全 文 ：收稿日期:2000-09-04
作者简介:王培磊(1966— ),男,山东临沂人 ,青岛海洋大学讲师 ,理学硕士.研究方向:海洋藻类.
　　文章编号:1009-6051(2000)06-0036-03
海洋单胞藻浓缩和保存研究进展
王培磊 , 宫庆礼 , 黄海龙
(青岛海洋大学 水产养殖系 ,山东青岛 266003)
摘　要:综述了微藻浓缩和保存的重要性 、国内外研究现状 、所用实验材料 、物理化学浓缩方法 、
浓缩和保存结果 、结果评价指标 、本研究领域发展前景及存在的问题.
关键词:单胞藻;浓缩;保存;研究进展
中图分类号:Q172　　　　文献标识码:A
单细胞藻类 ,简称单胞藻 , 又名微藻(Microalgae).因其利用太阳能效率高 , 营养丰富 ,生长繁殖旺盛 , 适应性强 ,易培
养等 ,越来越受到广泛的重视.已在水产养殖 、污水净化 、食品行业 、饲料添加剂 、能源开发 、药物研制 、基础生物研究 、色
素提取等方面得到了应用.特别是微藻富含 EPA 和 DHA , 在降低血压 、治疗脑血栓 、动脉粥样硬化 、冠心病等心脑血管疾
病方面有独特的疗效.开发富含 EPA 的海洋微藻的大规模培养技术 , 已被公认为替代鱼油生产 EPA 的最有效的新途
径.
1　微藻浓缩和保存的必要性和重要性
微藻的浓缩(algae condensation)就是用物理方法(超滤膜和高速离心机)或化学方法(用石灰水 、明矾 、甲壳素 、FeCl3、
多聚 AlCl3 等化学沉淀剂)将培养的藻液浓缩成藻泥或藻膏;而微藻的冷冻保护(Algae cryopreservation)就是用冷冻保护
剂将藻类保护起来 ,然后在低温下保存一定长时间后 , 使其仍有尽可能大的存活率(viability),以便用于各种研究和商业
性开发生产.随着低温生物学(cry obiolog y)的发展 ,特别在医学 、食品工业及农业上的应用 ,带动了水产业的发展 ,很多国
家花巨资开发低温生物学在微藻研究中的应用.
单胞藻最早和最广泛的应用是用作水产经济动物幼体(大多数贝类的幼体 、虾类的蚤状幼体和糠虾幼体 、海参的樽
形幼体等)和成体(如瓣鳃类软体动物等)的饵料.目前育苗场培育的单胞藻饵料是以鲜藻液直接投喂的 , 因此培养单胞
藻的数量和供饵时间都要和育苗需要相吻合 , 不能有任何差错.近几年 , 因供饵不及时给育苗场带来重大损失的例子很
多.虽然将藻液浓缩烘干制成干藻粉也是一条途径 , 但显然其维生素(V)、必需氨基酸(EAA)、必需脂肪酸(EFA)、高不饱
和脂肪酸(HUFA)、适口性 、消化率等与鲜藻液相比均有损失和下降.如果研制出一套理想的浓缩和储存方法 , 储存一定
数量的单胞藻饵料 ,在鲜藻液缺乏时使用 , 就能从根本上解决饵料培养不及时和不稳定影响育苗生产的难题.而且 ,将鲜
藻液浓缩制成藻膏投喂苗种可减少水质污染.因此研制出一种效果理想 、简单易行 、适合于各种单胞藻的短期和较长期
的保鲜方法已被列为单胞藻研究开发应用的一个非常重要而紧迫的研究方向和课题.
人们对微藻的食用和药用及保健越来越感兴趣 , 这就需要大量生产微藻 , 单靠边生产微藻边加工成品是不可行的 ,
必须先将大量生产的微藻浓缩制成藻膏保存起来备用 , 才能满足需要.而且 , 随着海洋水产科学研究的发展 , 科学家用海
洋微藻作为实验材料进行各种基础研究越来越多 , 目前的保种技术已跟不上时代发展的要求 ,若将各种微藻冷冻保存 ,
可解决这个问题.
2　国内外微藻浓缩和保存研究状况
国外 ,早在 19世纪中期 , Klemm.P.就进行了藻类的冷冻试验.本世纪 60 年代 ,日本北海道大学低温研究所的照本·
旭 ,英国的 Mor ris G.J.等科学家对单胞藻进行了冷冻保护研究 ,取得了在-196℃条件下 , 保存 1 年 ,存活率达 100%的
结果.70 年代后期 , Morris G.J.分别对小球藻(Chlorella saccharophila)、眼藻(Chlorella sp Euglena g racilis)等单胞藻的冷冻
保护条件进行了更详尽的研究 ,并提出了提高藻类耐冻性和保护藻类冻死的有效手段.1993 年 , John G.Day 和 Caroline
Fenwich 以甘油作保护剂 , 用两步冰冻法(-30℃, -196℃), 以 1 ℃/分的降温速度对 Tetraselmis 属的几个饵料种进行
了保存 ,存活率大于 50%.1995 年 , Pedro Canavate和 Luis M.Lubinn 以 15%的二甲亚砜(DMSO)作抗冻剂 ,用两步冰冻
法(-80℃ , -196℃)对微绿球藻 、红胞藻 、等鞭藻等六种饵料藻类进行了冷冻保存试验.1989 年 , 美国的 Coast Oy ster
Company公司成功地将单胞藻保存了 1年 , 并开发出了商品饵料———藻膏 , 投放市场 ,效益显著.此外 , 日本的代田昭彦 、
第 22 卷　第 6 期 临 沂 师 范 学 院 学 报 2000 年 12 月
Vol.22 No.6 Journal of Linyi TeachersCo llege Dec.2000
冈内正典分别研究了单胞藻的几种保存方法.
国内 ,俞敏娟等(1959)进行了单胞藻的人工沉淀方法的研究.郑严(1978)对三角褐指藻(phaeodacty lum trico rnutum)
进行了冷冻保种试验 ,证明三角褐指藻在-20℃条件下 , 保存 20天后 , 重新培养 2 天即能正常生长繁殖.蒋敏霞 、朱艺峰
等(1993)对海水单胞藻的化学浓缩方法和保存应用进行了初步研究 ,但他们只进行了化学浓缩方法研究 , 用的凝絮剂毒
性大 ,价格贵 , 且只进行了低温保藏研究(5—7℃).孙建华 、王如才(1993)对四乳突扁藻(Tetraselmis tetratele)、小新月菱
形藻(Nitzschia closterium)、球等鞭金藻(Isochry sis galbana)的浓缩和保存方法进行了研究 , 结论是:浓缩藻以低温(1-4
℃)并加保护剂 SAMs效果最好 , 保存 3 个月 ,藻类的二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)减少量很少.中科院
海洋所的梁德海 、彭树杰(1999)对浓缩小球藻低温保藏技术进行了研究.曾呈奎 、吴超元在《单细胞藻类养殖》一书中提
到可用明矾和石灰水作沉淀浓缩剂来浓缩小球藻和扁藻.河北省水产研究所崔秀林等用硫酸铝铵浓缩过新月菱形藻
(Nitzschia closterium),并作了冷冻储藏试验.
3　研究所用试验材料 、技术方法 、试验结果及结果评价指标
3.1　试验材料
研究者所用材料为生产上所常用的饵料价值较高的约 10 余种藻类 ,见表 1.
3.2　藻液浓缩方法
有物理浓缩和化学试剂浓缩.物理浓缩有两种 ,即超滤法(宫庆礼 ,青岛海洋大学 梁德海 、彭树杰 , 中科院海洋所)和
高速离心法(梁德海 、孙建华 、蒋敏霞 、朱艺峰等).高速离心法可以浓缩 10000 倍 , 而超滤膜法可以浓缩 400 倍(梁德海
等 , 1999).超滤法浓缩小球可达 60亿/毫升(宫庆礼 , 1999).用超滤法收集的藻泥在相同的时间内(4℃ , 4 个月),无论是
指数生长期还是静止生长期 ,再活化率比高速离心法高 2%-10%, 同时还发现 , 指数生长期藻细胞的再活化率无论是
超滤法还是高速离心法都高于静止生长期 ,提高 5%-7%(梁德海 、彭树杰 , 1999).但由于离心法效率低 , 耗电多 ,无法
在生产上应用.常用的化学浓缩剂见表 1.
表 1　试验材料和化学浓缩剂
研究者 所用藻类 学　名 化学浓缩剂
Morris G.J 小球藻眼藻
Chlorella
Saccharophila
J.Pedro Canavate and
Luis M.Lubinn
红胞藻
等鞭藻
微绿球藻
Rhodomonas
Isochrysis
Karsten
郑严等(1978) 三角褐指藻 phaeodactylum
梁德海　彭树杰
(1999)
小球藻
三角褐指藻
Chlorella spp
phaeodactylum
孙建华　王如才
(1993)
四乳突扁藻
小新月菱形藻
球等鞭金藻
Tetraselmis tetratele
Nitzschia clo sterium
Isochrysis galbana
氯化铁 、明矾
聚丙烯酰胺
多聚氯化铝
甲壳素 、石灰水
崔秀林 小新月菱形藻 Nitzschia clo sterium 硫酸铝铵
蒋敏霞 、朱艺峰等
(1993)
小球藻
三角褐指藻
Chlorella spp
phaeodactylum
明矾
氢氧化钠
高锰酸钾
漂白粉 、硫酸铜
3.3　化学浓缩结果
化学凝絮剂以石灰水和多聚氯化铝最好 ,这两种凝絮剂毒性小 ,沉淀速度快.蒋敏霞试验指出:明矾对新月菱形藻和
三角褐指藻适宜的浓度为 10—100ppm , 而对小球藻为 5—40ppm , 最适者为 5ppm.角毛藻适宜范围为 10—80ppm , 最适
为 10ppm..球等鞭金藻适宜浓度为 30—150ppm , 最适为 50ppm , 叉鞭金藻为 50—210ppm , 最适为 50—70pm.扁藻为
150—360ppm ,最适为 300ppm.结果证实 , 漂白粉 、硫酸铜 、氯化钠均不宜作浓缩剂.聚丙烯酰胺 、甲壳质 、褐藻胶作凝絮剂
在医药 、食品 、化工等生产中广泛应用 ,但其对海产单胞藻沉淀效果并不理想(孙建华等 , 1993).聚丙烯酰胺各浓度组之
间效果差异不大 ,且浓度超过 50ppm , 沉淀效果变差.甲壳质的沉淀效果比聚丙烯酰胺好.G.shelefatal曾报道 , 有机多聚
37第 6 期 王培磊等:海洋单胞藻浓缩和保存研究进展
凝絮剂适合于淡水单胞藻的沉淀 ,这可能与海水中的离子强度大有关.
3.4　冷冻保护剂的使用
1987 年报道 ,细胞低温冷冻保存的原理是:通过低温抑制细胞代谢 ,使具有生物活性的物质暂时失去活力.细胞由
常温下的高耗能 、进行大量代谢状态 , 进入一种能量消耗 、新陈代谢降至最低点的休眠状态或假死状态.自从 1949 年
Ploge发现利用甘油能很好地保护精子后 , 人们才开始在低温保存中使用抗冻剂.抗冻剂分渗透性(主要有二甲亚砜
DMSO、甘油 、甲醇等)和非渗透性(主要有蔗糖 、海藻糖 、甘氨酸 、肌氨酸等)两大类.孙建华等研究发现 ,加入保护剂的试
验组成活率明显高于直接冰冻组.在各种保护剂中 , 甘油是最好的.直接冰冻组中 , 小新月菱形藻具有较高的成活率.郑
严 、金娟等曾报道在-20℃左右直接储存小新月菱形藻和三角褐指藻 1—8 个月 , 取出培养 2—11 天 ,藻细胞恢复正常 ,
并有新细胞存在.这说明 , 硅藻对冷冻有强的耐受力.王起华等(1999)研究结果表明:降温速度 0.7℃/分 ,预冻温度-
40℃,预冻时间 30min 时可获得较高的存活率.15%DMSO(二甲亚砜)或 15%DMSO+10%蔗糖对绿色巴夫藻(Pavlova
viridis)、湛江叉鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)和球等鞭金藻(I.galbana)是良好的抗冻保护剂.朱仁华(1984)认为 ,海洋
无脊椎动物在长期低温环境中具较强抗过冷本领 ,它们通过增加小分子有机溶剂或大分子物质作抗冻剂或通过调节渗
透压来抵抗过冷环境.除保存温度外 , 降温速度和解冻速度对微藻的低温冷冻保存效果非常重要.抗冻剂作为有毒的化
学物质会对海洋动物种质细胞的生长发育产生一定的影响 , 解冻后如何洗脱残留的抗冻剂 ,还没有人做过研究.海洋微
藻由于有较厚的细胞壁 ,可用离心方法洗脱掉抗冻剂.
4　单胞藻浓缩和冷冻保藏结果的评价指标
4.1　浓缩效果评价指标
理想的化学浓缩剂不仅浓缩速度快(即在短时间内完成沉淀过程)、沉淀效果好(即沉淀完全 , 无结快 、浓缩藻液相对
密度高), 而且藻细胞存活率高(即沉淀剂对藻细胞毒害作用小),再培养时藻类生长速度快 , 长势好.可用 T TC 法(氯化
三苯四氮唑还原法)测定存活率.因脱氢酶能使 T TC 还原成一种红色甲腙(fo rmazan),此甲腙用乙醇抽提后 , 用分光光度
计进行定量测定.比较保存样品和对照样品的抽提液在分光光度计 485nm 波长处的光密度值 ,就能判断出其相对活力.
参见表 2.
表 2　研究者评估浓缩效果所用指标
研究者 指　　标 计算方法
孙建华等 沉淀度存活率
沉淀度(%)=(原藻液细胞数-上清液细胞数)/
原藻液细胞数×100
蒋敏霞 、朱艺峰等 浓缩倍数浓缩率
浓缩倍数=浓缩后的藻液密度/原藻液密度
浓缩率=上清液体积/原藻液体积
梁德海 、彭树杰 浓缩倍数再活化率 浓缩倍数=浓缩后的藻液密度/原藻液密度
王起华 再活化率
4.2　冷冻保藏效果的评价方法和评价指标
蒋敏霞 、朱艺峰等采用以下四个方法评价保存效果:(1)冷藏小球藻与普通小球藻生长曲线对比;(2)浓缩小球藻直
接投喂中国对虾效果;(3)冷藏小球藻直接投喂轮虫效果;(4)生产性扩种应用试验.而孙建华(1993)采用以下方法评价
保存效果:(1)分析保存前后藻的营养成分(必需氨基酸 、必需脂肪酸 、DHA 、EPA)变化情况;(2)保存后藻的存活试验;
(3)保存前后的藻对扇贝幼虫的饵料效果试验.王起华(1999)通过再培养法测定存活率来评价冷冻保存效果.在微藻冷
冻保存研究中 ,存活率的鉴定方法是一个重要问题 , 在以往的报道中曾采用荧光染色法 、光合放氧法 、运动能力观测法 、
平板克隆法 、溶液再培养法等 , 其中后两种方法被认为是最可靠的方法.
5　本研究领域的发展前景及存在问题
1)每一种藻类最佳的化学浓缩剂及最适的剂量尚无统一的结论.
2)不同的化学浓缩剂和冷冻保护剂的毒性去除方法需进一步研究.
3)低温保存过程中最适的保存温度及适宜的降温和解冻速度尚需进一步研究.
4)不同藻类预冻温度 、预冻时间对冷冻保存存活率的影响.
5)超滤膜法浓缩微藻因不毒害藻类 、成本低 、效率高而显得更有发展前途 ,但过滤过程中对细胞结构有无破坏作
用 、破坏的程度及防止措施尚需进一步研究.　　(下转第 57 页)
38 临 沂 师 范 学 院 学 报 第 22 卷
On the Exploitation of Natural Resources
in Different Economic Times
CAO Guang-jie
(Geog raphy Department of Linyi TeachersCo llege , Liny i Shandong 276005 , China)
Abstract:In dif ferent economic times , the degree of exploi tation of natural resources varies because of
the level of product ive forces , scientific technolgy.In the economic times of agriculture , only a few kinds of
natural resources w ere developed and the use degree of them was low.In the economic t imes of indust ry ,
the deg ree and the scope of human use of natural resources were greatly raised.In the Know ledge economy
the use of natural resources has unprecedentedly reached an overall , comprehensive , reasonable and efficient
deg ree.
Key words:natural resource;ag riculture economy ;indust ry economy ;know ledge economy
(上接第 38 页)
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Research Advances of Condensation and
Preservation of Marine Microalgae
WANG Pei-lei , GONG Qing-li , HUANG Hai-long
(Mariculture Department Lab , Ocean University of Q ingdao , Qingdao Shandong 266003 , China)
Abstract:This paper int roduces the importance of microalgae condensation and preservation , the
present si tuation of this field in China and overseas , research material employed , phy sical and chemical
condensation methods , the results of microalgae condensation and preservation research , evaluation indexes
of the research results , prospects and possible problems in further research .
Key words:microalg ae;condensation;preservation;research advance
57第 6 期 曹光杰:论不同经济时代自然资源的开发利用