免费文献传递   相关文献

刺松藻水溶性多糖的提取分离及理化性质研究



全 文 : 
第40卷 第11期  
2010年11月 
中 国 海 洋 大 学 学 报
PERIODICAL OF OCEAN UNIVERSITY OF CHINA
40(11):090~094
Nov.,2010
刺松藻水溶性多糖的提取分离及理化性质研究

于广利,嵇国利,冯以明,赵 峡,吴建东,杨 波,韩章润
(中国海洋大学医药学院,山东省糖科学与糖工程重点实验室,山东 青岛266003)
摘 要: 本文以刺松藻(Codium fragile)为原料,依次经冷水、热水提取,得到2种粗多糖CFC和CFH,经 Q-Sepharose
FF强阴离子交换色谱分离,分别从CFC和CFH中得到组分CFCP1~P6和CFHP1~P5,并对其理化性质进行了分析。
分别运用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)、高效离子色谱法(HPIC)、傅里叶变换红外光谱法(FTIR)对其分子量、单糖组成
和结构特征进行了分析。结果表明,刺松藻中多种结构复杂的多糖,CFCP1和CFCP6属于硫酸阿拉伯半乳聚糖,CFCP4
和CFHP5属于丙酮酸化的硫酸半乳聚糖,CFHP1和CFHP2分别属于葡聚糖和甘露聚糖。多糖CFCP2、CFHP2和CF-
HP3中除了含有半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖和甘露糖外,还含有木糖、鼠李糖和岩藻糖。这些结构特殊的多糖为海洋药物
研究与开发提供了良好基础。
关键词: 刺松藻;多糖;提取分离;理化性质
中图法分类号: Q949.29;R282.77     文献标志码: A     文章编号: 1672-5174(2010)11-090-05
  刺松藻(Codium fragile(sur.)Hariot),俗称青
虫子、鼠尾巴等,属于绿藻门绿藻纲管藻目松藻科松藻
属,为世界性的泛暖温带性海藻,我国沿海均有分布。
作为一种重要的绿藻资源,我国对刺松藻多糖结构和
活性的研究还远远不够。早在1960年代,love J等[1-2]
首次发现该藻中含有硫酸阿拉伯半乳聚糖、淀粉类多
糖和甘露聚糖。随着松藻多糖显著生物活性的发
现[3-5],其结构研究也不断深入,如Ciancia M等[6]证明
了该松藻水提物中含有α(1→4)-D-葡聚糖、β(1→4)-
D-甘露聚糖、高度硫酸化和丙酮酸化的β(1→3)-D-半
乳聚糖和硫酸化的β(1→3)-L-阿拉伯聚糖。以上研究
均以粗提物为研究对象,并未进行纯化组分的结构研
究。
本文以我国黄海海域的刺松藻为原料,采用冷水
和热水2种提取方法得到水溶性多糖,通过强阴离子
交换色谱分离得到不同分子量和不同硫酸基含量的多
糖,采用化学、色谱和波谱方法研究其基本理化性质及
结构特征,为刺松藻多糖资源的利用提供基础。
1 材料与方法
1.1材料与仪器
刺松藻(Codium fragile),产地黄海海域,购于荣
成海利水产食品有限公司,经中国海洋大学海洋生命
学院宫相忠副教授鉴定。
系列葡聚糖标准品(1.18,47.3,112,212,404,788
kD),购于日本Shodex公司;各种单糖标准品、牛血清
白蛋白、2,4-二硝基苯肼、丙酮酸钠,购于美国Sigma
公司;高纯度氢氧化钠和醋酸钠,购于美国Dionex公
司;其他化学试剂为国产分析纯。
PL aquagel-OH mixed不锈钢色谱柱(30cm×7.5
mm×8μm,美国 Perkin Elmer公司);离子色谱仪
(ICS3000,美国Dionex公司)及CarboPac PA20色谱
柱(保护柱3×50mm;分析柱3×150mm)(美国Di-
onex公司);红外光谱仪(Nicolet Nexus 470型,Ther-
mo Electron公司);AKTA-FPLC液相色谱仪(瑞典
Pharmacia Biotech公司);紫外可见分光光度计(UV-
2102PCS,日本尤尼柯上海公司);高效液相色谱仪
(LC-20AD,日本岛津公司)。
1.2方法
1.2.1多糖的提取  刺松藻经粉碎、过40目筛,85%
乙醇回流脱脂后,减压干燥。脱脂粉经冷水提取后离
心,上清液经浓缩、醇沉、透析、冻干得到冷水提取多糖
CFC。残渣再经95℃热水提取后离心,上清液经浓
缩、醇沉、透析、冻干,得到热水提取多糖CFH。
1.2.2分离纯化  对CFC和CFH分别用Q-Sepha-
rose FF强阴离子交换色谱柱(XK1.6cm×30cm)分
离纯化。采用0,0.5,0.8,1.0,1.2和1.4mol/L NaCl
分别洗脱2个柱体积,硫酸苯酚法检测。
1.2.3理化性质分析
1.2.3.1相对分子量测定[7]  色谱条件:色谱柱采用
* 基金项目:科技部国际合作(2007DFA30980);国家自然科学基金项目(30870506,31070724);国家海洋局公益性行业专项(201005024)资助
收稿日期:2009-11-30;修订日期:2010-05-09
作者简介:于广利(1964-),男,教授,主要从事糖化学与糖药物学研究。Tel:0532-82031560;E-mail:glyu@ouc.edu.cn
11期 于广利,等:刺松藻水溶性多糖的提取分离及理化性质研究
PL aquagel-OH MIXED凝胶色谱柱(300mm×7.8
mm),流动相为 0.2 mol/L NaNO3和 10 mmol/L
NaH2PO4,流速0.5mL/min,柱温30℃,进样量10
μL,示差折光检测器(RI)。将已知分子量的多糖标准
品及待测样品分别用流动相配成5mg/mL的溶液,运
用分析软件以标准多糖分子量的对数Y(log Mw)对保
留时间X(tR)作图,得标准曲线方程(Y=13.416-
0.5601X;R2=0.993),根据保留时间,运用方程计算
样品相对分子量。
1.2.3.2总糖、硫酸基、粗蛋白和丙酮酸含量分析[8-11]
  用硫酸苯酚法以半乳糖为标准品测定总糖含量;
用硫酸钡比浊法测定硫酸根含量;用Folin-酚法以牛血
清白蛋白为标准测定蛋白含量;用2,4-二硝基苯肼法
以丙酮酸钠为标准品测定丙酮酸含量。
表1 高效离子色谱梯度洗脱程序
Table 1 Gradient elution program of high
performance ion chromatography
时间
Time/min
蒸馏水
Distiled
water/%
500mmol/L
NaOH
/%
1mol/L
NaAc/%
梯度类型
Gradient type
0  99.6  0.4  0
20  99.6  0.4  0 Linear
20.1  94.6  0.4  5 Linear
30  79.6  0.4  20 Linear
30.1  60  40  0
40  60  40  0
1.2.3.3单糖组成分析[12-14]  取多糖样品各2mg
于安瓿瓶中,加入2mol/L的三氟乙酸(TFA)1mL,
封口,120℃水解4h。水解液旋转蒸发至干,得完全
酸水解单糖样品。根据文献采用高效阴离子色谱法分
析。色谱条件为:CarboPac PA20色谱柱,流速0.5
mL/min,脉冲安培检测器(Au工作电极,Ag/AgCl
参比电极,四电位波形),柱温30℃,进样量10μL。洗
脱液种类和梯度洗脱程序见表1。
1.2.4红外光谱分析[14]  样品用P2O5干燥48h,取
1~2mg经 KBr压片,红外光谱扫描范围为400~
4 000cm–1。
2 结果与讨论
2.1多糖的提取
将海藻50℃烘干后,粉碎过40目筛备用。取海
藻粉100g,经85%乙醇回流脱脂2h×2次后,干燥,
得藻粉83.5g。该脱脂工艺不仅能除脂肪酸和萜类,
而且能脱除海洋藻类中大量无机盐,以及少量糖脂和
氨基酸等极性小分子,有利于后续多糖的提取。在多
糖提取过程中发现,冷水提取液用4倍体积的乙醇很
难沉淀下来,如加入少量醋酸钠后有利于多糖絮凝和
沉淀,说明该冷水提取多糖属于硫酸多糖。冷水提取
液经醇沉、透析除盐后,CFC得率为7.0%,热水提取
液经醇沉、透析除盐后,CFH得率为8.1%。该藻水溶
性多糖的总得率较低(15.1%),藻体中还有大量不溶
性膳食纤维(29%)[15],这些水不溶性多糖需要采取其
它方法进行提取,本文未做进一步研究。
2.2分离纯化
为了分析CFC和CFH 中多糖的种类及其特性,
采用Q-Sepharose FF强阴离子交换柱进行分离纯化,
在大量试验基础上,采用0,0.5,0.8,1.0,1.2,1.4
mol/L NaCl进行阶梯式梯度洗脱效果最理想。各组
分透析脱盐后,冷冻干燥,分别得到CFCP1(P6和CF-
HP1(P5共11个多糖组分。分离结果见图1。从图1
结果可知,CFC比CFH电荷分布更复杂,CFC中含有
较高含量的酸性多糖(CFCP5~6),而CFH 中含有较
多低电荷多糖(CFHP2)。本文的分离图谱与文献[16]
报道的显著不同,后者水洗脱组分得率占粗多糖
42.6%,而本实验水洗脱组分得率只有16.8%。
图1 CFC和CFH的Q-Sepharose FF柱分离图
Fig.1 Separation graph of CFC and CFH on Q-Sepharose FF column
2.3多糖的理化性质分析 11种多糖的分子量及含量组成比较和单糖组成及
19
中 国 海 洋 大 学 学 报 2 0 1 0年
其摩尔比分析结果分别见表2和表3。从表中数据可
知,各组分分子量、总糖含量、粗蛋白含量、硫酸基含量
和丙酮酸含量分别在12~1 300kD,30.8%~78.4%,
1.9%~11.0%,4.5%~32.9%和0.3%~8.4%之间,
单糖种类从3~7种不等,有阿拉伯糖(Ara)、半乳糖
(Gal)、葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)、木糖(Xyl)、鼠李
糖(Rha)和岩藻糖(Fuc)。
通过理化性质分析可知这11种多糖分子量和硫
酸基含量差异明显,并含有少量的蛋白质和丙酮酸,据
单糖组成的差异可分为四大类,富含葡萄糖的组分(如
CFHP1)、富含甘露糖的组分(如CFHP2)、富含阿拉伯
糖的组分(CFCP1和CFCP6)和富含半乳糖的组分(如
CFCP4和CFHP5)。Estevez JM 等[16]用DEAE-A25
从刺松藻水提物中分离得到10种多糖,这10种多糖
在单糖种类、摩尔比以及硫酸基含量等方面均和本实
验结果不同,表明它们虽然属于同一种藻,但由于产地
不同,其多糖种类、结构显著不同。
表2 11种多糖的分子量及总糖含量分析
Table 2 The molecular weight and total sugar content analysis of eleven kinds of polysaccharides
组分
Fraction
分子量
Mr/kD
得率**
Yield/%
总糖
Total sugar/%
粗蛋白
Crude protein/%
硫酸基
Sulfate/%
丙酮酸
Pyruvic acid/%
CFCP1  1300  16.8  35.0  6.2  32.9  4.5
CFCP2  19  3.5  58.8  9.6  6.4  2.6
CFCP3  12  5.8  55.6  3.9  23.5  6.1
CFCP4  29  11.4  66.5  3.6  21.0  6.2
CFCP5  121*/39  9.2  44.0  1.9  24.8  7.4
CFCP6  56  9.3  30.8  3.2  32.4  4.0
CFHP1  980  1.2  78.4  5.3  5.6  0.3
CFHP2  231  16.5  58.8  11.0  4.5  2.4
CFHP3  300*/20  1.5  34.8  5.7  22.5  1.3
CFHP4  178*/42  12.6  68.3  3.4  17.3  6.9
CFHP5  114  12.3  49.1  2.3  21.0  8.4
    *主要峰;**相对于粗多糖
表3 11种多糖单糖组成及其摩尔比分析
Table 3 Monosacchairdes and their molar ratio of
eleven kinds of polysaccharide
Fuc  Rha  Ara  Gal  Glc  Xyl  Man
CFCP1 - - 7.99  5.78  3.32  0.45  1
CFCP2  0.13  0.35  0.19  0.78  0.32  0.10  1
CFCP3 - 0.49  0.65  4.51  1.74  1.11  1
CFCP4  0.08  0.10  0.21  6.72  1 - -
CFCP5  0.13 - 1.57 15.82  1 - -
CFCP6 - - 9.36  2.52  1 - -
CFHP1 - - - 0.84 12.62 0.85  1
CFHP2 0.47  1.45  0.77  2.22  1  1.34  8.32
CFHP3 0.32  1.19  1.48  8.18  4.40  2.03  1
CFHP4 0.37  0.78  1.29 34.48 25.78 2.16  1
CFHP5 0.20 - 2.18 16.02 6.78  0.48  1
-表示未检出
研究发现,CFCP1和CPCP6含有类似的硫酸酯基
含量,前者在 Q-FF柱中不能保留,而后者则与 Q-FF
有强吸附力,二者主要差别是分子量不同。Estevez
JM等[16]遇到类似现象,其解释为该类多糖与二价阳
离子(Ca2+和 Mg2+)结合形成较大聚集体,从而阻碍其
与树脂发生交换吸附。CFHP1为中性葡聚糖,其分子
量很大(980kD),优先被水洗脱;CFCP2主要含有
Man和Gal,而CFHP2主要含有 Man,两者硫酸基含
量相对较低(6.4%和4.5%),被0.5mol/L NaCl洗
脱;CFCP3和 CFHP3是杂聚糖,主要含 Gal、Glc和
Xyl,其硫酸基含量较高(23.5%和22.5%),被0.8
mol/L NaCl洗脱;CFCP4和CFCP5为富含Gal的组
分,硫酸基含量较高(21.0%和24.8%),其中CFCP4
分子量分布均一(29kD),主要为硫酸半乳聚糖,而
CFCP5由121和39kD 2个不同分子量的组分组成;
CFHP4和CFHP5为主要含 Gal和 Glc的多糖组分,
硫酸基含量也较高(17.3%和21.0%),其中CFHP5
分子量分布均一(114kD),而CFHP4由178kD和42
kD两个不同分子量的组分组成。总的来看,热水提取
组分比冷水提取组分的分子量大,葡萄糖含量高,硫酸
29
11期 于广利,等:刺松藻水溶性多糖的提取分离及理化性质研究
基含量稍低。此外,各组分均有少量丙酮酸,且丙酮酸
含量与半乳糖含量成正比,可以推知丙酮酸主要存在
于半乳糖残基上。
本文得到的CFCP1和CFCP6属于高硫酸化的阿
拉伯半乳聚糖,根据文献[3]可知,该组分具有强抗凝
血活性,具有较好的开发利用前景。
2.4红外光谱分析
文献研究明确[1,2,6],刺松藻中含有1,4-连接的葡
聚糖和1,4-连接的甘露聚糖,以及结构复杂的硫酸多
糖[6,16]。本文主要比较分析了4种分子量分布均一且
硫酸基含量较高的多糖组分(CFCP1,CFCP6,CFCP4
和CFHP5)的红外光谱(见图2)。由图2可知,4种多
糖均在3 400,2 900,1 645和1 250cm-1有吸收峰,分
别是糖环中O-H伸缩振动、C-H伸缩振动、C=O伸缩
振动和硫酸酯基S=O伸缩振动吸收峰。其中CFCP1
和CFCP6的IR图谱相似,1 140、1 062和1 000cm-1
附近的强吸收峰,是硫酸阿拉伯半乳聚糖中糖环C-O
伸缩振动峰,846和820cm-1左右的吸收峰,分别是C-
4位和C-2位硫酸酯基C-O-S伸缩振动峰。
CFCP4和CFHP5的IR图谱相似,1 730和1 415
cm-1左右的弱吸收峰,是丙酮酸羧基C-O的伸缩振动
吸收峰;在1 055和932cm-1左右的吸收峰,是丙酮酸
化的硫酸半乳聚糖糖环C-O伸缩振动吸收峰,在845
cm-1左右的吸收峰,是C-4位硫酸酯基C-O-S伸缩振
动吸收峰。
图2 CFCP1(a)、CFCP6(b)、CFCP4(c)和CFHP5(d)的红外光谱图
Fig.2 IR spectra of CFCP1(a)、CFCP6(b)、CFCP4(c)and CFHP5(d)
3 结语
本文以刺松藻为原料,采用冷水和热水提取得到
了2种粗多糖,分别经Q-Sepharose FF强阴离子交换
色谱分离后得到11种结构不同的多糖组分,其中CF-
CP1和CFCP6属于硫酸阿拉伯半乳聚糖,其硫酸基主
要在C-2和C-4位;CFCP4和CFHP5属于硫酸半乳
聚糖,硫酸基主要在C-4位,且部分糖环羟基被丙酮酸
取代。CFHP1属于葡聚糖,CFHP2属于甘露聚糖。
多糖CFCP2、CFHP2和CFHP3中除了含有半乳糖、
阿拉伯糖、葡萄糖和甘露糖外,还含有木糖、鼠李糖和
岩藻糖。这些结构特殊的多糖不仅为从事糖类构效关
系研究提供了物质基础,也为进一步开发该绿藻类多
糖资源提供了科学依据。
参考文献:
[1] Love J,Percival E.Polysaccharides of the green seaweed Codium
fragile[J].Biochemical Journal,1962,84:29-33.
[2] Love J,Percival E.The polysaccharides of the green seaweed Co-
dium fragile:PartⅡ The warter-soluble sulphated polysaccha-
rides[J].J Chem Soc,1964,3338-3345.
[3] Siddhanta A K,Shanmugam M,Mody K H,et al.Sulphated pol-
ysaccharides of Codium dwarkense Boergs.from the west coast of
India:chemical composition and blood anticoagulant activity[J].
International Journal of Biological Macromolecules,1999,26:
151-154.
[4] Athukorala Y,Lee KW,Kim S K,et al.Anticoagulant activity of
marine green and brown algae colected from Jeju Island in Korea
[J].Bioresource Technology,2007,98:1711-1716.
[5] Matsubara K,Matsuura Y,Baccic A,et al.Anticoagulant prop-
erties of a sulfated galactan preparation from a marine green alga,
Codium cylindricum [J].International Journal of Biological Mac-
romolecules,2001,28:395-399.
39
中 国 海 洋 大 学 学 报 2 0 1 0年
[6] Ciancia M,Quintana I,Vizcarguenaga M I,et al.Polysaccharides
from the green seaweeds Codiumfragileand C.vermilara with
controversial effects on hemostasis[J].International Journal of
Biological Macromolecules,2007,41:641-649.
[7] 杨海,赵峡,于广利,等.高效液相色谱法测定注射用灰树花倍他
葡聚糖的含量及含量均匀度 [J].中国生化药物杂志,2007,28
(2):81-85.
[8] Therho T T,Hartiala K.Method for determination of the sulfate
content of glycosamino glycans [J].Analytical Biochemistry,
1971,41:471-477.
[9] Dubois M,Giles K A,Hamilton J K.Colorimetric method for de-
termination of sugars and related substances[J].Anal.Biochem,
1956,350-358.
[10] Lowry R,Ramdal F.Protein measurement with the Folin Phe-
nol reaction[J].Biol Chemical,1951,193:265.
[11] Sloneker J H,Orentas D G.Pyruvic Acid,a unique Component
of an Exocelular Bacterial Polysaccharide[J].Nature,1962,
194:478-479.
[12] 梁立娜,张萍,蔡亚岐,等.高效阴离子交换-脉冲安培检测同时
分析单糖和糖醛酸 [J].分析化学,2006,10(34):1371-1374.
[13] Quemener B,Lahaye M,Bobin-Dubigeon C.Sugar determina-
tion in ulvans by a chemical-enzymatic method coupled to high
performance anion exchange chromatography[J].Journal of Ap-
plied Phycology,1997,9:179-184.
[14] 嵇国利,于广利,吴建东,等.爆发期条浒苔多糖的提取分离及
其理化性质研究 [J].中国海洋药物,2009,28(3):7-12.
[15] 邵海艳,吉宏武,章超桦,等.刺松藻化学成分测定及其营养评
价 [J].食品研究与开发,2007,28(10):160-162.
[16] Estevez J M,Fernandez P V,Kasulin L,et al.Chemical and in
situ characterization of macromolecular components of the cel
wals from the green seaweed Codium fragile[J].Glycobiology,
2009,19(3):212-228.
Extraction,Isolation and Physiochemical Character Studies of Water Soluble
Polysaccharides from Codium fragile
YU Guang-Li,JI Guo-Li,Feng Yi-Ming,ZHAO Xia,WU Jian-Dong,Yang Bo,Han Zhang-Run
(Shandong Provincial Key Laboratory of Glycoscience and Glycoengineering,School of Medicine and Pharmacy,Ocean Uni-
versity of China,Qingdao 266003,China)
Abstract: Two types of crude polysaccharides CFC and CFH were extracted fromCodium fragile with
cold and hot water,respectively.Fractions named as CFCP1~P6and CFHP1~P5were purified from
CFC and CFH with Q-Sepharose FF anion-exchange chromatography.Their averaged molecular mass
(Mr),monosaccharide composition and structural features were determined with high performance gel
permeation chromatography(HPGPC),high performance ion chromatography(HPIC)and fourier trans-
form infrared spectroscopy(FTIR),respectively.The results showed there were many kinds of complex
polysaccharides in Codium fragile.CFCP1and CFCP6were sulphated arabinogalactan,CFCP4and CF-
HP5were pyruvylated sulfated galactan,CFHP1was glucan,CFHP2was mannan.Apart from galac-
tose,arabose,glucose,and mannose,some content of xylose,rhamnose and fucose were also found in
CFCP2,CFHP2and CFHP3.Al these structural unique polysaccharides offered good basis for marine
drug research and development.
Key words: Codium fragile;polysaccharide;extraction and purification;physiochemical characters
责任编辑 徐 环
49