全 文 ：doi: 10.3969/j.issn.1009-0002.2016.01.024 研究报告
北柴胡与银州柴胡的 ITS条形码鉴定研究
袁伯川，马永生，杨瑞，周姗，林瑞超，刘颖
北京中医药大学 中药学院中药品质评价北京市重点实验室，北京 100102
［摘要］ 目的：建立基于内转录间隔区（ITS）序列的北柴胡与银州柴胡分子鉴定新方法。方法：以来自北京、宁夏、山
西、甘肃、河北的 10个居群共 125份北柴胡及银州柴胡样品为实验材料，提取其总DNA，并 PCR扩增其 ITS序列，对
序列进行双向测序，应用Clustal X及BLAST查错，用MAGA 5.0进行序列分析，计算种内、种间遗传距离，构建邻接
树，并统计不同单倍型的分布情况。结果：北柴胡与银州柴胡的 ITS序列全长为 604 bp，有 7个变异位点，共计 6种单
倍型，其中单倍型1为银州柴胡所特有，单倍型2~6为北柴胡所特有；ITS序列种内最大遗传距离0.005，种间最小遗传
距离0.007。结论：利用 ITS序列可快速准确地鉴定北柴胡与银州柴胡。
［关键词］ 北柴胡；银州柴胡；内转录间隔区；分子鉴定
［中图分类号］ Q945 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1009-0002（2016）01-0101-05
Molecular Identification of Bupleurum chinense DC. and B.yinchow⁃
ense Shan et Y. Li Based on ITS Sequence
YUAN Bo-Chuan, MA Yong-Sheng, YANG Rui, ZHOU Shan, LIN Rui-Chao, LIU Ying*
Beijing Key Laborarory of Traditional Chinese MedicineQuality Evaluation, School of Chinese Pharmacy,
Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China
*Corresponding author, Email: liuyliwd@sina.com
［Abstract］ Objective: To establish a new method for molecular identification of Bupleurum chinense DC. and B.
yinchowense Shan et Y. Li. Methods: 125 samples from 10 populations were used as plant materials, total DNA
of which were extracted and then the internal transcribed spacer（ITS） sequences were obtained by PCR. All of
the ITS sequences were checked and aligned using Clustal X and BLAST. The genetic distances were calculated
and Neighbor Joining tree were constructed using MEGA 5.0, and the distribution of different haplotypes were de⁃
scribed. Results: 125 ITS sequences with a full length of 604 bp were obtained. There were 6 ITS haplotypes
based on 7 variable sites. Among them, haplotype 1 was specific for B.yinchowense, and haplotype 2~6 were specif⁃
ic for B.chinense. The largest intraspecific genetic distance was 0.005, while the smallest interspecific genetic dis⁃
tance was 0.007. Conclusion: B.chinense and B.yinchowense can be identified by ITS sequence rapidly and effec⁃
tively.
［Key words］ Bupleurum chinense DC.; Bupleurum yinchowense Shan et Y. Li; internal transcribed spacer; molecu⁃
lar identification
柴胡是中国药典收录的常用大宗中药材之一，
具有疏散退热、疏肝解郁、升举阳气等功效。中国药
典规定中药柴胡为伞形科柴胡属植物柴胡（Bupleu⁃
rum chinense DC.）或狭叶柴胡（B.scorzonerifolium
Willd.）的干燥根 [1]，柴胡一般俗称为“北柴胡”，而狭
叶柴胡则俗称为“南柴胡”。目前，全世界已报道的
柴胡属植物约有 150种，中国分布 42种、17变种、7
变型[2]。据调查，其中 25种、8变种、3变型在不同地
区和市场中被作为柴胡使用[3]，有的地区甚至把当地
所产五六种柴胡混在一起使用，从而造成市场混乱，
药材质量极不稳定 [4]。其中，银州柴胡（B.yinchow⁃
ense Shan et Y. Li）与北柴胡在外观上相似，传统性
状鉴别难以区分[5]，并且由于银州柴胡与北柴胡在分
布区上有较多重叠[3]，市场上经常将其作为北柴胡使
用。虽然银州柴胡在我国西北地区具有多年药用历
史 [6]，但它与药典规定的北柴胡属于不同的物种，二
者药用成分不同[7-8]，药效也不尽不同。因此，建立一
种快速、准确鉴定北柴胡与银州柴胡的方法，对于保
证柴胡药材的质量及用药安全具有重要意义。
DNA条形码是Hebert等于 2003年首次提出 [9]，
利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列进
收稿日期：2015-11-13
基金项目：国家科技重大专项（2014ZX09304307001-017）
作者简介：袁伯川（1992- ），男，硕士研究生
通信作者：刘颖，（E-mail）liuyliwd@sina.com
生 物 技 术 通 讯LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol.27 No.1 Jan., 2016 101
生 物 技 术 通 讯LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol.27 No.1 Jan., 2016
行物种鉴定的分子生物学技术 [10]，是传统形态鉴别
的有效补充。其中，18S~26S核 rRNA基因的内转录
间隔区（internal transcribed spacer，ITS）因变异速度
较快，可提供较丰富的变异位点和信息点，并且被子
植物的 ITS区长度比较稳定，只有 700 bp左右 [11-12]，
便于进行测序分析。因此，ITS序列不仅可用于解决
科、亚科、族属组内的系统发育和分类问题，还可用
于分析同属不同种间的网状进化关系，从而成为系
统与进化植物学研究中的重要分子标记。我们采集
了来自北京、宁夏、山西、甘肃、河北等地区的 10个
居群共计 125份北柴胡及银州柴胡样品，对其进行
ITS序列分析，以期为快速、准确地鉴定北柴胡及银
州柴胡奠定分子基础。
1 材料与方法
1.1 材料
根据前期的文献查阅 [3,6,13-14]，在北京、宁夏、山
西、甘肃、河北等中药柴胡的主产地进行了北柴胡及
银州柴胡样品的采集，共得到来自 10个居群的 125
份样品，由北京中医药大学中药学院刘春生教授对
其进行形态学鉴定，样品信息详见表1。
广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒、2×Taq
PCR MasterMix酶、琼脂糖、Golden View染色剂、
BM2000+ DNA marker购于北京博迈德科技发展有
限公司。
研钵；移液枪（Eppendorf）；MTD型水浴锅（上海
利浦自动化仪表厂）；QL-901型涡旋仪（江苏海门市
麒麟医用仪器厂）；1-13000型离心机（Sigma）；TPro⁃
fessional热循环分析仪（Biometra）；DYY-6C型电泳
仪（北京市六一仪器厂）；电泳槽（北京百晶生物技术
有限公司）；BG-gdsAUTO510型凝胶成像系统。
1.2 DNA提取
选取北柴胡及银州柴胡干燥叶片置于研钵中，
在液氮氛围下迅速研磨成粉末，取该粉末 20 mg于
1.5 mL离心管中，用广谱植物基因组DNA提取试剂
盒逐步提取DNA，最终可得到100 μL DNA溶液。
1.3 序列扩增
本实验用于扩增 ITS序列的上下游引物分别为
P1（5-AGAAGTCGTAACAAGGTTTC-3）和 P4（5-
TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）。采用 30 μL反应
体系，包括 2×Taq PCR MasterMix 15.0 μL，上、下
游引物各 1.0 μL（5 μmol/L），DNA模板 3.0 μL，
ddH2O 10.0 μL；以ddH2O为阴性对照。
PCR反应条件：94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃
45 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min；4℃保
存。
1.4 凝胶电泳检测
用 1×TAE缓冲液配制 1%琼脂糖凝胶，以 1×
TAE缓冲液为电泳缓冲液，电泳条件为 110 V、30
min，上样量为 5 μL，电泳毕，将胶置于紫外成像仪
中，在750 bp左右有明亮DNA条带即为扩增成功。
1.5 测序及序列分析
PCR扩增产物经纯化后，送上海生工生物工程
有限公司测序。将测序完成的峰图文件用软件Co⁃
donCode Aligner V5.12（CodonCode Co.，USA）进行
拼接及校对，去除序列两端的低质量区，得到北柴胡
及银州柴胡 ITS序列，再利用 Clustal X V2.0（Hig⁃
gins D.G.）进行多序列比对并查错。对所得序列进
行基于GenBank的相似性搜索，以确定是否为目标
序列。利用 MEGA 5.0（Molecular Evoutionary Ge⁃
netics Analysis）进行种内及种间变异及K2P（Kimu⁃
ra 2-Parameter）遗传距离分析，K2P距离越大表示
物种亲缘关系越远，反之越近。基于邻接（Neigh⁃
bor Joining，NJ）法构建系统发育树，各分支的支持
率使用Bootstrap重复1000次进行检验。
2 结果
2.1 PCR扩增结果
柴胡样品的 ITS序列扩增结果如图 1所示，扩增
得到了长度约 750 bp的条带，与目标条带 ITS序列
的长度一致。
2.2 ITS序列多态性分析
共扩增得到 125条 ITS序列，长度均为 604 bp，
有 7个变异位点，其中种间变异位点为 3个，可分为
6种单倍型（单倍型 1~6）。银州柴胡的所有 ITS序列
100%一致，均归属于单倍型 1；北柴胡中出现了 5种
单倍型，即单倍型 2~6，其中单倍型 4样品数量最多，
所占比例为62%，是北柴胡的核心单倍型。6种单倍
型的变异位点信息、样品数量、鉴定结果及GenBank
注册号等信息如表 2所示，基于此 6种单倍型计算的
单倍型间的K2P距离结果如表3所示。
由表 2可知，银州柴胡与北柴胡 ITS序列种间存
在 3个特异性变异位点，分别位于 40、118、602 bp
处，其中北柴胡为 40A-118G-602G，银州柴胡为
40T-118A-602A。银州柴胡 ITS序列种内不存在变
异位点，北柴胡 ITS序列种内有 4个变异位点，在 33、
59、478、557 bp处，可分为 5种单倍型，即单倍型 2
（33A-59C-478A-557C）、单倍型 3（33T-59T-478A-
557G）、单倍型 4（33T-59T-478A-557C）、单倍型 5
（33T-59T-478T-557C）和单倍型 6（33T-59T-478A/
T-557C）。因此，单倍型 1为银州柴胡特有单倍型，
而单倍型 2~6为北柴胡特有单倍型，利用 ITS序列可
明确区分北柴胡及银州柴胡。
就分布范围而言，北柴胡在北京（居群 8）、河北
102
（居群 9、10）、山西（居群 4）、甘肃（居群 7）均有分布，
其生长海拔为 800~1550 m；而银州柴胡在宁夏（居
群 1、2）、山西（居群 3、4）、甘肃（居群 5、6、7）有分布，
其生长海拔为 1400~2300 m。因此，北柴胡与银州
柴胡在产地分布范围上有交集，但银州柴胡集中分
布于西北，北柴胡则在西北和北部均有分布，同时银
州柴胡的分布海拔较北柴胡高，故相比之下北柴胡
的分布范围更为广泛。
由表 3可知，北柴胡与银州柴胡各自种内 K2P
距离范围、平均K2P距离均与它们种间距离有明显
差距，因此可准确区分北柴胡与银州柴胡。
依据北柴胡及银州柴胡的 ITS序列测序结果，
构建NJ树如图 2，可见北柴胡与银州柴胡很明确地
聚为两大支。由于银州柴胡 ITS序列种内无变异，
故在聚类树上单独聚为 1支，无其他分支；而北柴胡
ITS序列种内存在一定程度的变异，故在聚类树上继
续分支，其中单倍型 2与单倍型 3~6分别聚为 2支，
随后单倍型3~单倍型6进一步分支。
3 讨论
本研究中的银州柴胡为伞形科柴胡属银州柴
胡，与一些古代本草中记载的银州柴胡并非同种[15]，
此银州柴胡在我国西北地区，尤其是陕西、甘肃、宁
夏仍有较多分布，并且有部分种植 [16]。由于其药材
的外形与北柴胡相似，经常混入北柴胡药材中 [17]。
在实验中我们也发现，一些原本通过形态鉴定认为
是北柴胡的样品，经 ITS分子鉴定后确定其为银州
柴胡，如样品 YC2、YC3、YC6、YC7、YC9、YC10、
YC12、YC21、QY30、QY39，因此这也进一步说明北
柴胡与银州柴胡形态相似，二者混杂生长，难以通过
传统鉴定进行准确区分。故以 ITS序列将二者区分
开来，可作为传统鉴定的有效补充。
我们在选取DNA条形码时，曾做过大量的预实
验，对包括 ITS序列、psbA- trnH序列在内的多种
DNA条形码进行了分析比对，并参考了前人的一些
研究报道[18-19]。刘力等以DNA芯片用于柴胡类生药
的鉴定取得了一定的成果，但在北柴胡与银州柴胡
的鉴别上存在一些疑问。psbA-trnH序列虽然变异
位点及单倍型多样性较 ITS序列丰富，但其种间K2P
距离范围与种内K2P距离范围有较大的重合，因此
不能准确区分北柴胡与银州柴胡。而在本实验中，
通过 ITS序列多态性分析，单倍型 1为银州柴胡所特
有，单倍型 2~6为北柴胡所特有，且种间最小遗传距
离明显大于种内最大遗传距离，因此可明确地将银图1 样品中 ITS序列扩增结果M：DNA marker；1~9：ITS序列扩增结果；10：空白对照
表2 北柴胡及银州柴胡 ITS序列6种单倍型信息
单倍型
1
2
3
4
5
6
变异位点（bp）
33
A
A
T
T
T
T
40
T
A
A
A
A
A
59
T
C
T
T
T
T
118
A
G
G
G
G
G
478
A
A
A
A
T
A/T
557
C
C
G
C
C
C
602
A
G
G
G
G
G
样品数量
（共125条）
59
15
6
41
4
2
鉴定结果
银州柴胡
北柴胡
北柴胡
北柴胡
北柴胡
北柴胡
GenBank注册号
KT984177
KT984178
KT984179
KT984180
KT984181
KT984182
表3 柴胡属5种药用植物种内种间K2P距离计算结果
关系
银州柴胡种内
北柴胡种内
北柴胡与银州柴胡种间
K2P距离范围
0
0.002~0.005
0.007~0.008
平均K2P距离
0
0.002
0.007
变异位点
0
4
3
表1 本实验所采集北柴胡及银州柴胡样品信息
居群
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
采集地点
宁夏回族自治区隆德县
宁夏回族自治区隆德县六盘山
山西省吕梁市柳林县
山西省运城市绛县
甘肃省定西市漳县
甘肃省白银市会宁县
甘肃省庆阳市正宁县
北京市延庆县松山地区
河北省赤城县大海坨村海坨峰
河北省张家口市桥西区赐儿山
经纬度
N35°44′57″，E106°06′22″
N35°45′36″，E106°11′7″
N37°30′3″，E110°51′54″
N35°31′37″，E111°30′51″
N34°48′13″，E104°24′36″
N35°45′52″，E105°25′51″
N35°20′56″，E108°18′51″
N40°30′9″，E115°48′45″
N40°33′46″，E115°48′5″
N40°49′8″，E114°50′38″
海拔（m）
2000
2100
1400
800
2300
2200
1400
800
1550
1100
野生/栽培
栽培
野生
栽培
栽培
栽培
野生
野生
野生
野生
野生
形态学鉴定物种
银州柴胡
银州柴胡
银州柴胡
北柴胡
银州柴胡
银州柴胡
北柴胡
北柴胡
北柴胡
北柴胡
样品数量
12
5
7
16
15
10
15
18
15
12
编号
NX1~NX12
NX13~NX17
SX1~SX7
YC1~YC16
GS1~GS15
HN1~HN10
QY1~QY15
B1~B18
B19~B33
ZJK1~ZJK12
袁伯川等：北柴胡与银州柴胡的 ITS条形码鉴定研究 103
生 物 技 术 通 讯LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol.27 No.1 Jan., 2016
州柴胡与北柴胡区分开来，这对于北柴胡与银州柴
胡的鉴别研究具有一定的指导意义。
参考文献
[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典: I部[M]. 2010版. 北
京: 中国医药科技出版社, 2010:263.
[2] 中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志: 55卷第一分
册[M]. 北京: 科学出版社, 1979:215-295.
[3] 梁镇标, 刘力, 晁志. 柴胡属植物资源及生产状况调查[J]. 时
珍国医国药, 2012,(8):2011-2013.
[4] Pan S. Bupleurum species: scientific evaluation and clinical
applications[M]. London: London Taylor & Francis Group,
2006:7-22.
[5] 毛学勇, 唐生斌. 柴胡及其混伪品的性状比较 [J]. 中药材,
2001,(3):169-170.
[6] 王玉庆, 牛颜冰, 秦雪梅. 野生柴胡资源调查[J]. 山西农业大
学学报(自然科学版), 2007,(1):103-107.
[7] 史青, 聂淑琴, 黄璐琦. 柴胡属植物化学成分及药理研究新进
展[J]. 中国实验方剂学杂志, 2002,(5):53-56.
[8] 张义玲, 冯成强, 孟繁蕴, 等. 药用柴胡属植物产地与化学成
分相关性研究[J]. 生命科学研究, 2006,(S3):86-89.
[9] Hebert P D, Cywinska A, Ball S L, et al. Biological identifi⁃
cations through DNA barcodes[J]. Proc Biol Sci, 2003,270:
313-321.
[10] Hebert P D, Ratnasingham S, Dewaard J R. Barcoding ani⁃
mal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among
closely related species[J]. Proc Biol Sci, 2003,270(Suppl 1):
S96-S99.
[11] 于华会, 杨志玲, 杨旭, 等. 药用植物种质资源 ITS序列研究进
展[J]. 中草药, 2010,(3):491-496.
[12] Ferro M, Antonio E A, Souza W, et al. ITS can: a web-
based analysis tool for internal transcribed spacer(ITS) se⁃
图2 基于 ITS序列构建的北柴胡及银州柴胡NJ树
图中只显示分支支持率≥50%的分支，Bootstrap 1000次重复
104
quences[J]. BMC Res Notes, 2014,(7):857.
[13] 李晓伟, 王玉庆, 杜国军, 等. 药用柴胡资源调查及市场现状
分析[Z]. 兰州, 2012:7.
[14] 魏建和, 陈士林, 魏淑秋, 等. 北柴胡适生地分析及数值区划
研究[J]. 世界科学技术, 2005,(6):125-129.
[15] 刘晓龙, 尚志钧. 银州柴胡的原植物再讨论[J]. 中药材, 1994,
(9):40-42.
[16] 徐国钧, 徐珞珊. 常用中药材品种整理和质量研究（第三册）
[M]. 福州: 福建科学技术出版社, 1997:1.
[17] 李明芳. 中药柴胡的物种调查和鉴定[J]. 时珍国医国药, 2006
(8):1515-1516.
[18] 刘力, 晁志, 杨志业, 等. 基于 ITS区多态性研制用于柴胡属植
物来源生药鉴定的寡核苷酸 DNA芯片 [J]. 中国药学杂志,
2010,(11):821-824.
[19] Xie H, Huo K K, Chao Z, et al. Identification of crude
drugs from Chinese medicinal plants of the genus Bupleurum
using ribosomal DNA ITS sequences[J]. Planta Med, 2009,75
(1):89-93.
西北野生药用植物红茂草资源的
研究与利用
化学工业出版社出版
赵强、王庭璞、索有瑞 著
本书是我国首部关于红茂草（秃疮花）药物资源研究与
开发的专著，以我国西部地区两年生或多年生特色野生药用
植物红茂草为研究对象，采用天然药物化学、生态学、植物
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理学特征、人工栽培与田间规范化种植、药物活性成分检测
提取与分离鉴定、生物活性与药理作用、临床应用与产业化
开发等多个角度进行了全面系统的定位研究，为我国药用植
物的研究与开发提供了一定的科学数据与理论基础。
可供生物学、药物学、植物生理生态学、天然产物学、植
物资源学等领域的科研人员和相关专业师生参考使用。
书号：9787122238801 开本：16开
定价：298.0元 出版日期：2015年9月
袁伯川等：北柴胡与银州柴胡的 ITS条形码鉴定研究 105