全 文 ：刘红全． 菱形藻 HE06 产二十碳五烯酸培养条件优化［J］． 江苏农业科学，2016，44(6):317 － 320．
doi:10． 15889 / j． issn． 1002 － 1302． 2016． 06． 090
菱形藻 HE06 产二十碳五烯酸培养条件优化
刘红全
(广西民族大学海洋与生物技术学院，广西南宁 530000)
摘要:二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)对缓解心律不齐、高血压等疾病具有重要作用，对调节情绪、治疗
风湿性关节炎及哮喘也具有积极意义。通过优化氮源和碳源、添加生长因子等途径提高菱形藻 HE06 的 EPA 产率。
经优化得到硝酸钠、氯化铵、尿素、维生素 B1、维生素 B12、生物素、葡萄糖、甘油、碳酸氢钠的最佳质量浓度分别为
75 mg /L、5 mg /L、30 mg /L、1． 5 mg /L、6 μg /L、10 μg /L、1． 2 g /L、2． 4 g /L、1． 2 g /L。在最佳优化条件下，EPA产率由最
初的 31． 2 μg /L提升至 504． 8 μg /L，提高了 15 倍;生物量产率由 19． 5 mg /L提高至 32． 4 mg /L，提高了 66． 2%。
关键词:菱形藻;培养条件;二十碳五烯酸(EPA)
中图分类号:S917 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2016)06 － 0317 － 04
收稿日期:2015 － 05 － 05
基金项目:国家自然科学基金(编号:30960215);广西自然科学基金
(编号:桂科青 0728019)。
作者简介:刘红全(1975—)，男，黑龙江肇东人，博士，副教授，主要从
事生物技术研究。E － mail:lhongquan@ 163． com。
二十碳五烯酸(EPA)对高血压、动脉粥样硬化、血栓等心
血管疾病的预防和治疗具有重大意义。在 20 世纪 80 年代
前，EPA主要从鱼油中提取，由于其含量低、成分复杂等原
因，致使 EPA 价格昂贵，难以满足人们日益增长的需求。随
着微藻产 EPA研究的深入，EPA的价格越来越低。微藻 EPA
含量高、生产条件低、提取工艺简单，已成为生产 EPA 极具潜
力的原料来源。虽然野生型的微藻 EPA 含量高，但也不足以
工业化生产，因此须对微藻进行生产条件优化。采用正交设
计方法优化氮源、维生素、植物激素、碳源用量，从培养基优化
方面提高菱形藻 HE06 的 EPA产率。
1 材料与方法
1． 1 仪器与藻种
LDZX －50 KB型立式压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器
械厂)，超净工作台(苏净集团安泰公司)，CFM － 5002 型荧光
倒置显微镜(上海安捷伦公司)，LＲH － 250 － GSII 型人工气
候箱(广东省医疗器械厂)，Scientz － 10N 型冷冻干燥机，
GC20 － 14B型气相色谱。
藻种 HE06 由笔者所在实验室分离自广西壮族自治区钦
州市茅尾海自治区级红树林保护区，经鉴定为菱形藻属。该
藻培养于 f /2 培养基中，人工气候箱的培养条件为光照度
4 000 lx、暗光比 12 h /12 h、温度(24 ± 1)℃、湿度 40%。
1． 2 生长条件优化
于 500 mL锥形瓶内装入 180 mL液体培养基，按照 10%
的接种量在超净台中接种对数期藻种。
1． 2． 1 氮源优化 分别以 f /2 原培养基中氮源物质的量为
中间点，向左右延伸 2 个质量浓度，分别设置硝酸钠单因素优
化质量浓度。分别设置硝酸钠的质量浓度为 55、65、75、85、
95 mg /L;分别设置氯化铵的质量浓度为 35、41、47、53、
60 mg /L;分别将尿素的质量浓度调整为 10、20、30、40、
50 mg /L。氮源的正交试验选用最佳硝酸钠、氯化铵、尿素单
因素优化值及其左右邻值进行 4 因素 3 水平正交试验优化。
1． 2． 2 维生素优化 维生素的质量浓度参照 f /2 培养基的
质量浓度进行设置。生物素的质量浓度分别为 0． 5、1． 0、
2. 0、4． 0、8． 0 μg /L;维生素 B1 的质量浓度分别为 0． 05、0． 10、
0. 20、0． 40、0． 80 mg /L;维生素 B12的质量浓度分别为 0. 25、
0. 50、1． 00、2． 00、4． 00 μg /L。维生素的正交试验选用最佳生
物素、维生素 B1、维生素 B12单因素优化值及其左右邻值进行
4 因素 3 水平正交试验优化。
1． 2． 3 植物激素优化 IAA 的质量浓度分别为 0． 5、1． 0、
2. 0、4． 0、8． 0 mg /L;6 － BA、赤霉素的质量浓度分别为 0． 2、
0. 4、0． 6、0． 8、1． 0 mg /L。植物激素的正交试验选用最佳
IAA、6 － BA、赤霉素单因素优化值及其左右邻值进行 4 因素
3 水平正交试验优化。
1． 2． 4 碳源优化 葡萄糖的质量浓度分别为 0． 3、0． 6、0． 9、
1． 2、1． 5 g /L;甘油的质量浓度分别为 0． 3、0． 9、1． 8、2． 7、
3． 6 g /L;碳酸氢钠的质量浓度分别为 0． 3、0． 9、1． 8、2． 7、
3． 6 g /L。碳源的正交试验选用最佳葡萄糖、甘油、碳酸氢钠
单因素优化值及其左右邻值进行 4 因素 3 水平正交试验
优化。
1． 3 生长速率的测定
将所有培养体系置于人工气候箱中，于 2 d 时开始测定
培养体系的 D680 nm，此后每天在规定时间测定 1 次 D680 nm。当
培养体系的 D680 nm在 3 次测定内无变化时，将 100 mL 藻液倒
入 250 mL离心瓶中，于 6 000 r /min 离心 10 min 收集藻液，
将沉淀转移至 10 mL带螺旋盖的离心管中，用去离子水洗涤
离心 2 次并冷冻干燥。干燥后的藻粉直接保存于 － 20 ℃冰
箱中。微藻的比生长速率 μ按照如下公式［1］进行计算:
μ = ln(Nt /N0)/(Tt － T0)。
式中:Nt 为稳定期悬浮藻液在 680 nm处的吸光度;N0 为接种
后 2 d悬浮藻液的 D680 nm;Tt 为进入稳定期的时间(d);T0 为
接种后 2 d的时间(d)。
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1． 4 不饱和脂肪酸的提取及测定
脂肪酸的提取及甲酯化方法参照文献［2］。将 50 mg 干
燥粉置于带螺旋盖的离心管中，加入混合溶液(三氯甲烷 ∶
甲醇 ∶ 水 = 2 ∶ 1 ∶ 0． 8)并充入 N2 1 min，以 80 W超声 20 min
后于 75 ℃ 水浴 15 min，冷却后以 4 000 r /min离心 10 min，取
三氯甲烷层;重复以上步骤 2 次，合并三氯甲烷层，加入等体
积混合溶液(甲醇 ∶ 氢氧化钠 = 2 ∶ 1)并充入 N2 1 min，以
80 W 超声 20 min 后于 75 ℃ 水浴 15 min，冷却后以
4 000 r /min离心 10 min，取上清并加入 500 μL 正己烷萃取
30 min。
对 Liang等的 EPA气相色谱测定升温程序［3］稍作改进，
初温 72 ℃保持 1 min，以 30 ℃ /min 升温至 150 ℃并保持
1 min，再以 5 ℃ /min升温至 250 ℃并保持 5 min。进样口、检
测器的温度均为 280 ℃。载气为高纯度氮气，流速为
30 mL /min，进样量为 1 μL。
2 结果与分析
2． 1 生长速率
由图 1、表 1 可知，在正交优化的 4 组试验中，进入稳定
期的时间均延后。其中，氮源、维生素、植物激素试验组进入
稳定期的时间延后至 10 d;而碳源试验组进入稳定期的时间
延后最长，达到 15 d。所有试验组的 D680 nm均有所提高，激素
正交优化组的 D680 nm与前一优化组(维生素组)相比有所下
降，表明植物激素正交试验对菱形藻 HE06 具有抑制作用，而
氮源、维生素试验组基本无变化。维生素试验组进入对数期
较快，氮源试验组适应期较长。比生长速率测定结果显示，氮
源与维生素培养优化中的比生长速率最高，而碳源组与对照
组相比基本无变化。
表 1 比生长速率测定结果
试验组 比生长速率
对照组 0． 135
氮源 0． 151
维生素 0． 150
植物激素 0． 141
碳源 0． 134
2． 2 优化结果
单因素优化结果(表 2)显示，单独添加氯化铵、尿素均能
提高菱形藻 HE06 的 EPA含量，EPA含量分别达到 0． 234%、
0． 219%，与硝酸钠作为氮源相比分别增加了 45． 3%、
36. 0%。但在单因素优化中，其生物量产率均有所下降，而在
随后多种氮源正交优化中，与未优化对照组相比，生物量产率
增加了 19． 0%，EPA 产率增加了 161． 5%(图 2 － b)。可见，
硝酸钠、尿素、氯化铵的正交优化更有利于菱形藻 EPA 的积
累。在使用质量浓度方面，三者在正交优化的使用质量浓度
均有所回落，其中氯化铵的变动最大，变为 5 mg /L，尿素下降
了 10 mg /L，硝酸钠回到 f /2 的使用质量浓度。
表 2 菱形藻优化结果
HE06
添加物
单因素优化 正交优化结果
最佳质量浓度 生物量产率(mg /L) EPA含量(%) 最佳质量浓度 生物量产率(mg /L) EPA产率(μg /L)
NaNO3 85 mg /L 19． 8 0． 161 75 mg /L 23． 2 81． 6
NH4Cl 40 mg /L 13． 6 0． 234 5 mg /L
尿素 40 mg /L 16． 1 0． 219 30 mg /L
维生素 B1 0． 8 mg /L 6． 5 0． 257 1． 5 mg /L 28． 4 249． 7
维生素 B12 2 μg /L 8． 9 0． 568 6 μg /L
生物素 2 μg /L 15． 9 0． 081 10 μg /L
IAA 1 mg /L 23． 3 0． 160 2 mg /L 20． 4 36． 9
6 － BA 0． 4 mg /L 18． 8 0． 045 0． 2 mg /L
赤霉素 0． 15 mg /L 16． 4 0． 221 25 μg /L
葡萄糖 0． 9 g /L 25． 4 0． 191 1． 2 g /L 32． 6 503． 9
甘油 1． 2 g /L 23． 6 0． 183 2． 4 g /L
NaHNO3 1． 2 g /L 19． 0 0． 130 1． 2 g /L
注:菱形藻 HE06在 f /2培养基中，硝酸钠的浓度为 75 mg /L，此时生物量产率为 19． 5 mg /L，EPA产率为 31． 2 μg /L，进入稳定期时间为 8 d。
表 2、图 2 － e表明，菱形藻经过维生素正交优化后，生物
量产率提升 22． 4%，EPA产率提升 206． 0%，与氮源正交优化
结果类似，均能有效提高 EPA产率，且对生物量的影响不大。
在使用质量浓度方面，维生素 B1、B12、生物素的使用质量浓度
分别上升了 0． 9、2． 0、4． 0 倍，与氮源优化结果相反。在仅有
维生素 B1、维生素 B12、生物素的培养基中生物量产率低下，
分别为 6． 5、8． 9、15． 9 mg /L。
在植物激素正交优化中，不仅生物量产率没有得到提升，
EPA产率也有所下降(图 2 － c)，表明对菱形藻 HE06 而言，
IAA、6 － BA、赤霉素的正交并不适于其生物量、EPA产物的积
累。在单因素优化中，仅加入 IAA 对生物量产率具有促进作
用，而 6 － BA、赤霉素均表现出抑制作用。
碳源正交试验中，在使用质量浓度方面，除碳酸氢钠不变
以外，葡萄糖、甘油的使用质量浓度均有所上升。生物量产率
由维生素试验组的 28． 4 mg /L 上升至 32． 6 mg /L，仅提高了
14． 8%。气相色谱测定结果(图 2)显示，在 21． 9 min 左右出
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现 1 个较大的峰值，表明 EPA 产率得到极大提高，达到
503． 9 μg /L，与维生素试验组相比提高了 101． 8%。4 个试验
组中氮源、维生素、植物激素、碳源的添加对菱形藻 HE06 的
总脂组分影响均不大，EPA含量主要随总脂含量的升高而升高。
3 结论与讨论
经优化得到硝酸钠、氯化铵、尿素、维生素 B1、维生素
B12、生物素、葡萄糖、甘油、碳酸氢钠的最佳质量浓度分别为
75 mg /L、5 mg /L、30 mg /L、1． 5 mg /L、6 μg /L、10 μg /L、
1． 2 g /L、2． 4 g /L、1． 2 g /L。在该条件下，EPA 产率为
504． 8 μg /L，提高了 15 倍;生物量产率为 32． 4 mg /L，提高了
66． 2%。本研究同时添加 3 种氮源，不仅促进了菱形藻 HE06
生物量的增加，也促进了微藻 EPA产量的积累。氨存在于所
有细胞器中，微藻对氨态氮的吸收不仅受到环境中氨浓度的
影响，还受到环境 pH值、光照条件、自身对氮源的需求、环境
中硝酸盐浓度的影响［4］。微藻对氨的持续吸收使环境中的
pH值下降，pH值持续下降导致微藻更倾向于吸收硝酸盐，从
而使环境中的 pH值上升。环境中质子浓度的升高对藻细胞
具有毒性作用，这种作用可在一定程度上促进产物的积累，而
高浓度的质子能够破坏膜系统从而导致细胞死亡［5］;因此，
在单因素优化中，最佳氨浓度下菱形藻 HE06 的生物量产率
不高，而 EPA含量却有所增加。铵离子的存在还会抑制微藻
对环境中硝酸盐的吸收，因此氮源正交优化中微藻对氮源的
吸收下降［6］，使用氨态氮作为氮源时必须使培养基中的 pH
值条件保持稳定［7 － 8］。本研究中菱形藻 HE06 氨的单因素优
化在三角锥形瓶中进行，没有持续控制培养基的 pH 值，因此
生物量产率较低。微藻对硝酸盐的同化吸收过程须消耗大量
的能量和质子，使 pH值上升，与氨的同化作用相反［9］。微藻
对尿素的同化作用主要依靠脲酶或尿素氨基水解酶催化完
成，这 2 种酶在微藻细胞内的活性均不高;因此，在尿素单因
素培养中，菱形藻 HE06 的生物量产率也较低［10］。在三者的
正交试验中，微藻先后对氨、氮的吸收维持了培养基的 pH 值
平衡，而培养基中不断变化的 pH值刺激了微藻总脂的积累，
从而促进 EPA的积累。
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目前，维生素在微藻内的合成代谢过程尚不明确，研究表
明，其更多作为乙酰辅酶 A 羧化酶、丙酮酸脱氢酶、α －酮戊
二酸脱氢酶等酶的辅因子参与微藻的新陈代谢。单因素及正
交结果表明，当培养基中缺乏某种维生素时，会对微藻的生物
量产率产生较大影响;当培养基中存在维生素时，其浓度对生
物量的影响并不显著。维生素正交对菱形藻 HE06 的 EPA产
率影响较显著，表明向培养基中加入多种维生素能够促进某
些微藻生物量及产物的积累［11］。
植物激素主要作为促生长因子促进微藻生长或产物的积
累，而维生素作为生长因子维持微藻的基本生长需求。在菱
形藻 HE06 的培养过程中，培养基中缺乏维生素时表现为微
藻生长缓慢、生物量产率低下;而缺乏植物激素并不影响微藻
的基本生长需求，反而当加入植物激素时影响微藻的生长，具
有促进或抑制作用。
在亚心形扁藻(P． Subcordiformis)细胞内，当使用葡萄糖
进行兼养时，细胞能够通过糖酵解同化葡萄糖，光合作用也在
同步进行，只是光合作用的强度明显变弱［12］。对菱形藻
HE06 的单因素优化和正交试验均表明，这 2 种藻能够在有机
碳源下兼养。在菱形藻 HE06 优化试验中，生物量产率过低
归根于葡萄糖转化效率过低，这与藻种本身的特性［13］及光照
度有关，过低的光照度［辐射强度低于 22 μmol /(m2·s)］导
致己糖转运蛋白活性过低，从而降低了葡萄糖通过细胞膜的
效率［14 － 15］。在兼养过程中并不是碳源浓度越高、光照度越强
越好;过量的碳酸氢钠会使碳酸根与碳酸氢根的离子平衡被
破坏，从而形成沉淀;葡萄糖浓度及光照度的增加会抑制某些
微藻的生长，同时影响总脂含量［16］。对菱形藻 HE06 而言，
当葡萄糖浓度大于 0． 9 时，其生物量并不随葡萄糖浓度的增
加而增加［17］。对于某些种类的微藻，高浓度葡萄糖可在相当
长一段时期内阻碍微藻细胞生长，此时微藻进行分批或连续
培养更有优势［15，18］。微藻能够以甘油作为仅有碳源，供给能
量促进微藻的生长，但当甘油作为唯一氮源时微藻的光合作
用会受到甘油的抑制，从而影响微藻生长［19］。在菱形藻
HE06 的培养中，碳源加入后其进入稳定期均延长至 15 d，这
与葡萄糖浓度或甘油的加入有关［20］。在混合碳源的优化下，
均能较好促进生物量生长及 EPA的积累，比单独添加效果更
明显。可见，通过异养获得 EPA 产物时，采用多种碳源正交
更有利于 EPA产物积累，促进碳源的利用并节省培养成本。
影响微藻生长及产物积累的因素多种多样，对微藻生长
发育的阻碍或促进也有所差异。氮源、维生素、碳源对微藻的
生物量及产物积累具有明显作用，对已知藻种进行氮源、维生
素、碳源的正交优化更有利于微藻的生长及产物积累。
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