 属于杀伤性 T 细胞
效应分子 , 两者结合是体内 Fas发挥作用的唯一途
径。一般情况下 , Fas/FasL 系统在维持组织器官 、
细胞内稳定上有重要地位 , Fas功能过强或缺陷均
可导致病变发展[ 5] 。本实验结果显示 , 5F 作用于
KFB浓度在 8μg/ml时 , Fas蛋白表达与对照组比
较无显著差异 。当 5F 用药浓度在 32 μg/ml以上
时 , Fas蛋白的阳性表达与对照组比较有显著差
异。5F 使 KFB 中 Fas蛋白表达上升其意义可能
为:同一 KFB中自身的 Fas和 FasL 交联 , 通过顺
式触发 (cis-t rigger)机制自杀 , 或直接激活凋亡
基因产物 、诱导 Fas分子所在细胞凋亡[ 6] 。但凋亡
的调节机制非常复杂 , Fas并非唯一的调控基因 ,
其表达强度并不一定会呈现出与细胞凋亡率平行的
正相关 , 特别是当细胞处于异常增殖状态的情况
下 。同时 , 本实验研究发现 5F 在 8 μg/ml时 , 细
胞受抑制可能是可逆的 , 大多细胞停滞于静止状
态 , 在 32 μg/ml时 , 凋亡与坏死并存 , 在 128 μg/
ml时 , 细胞凋亡后期继发性坏死占主导地位。综
上所述 , 5F 对 KFB的抑制作用可能与 Fas蛋白表
达上调有密切的关系 , 促进凋亡基因 Fas蛋白的表
达可作为体外培养的 KFB增殖或抑制状态的一项
检测指标。
参　考　文　献
1 　崔　燎 , 梁念慈 , 陈志东等.半边旗体内外抗癌作用及
急性毒性研究.中药材 , 1996 , 19 (1):29
2 　姜　泊主编.细胞凋亡基础与临床.北京:人民军医出
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3 　Villani P , Altavista P L , Castaldi L et al.Analy sis of
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4 　Adok V A , Voelker D R , Campbeii P A et al.Exposure of
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(2003-02-26　收稿)
·418· 华中科技大学学报 (医学版)　　2004年 8月第 33卷第 4期