全 文 ：·基础研究 ·
长苞铁杉 nrDNA内转录间隔区
及 5.8 S的二级结构分析研究＊
阚显照 1, 2, 3 , 乔才元 1 , 高　卉 1 , 朱国萍 1, 2
(1.中国科学院植物研究所系统与进化植物学国家重点实验室 , 北京 100093;
2.安徽师范大学生命科学学院生物大分子进化重点实验室 , 安徽 芜湖 241000 ;
3.生物环境与生态安全安徽省高校重点实验室 , 安徽 芜湖 241000))
摘　要:核糖体 RNA及相邻区域的二级结构研究 ,作为一个重要的工具 , 已在一些分类等级上被应用于系统
发育的分析 。以长苞铁杉为实验材料 ,通过克隆 、测序 , 利用最小自由能原理预测 nrDNA内转录间隔区及 5.8S
转录本的二级结构 , 分析它们的结构特点 , 探讨假基因化拷贝与功能拷贝结构上的差异。 分析结果表明:(1)
ITS1区的二级结构主要由几个延展的发夹结构组成 , 配对的亚重复单位在松科植物特有的保守序列处有部分
重叠 ,未配对的亚重复单位通常能自身折叠 , 保守序列的部分碱基出现在发夹结构的环中;(2)假基因化拷贝二
级结构的自由能比正常拷贝高;(3)与正常拷贝的二级结构相比 , 假基因化拷贝在进化速率很低的 5.8S功能区
发生较大的变异 , 且在 5.8 S末端没有和 26 S连接配对。
关键词:二级结构;长苞铁杉;核 rRNA;内转录间隔区;5.8 SrRNA;假基因
中图分类号:Q349.55;Q949.66
文献标识码:A
文章编号:1007-7146(2007)03-0327-07
SecondaryStructureAnalysisonthenrDNAInternal
TranscribedSpacersand5.8 SinNothotsugalongibracteata
KANXian-zhao1, 2, 3 , QIAOCai-yuan1 , GAOHui1 , ZHUGuo-ping1, 2
(1.StateKeyLaboratoryofSystematicandEvolutionaryBotany, InstituteofBotany, Chinese
AcademyofSciences, Beijing100093, China;2.KeyLaboratoryofBio-MacromolecularEvolution,
ColegeofLifeScience, AnhuiNormalUniversity, Wuhu241000, Anhui, China;3.KeyLaboratory
ofBioticEnvironmentandEcologicalSafetyofAnhuiProvince, Wuhu241000, Anhui, China)
Abstract:StudiesonthesecondarystructuresofrRNAsandadjacentregionshasbeenconsideredasanimportanttool
forinferringphylogeneticrelationshipsatsometaxonomiclevels.Basedonmolecularclone, sequencingandsecondary
structureanalysisonnrDNAITSand5.8 SregioninNothotsugalongibracteatabytheprincipleofminimizingfreeener-
gy, structuralcharacteristicswerestudied.Moreover, wediscussedthestructuraldifferencesbetweenpseudogeniccopy
andfunctionalcopies.Theresultsshowedasfolows:(1)thesecondarystructureofITS1 isdominatedbyseveralex-
tendedhaipins, withpairedsubrepeatspartiallyoverlappingattheconservedmotifuniqueforPinaceae, whileunpaired
subrepeatsbeingfoldontoitselfandleavingpartoftheconservedmotifexposedinhairpinloops;(2)thefreeenergy
第 16卷第 3期
2007年 6月 　　　　　　　　　
激　光　生　物　学　报
ACTA　LASER　BIOLOGY　SINICA　　　　　　　　　　　Vol.16No.3Jun.2007
＊ 收稿日期:2006-05-20
基金项目:国家自然科学基金(30500300);教育部科学技术研究重点项目(206066);安徽省引进海外留学人才基
金 (2005Z032)
作者简介:阚显照(1968— ), 男 , 安徽巢湖人 , 中国科学院植物研究所在读博士生 , 安徽师范大学生命科学学院讲
师.主要研究方向:系统与进化生物学.(电子邮箱)xianzhao@ibcas.ac.cn;(电话)010-62836641
valueofpseudogeniccopyisoftenhigherthanthatoffunctionalcopy;(3)comparedwithfunctionalcopies, thepseudo-
geniccopyhasmorevariablesitesinthe5.8 Sregion, whichissymbolizedbyslowevolutionrate, andhasnocontact
sitesinthe3 endwith26 SribosomalRNA.
Keywords:secondarystructure;Nothotsugalongibracteata;nrRNA;internaltranscribedspacer, 5.8 SRNA, pseud-
ogene
　　真核生物 rRNA基因(rDNA)家族是由多拷贝的
基因重复组成的。每个重复单位包括下列区域 :(1)
相应于 18 S和 26 SrRNA的拷贝区 ;(2)外转录间隔
区 (ETS);(3)内转 录间隔区 (internaltranscribed
spacer, ITS),被 5.8 SrRNA基因分成内转录间隔区
1(ITS1)和内转录间隔区 2(ITS2);(4)与 rRNA结构
基因相邻的一段非转录间隔区(NTS)。
自从 20世纪七十年代末 DNA序列测定开始以
来 ,关于核糖体 RNA及其邻近区域的二级结构研究
在不断增长 [ 1] 。利用最邻近能量参数的自由能最小
原理进行 RNA二级结构的预测工作开始于 Tinoco
等 [ 2-4] 。经过一系列对动态计算方程的研究 ,二级结
构预测的方法越来越有效 [ 5-8] 。
我国特有濒危物种长苞铁杉 (Nothotsugalongi-
bracteataHuexPage)是松科中一个重要类群 ,关于其
系统位置曾经存在一些争议 [ 9] 。研究长苞铁杉
rDNA的分子演化机制对于我们理解松科 rDNA演化
及长苞铁杉自身演化特点具有十分重要的意义。本
文以长苞铁杉为实验材料 ,通过克隆 、测序 ,利用最
小自由能原理预测了核内转录间隔区及 5.8 SrDNA
转录本的二级结构 ,分析了它们的结构特点 ,探讨了
假基因化拷贝与功能拷贝结构上的差异。
1　材料与方法
1.1　DNA数据来源
实验材料为长苞铁杉 (Nothotsugalongibracteata
HuexPage), 采集地为湖南省新宁 ,凭证标本保存
在中国科学院植物研究所标本馆 (PE),标本号为
9913。通过 PCR扩增 、克隆 、阳性克隆的筛选 、异质
性克隆的鉴定 、测序等 ,获得 rDNAITS四个克隆的
序列 ,序列已提交至 GenBank, GenBank接受号及序
列的长度见表 1(实验方法及假基因化克隆的鉴定详
见阚显照等另文 “长苞铁杉 nrDNAITS区假基因化
拷贝的克隆及序列分析研究 ”)。
1.2　数据处理
分别对长苞铁杉 rDNAITS区四个克隆拷贝的
ITS1、5.8 S、ITS2及部分 26 S始端序列的转录本进
行了二级结构的预测。二级结构预测的软件为
Mfoldwebserverver3.2 (Mathews等 [ 10] , Zuker[ 11] )。
表 1　长苞铁杉 ITS的长度 (bp)及 GenBank序列
接受号
Tab.1　Length(bp)andGenBankaccessionNos.
oftheITSregioninNothotsugalongibracteata
克隆
Clones
ITS1 5.8S ITS2 ITS
长度
Length
长度
Length
长度
Length
长度
Length
GenBank序列接受号GenBankAccessionNos.
Nlo-9 1345 162 249 1756 DQ975349
Nlo-10 1345 162 249 1756 DQ975350
Nlo-16 1346 162 249 1757 DQ975351
Nlo-7 1337 162 246 1745 EF143914
　　注:带有阴影背景的为假基因化拷贝的数据
Note:Shadedsequencedenotethepseudogenicclone
二级结构预测的参数设置如下:(1)折叠温度
(foldingtemperature)为 37 ℃;(2)序列类 型为
RNA、线状 (linear)(3)离子条件 (ionicconditions)
为 1 MNaCl,无二价离子 (divalentions);(4)计算
的最大折叠数 (upperboundonthenumberofcompu-
tedfoldings)为 50;(5)窗口参数 (windowparameter)
为 20 (ITS1)和;(6)凹凸环的最大值 (maximiumsize
ofabulge/interiorloop)为 30碱基 ;(7)凹凸环最大
不对 称数 (maximum asymmetryofabulge/interior
loop)为 30;(8)碱基对之间的最大距离值 (maxi-
mumdistancebetweenpairedbases)为无限制 (nolim-
it)。二级折叠的选择参照 Campbel等 (2005)[ 12] 。
2　结果
2.1　ITS1的二级结构分析
对长苞铁杉 rDNAITS1部分进行二级结构的预
测 。四个克隆序列的二级结构的特征见表 2,假基因
化拷贝的二级结构预测图见图 1。在相同的折叠参
数下 ,这四个克隆的折叠数目及最低自由能相差不
大 。从亚重复单位配对的方式看 , Nol-9只有一种构
象 ,而其它三个克隆均有二种构象 。 Nol-9的 SR1
(亚重复单位 1)和 SR2(亚重复单位 2)的大部分碱
基能配对 ,且 SR1和 SR2保守序列(conservedmotifs)
328　　　　　　　　　　　　　　激　光　生　物　学　报　　　　　　　　　　　第 16卷
在茎环结构中呈轴向排列 , 它们的起始四个碱基
(GGCC)互相配对 ;SR3没有参与配对 ,它的保守序
列 (conservedmotifs)中的四个碱基(GGCC)出现在发
夹结构环中 。
表 2　基于 Mfold模型产生的长苞铁杉 ITS1二级
结构特征
Tab.2　ITS1 secondarystructuralfeaturesbasedon
MfoldmodelsinNothotsugalongibracteata
克隆
Clones
折叠数
Fold
自由能
■Ga
亚重复配对
SRpairingb
保守序列
Conservedmotifsc
1 2 3
Nol-7 7 -622.8 1-2, M Axiald AxialGGCC
-613.5 None GG GG GGCC
Nol-9 6 -626.4 1-2, M AxialAxialGGCC
Nol-10 7 -621.3 1-2, M AxialAxialGGCC
-616.3 None GG CCACCGGCC
Nol-16 7 -626.4 1-2, M AxialAxialGGCC
-623.2 None GG CCACCGGCC
注:a.由 Mfold软件产生的的自由能值(千卡 /摩);
b.表示互相配对的亚重复 , M表示亚重复的大多数碱基参
与配对;
c.保守序列的序号表示在 ITS1中的位置;同亚重复单位
的序号相同;碱基符号代表出现在发夹结构环中的保守序
列碱基;
d.“Axial”表示 CM不在发夹结构中 , 轴向排列;如果两个
亚重复相互配对 , 那么 CM起始的四个碱基-GGCC-将互相
配对;
Note:a.Freeenergyvalue(kcal/mol), generatedbyMfold
software.
b.SRsthatpairwithoneanother;M indicatesthattheSRs
pairformostoftheirlengths.
c.Conservedmotifs(CMs)arenumberedbyrelativeposition
withinITS1;basesshownforaCMarethosethatareexposed
inahairpin.SSRnumbers;
d.“Axial” meansthattheCMisnotinahairpin;iftheSRis
pairedwithanotherSR, thenthe-GGCC-satthebeginningthe
CMspairwithoneanother.
图中显示 SSR的位置及结构;封闭的圆圈代表保守的核心碱基;a.SSR1和 SSR2保守核心序列的起始四个碱基
(GGCC)互相配对;b.SSR3顶部的双发夹结构 , 由三个环组成 , 保守核心序列的起始四个碱基(-GGCC-)出现在
其中一个环中。
Closedcirclemarkstheconservedmotifbase.a.Thefirstfourbasesoftheconservedmotif(GGCC)ofSSR1 andSSR2
pairwithoneanother.b.ThedoublehairpinatthetipoftheSSR3, composedofthreeloops, andthefirstfourbasesof
theconservedmotif(-GGCC-)exposedinaloop.
图 1　长苞铁杉(Nothotsugalongibracteata)nrDNAITS1区假基因化拷贝 Nol-7的 RNA转录二级结构预测图
Fig.1　PredictedsecondarystructureofRNAtranscriptofITS1ofNothotsugalongibracteata, showingSSRs
329第 3期　　　　　　　　　阚显照等:长苞铁杉 nrDNA内转录间隔区及 5.8S的二级结构分析研究　　　　　　　　
　　克隆 Nol-7、Nol-10、 Nol-16除了和 Nol-9相同的
构象外 ,另一种构象的三个亚重复单位均无配对 ,它
们 SR1和 SR3的保守序列出现在在发夹结构环中的
碱基分别为 GG和 GGCC;Nol-7的 SR2出现在发夹
结构环中的保守序列碱基为 GG,而 Nol-10、 Nol-16
的为 CCACC。另外未配对亚重复单位的顶部易形成
双发夹结构 ,如 Nol-7的 SSR3(图 1)。
2.2　5.8 SrRNA的二级结构分析
对长苞铁杉四个克隆的 5.8 SrDNA的 RNA转
录进行了二级结构的预测。以假基因化拷贝 Nol-7
和正常克隆拷贝 Nol-10为例进行比较分析。假基因
化拷贝 Nol-7的最低自由能为 -43.50 kcal/mol,比
正常拷贝的要高许多 ,如 Nol-10的最低自由能为 -
54.30 kcal/mol。从图 2中可看出 ,长苞铁杉 5.8S
rDNA二级结构可分五个区 ,即 A、B、C、D、E。
A区(regionA)主要为 5.8S始端和末端的碱基 ,
Nol-7的 A区有 3个碱基发生变异 ,分别包含游离的
12碱基单链始端及 6碱基单链末端 ,而正常克隆
Nol-10的最始端 2个碱基与末端两个碱基配对 ,形
成一个 7碱基内环。
带封闭圆圈的表示变异的位点 ,黑点代表被子植物 5.8 S保守的序列。
Variablepositionsaremarkedwithclosedcircles.Theblackdotmarkstheconservedmotifbase.
图 2　长苞铁杉 5.8 SrDNA的 RNA转录二级结构预测图 , 其中 a为 Nol-7, b为 Nol-10
Fig.2　PredictedsecondarystructureofRNAtranscriptof5.8 SrDNAofNothotsugalongibracteata.a:Nol-7;b:Nol-10
330　　　　　　　　　　　　　　激　光　生　物　学　报　　　　　　　　　　　第 16卷
B区(regionB)是一个茎环结构 ,环上的序列为 AU-
GAAGAA,是一个富含 A的环 (A-richloop);Nol-10
茎上有 8个碱基对 ,而 Nol-7的第 34和第 56碱基分
别发生 C※U的转换 (transition)及 A※C的颠换
(transversion),因此茎上只 6个碱基对 。
C区(regionC)是一个双发夹结构 ,包含二个外
环 、二个内环(internalloop)及茎区。 C1区为被子植
物保守的 14核苷酸序列(5 -GAAUUGCAGAAUCCC-
3 )(Jobes等 , 1997)[ 13] ,这表明被子植物 5.8S保守
序列在裸子植物中也出现 。但在假基因化拷贝 Nol-
7中发生了一个 C※U的突变 ,使得这个保守序列变
为 5 -GAAUUGCAGAAUUCC-3 。 C2区 (位置 :#90-
117)为富含 AT区(AT-richregion), 28个碱基中 , AT
占 71.43 %。
D区(regionD)((位置:#118-141))为 GC丰富
区 (GC-richregion)。 Nol-10 D区 24个碱基中 , GC占
79.17 %。 Nol-7在第 132和第 136位置分别发生 G
※U的颠换和 G※A的转换 , GC含量发生变化 ,占
70.83 %。
E区(regionE)为含内环的茎区。假基因化拷贝
Nol-7只含一个由 7碱基组成的内环 ,而 Nol-10则含
有 3个内环 ,其中 2个内环都由一个 U的插入而引
起的凸起 。
图 2　Nol-7 5.8 S、ITS2与 26 S始端的二级结构图
Fig.2　Secondarystructureof5.8 SITS2 and5 endof26 SinNol-7
331第 3期　　　　　　　　　阚显照等:长苞铁杉 nrDNA内转录间隔区及 5.8S的二级结构分析研究　　　　　　　　
2.3　5.8 S与 26 S接触位点的分析
本研究对长苞铁杉四个克隆的 5.8 S、ITS2和 26
S始端的 RNA转录序列进行了二级结构的预测 ,其
中参与折叠的 26 S始端序列有 29 bp, 序列来源参照
对应克隆的 ITS区 GenBank接受号 (阚显照等
2006)(表 1)。取能量最低的三个折叠进行分析 ,折
叠数及自由能值及配对的位点数如表 3。
从表 3可看出 ,假基因化拷贝 Nol-7的折叠数最
多 ,达 33个 ,其它三个正常克隆的拷贝数却只有 8 ～
13个。从自由能看 , Nol-7的自由能最高 ,为 -153.
60 kcal/mol～ -153.00 kcal/mol, 其它三个克隆的
自由能为 -191.30 kcal/mol～ -186.90 kcal/mol。
从配对的位点数目看 ,假基因化拷贝 Nol-7能量最低
的二个折叠中 ,只有在 5.8 S始端有 6个碱基与 26 S
始端配对 (图 2),而在 5.8 S末端与 26 S始端却没有
配对 ,第三个折叠 ,无论是 5.8始端或末端均无碱基
与 26 S始端配对。其它三个正常克隆均在 5.8 S末
端有 17 ～ 19个碱基与 26 S始端配对 ,而在 5.8 S始
端却很少(0 ～ 2)(图 3)。
表 3　5.8SrRNA折叠数 、自由能及 5.8 S/26S接
触位点
Tab.3　Numberoffolds, freeenergyof5.8SrRNA
andthepairing5.8 S/26 Scontactsites
克隆Clones折叠数Fold 自由能■Ga
5.8 S始端与
26 S始端配对的碱基位点数Numberofpai-ringbasesbe-tween 5 endof5.8 Sand
5 endof26 S
5.8 S末端与
26 S始端配对的碱基位点数Numberofpai-ringbasesbe-tween 3 endof5.8 Sand
5 endof26 S
Nol-7d 33 -153.60 6 0
-153.50 6 0
-153.00 0 0
Nol-9 13 -191.30 2 17
-188.50 0 17
-188.10 2 17
Nol-10 8 -192.20 2 17
-190.90 2 17
-186.90 2 17
Nol-16 9 -191.90 2 17
-189.10 0 19
-188.70 2 17
5.8 S和 26S的边界用阴影部分表示 。
Thearbitraryboundariesof5.8 Sand26 SrRNAareindicatedbyshadedboxes.
图 3　Nol-9 5.8 S与 26 S始端的二级结构示意图
Fig.3　Schematicsecondarystructureof5.8 Sand5 endof26 SinNol-9
3　讨论
最早将核糖体 RNA二级结构用于系统发育的比
较研究的是 Fox和 Woese[ 14] ,他们用的是 5 SrRNA。
在系统发育方法的比较研究中 ,一个根本原则是功
能相同的大分子显示相似的二级结构构象 [ 15] 。目
前已建立了 5 S[ 16-17] 、 5.8 S[ 18-19] 、18 S[ 20] 、26 S
rRNA的二级结构通用模型 。通过对真核生物内转
录间隔区 1(ITS1)的二级结构系列研究 ,表明它是由
一个开放的多分支环 (openmultibranchloop)与几个
螺旋(helices)组成 ,在高级分类单元上它的结构是
保守 的 , 但 在螺 旋 的数 目 及 环的 碱 基上 有 变
332　　　　　　　　　　　　　　激　光　生　物　学　报　　　　　　　　　　　第 16卷
异 [ 1, 12, 21-23] 。在松科中 , ITS1的二级结构分析已在
七个属中有报道 [ 12, 24-25] ,发现配对的亚重复单位在
松科植物特有的保守序列处有部分重叠。 Won
等 [ 26]对买麻藤属(Gnetum)进行了研究。
在对长苞铁杉 ITS1区的二级结构分析中 ,配对
的亚重复单位 1(SR1)亚重复单位 2(SR2)在松科植
物特有的保守序列处有部分重叠 ,且它们起始的四
个碱基(-GGCC-)相互配对 。假基因化拷贝 Nol-7与
功能拷贝在 ITS1区未发现结构上的重大变化。但在
5.8 S功能区发生较大的变化 ,且在 5.8 S末端没有
和 26 S连接配对的位点。同时我们的研究发现假基
因化拷贝二级结构的自由能比正常拷贝高 ,这也说
明假基因化拷贝二级结构稳定性较差。
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