全 文 ：山东农业大学学报 ( 自然科学版 ) , 2以为 , 40 ( 1
Jo u m al Of S h a n d o n g Agh
e u lt u ar l U n iv e sr i ty ( N a tu alr 氛27 一 3 1e n e e )
臭椿炭疽病菌盘长抱刺盘抱 ( oC le ot itr ch u m
多oe o sP or io des eP nz . )生物学特性研究
王教敏` · ’ ,付卫东” , 吴 云 , , 张国良` , 杨明丽 ’ , R i e h a r d R e a dr o n ,
( 1
. 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所 ,北京 l仪减】8 1 ;
2
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OF esr t H
e al th Tce h
n o lo群 En t e甲 ir se T e a m , USDA OF er s r eS vr i e e , M o电an tow n , W V 26 5 0 5 ;
3
. 西南大学植物保护学院 , 重庆北暗 《 刃 , 16 ; )
摘要 :本研究测定了不同培养基 、 碳源 、氮源 、 温度 、 p H条件下臭椿盘长抱刺盘抱 ( co le ot oicr hu o g止配 。卿 ior 山
eP nz
.
)菌株 SQD 一 10 7 的生长 、 产抱和抱子萌发情况 。 该菌株在 玲 A培养基上生长最快 、 产抱最多 ;在供测碳源
中病原菌对蔗糖 、葡萄糖利用较好 ,供测氮源中对硝酸按 、氧化按利用较好。 菌丝生长的适宜温度范围为 10 ~ 35
℃ ,最适 25 ℃ ;产生分生抱子的适宜温度范围为 or 一 30 ℃ ,最适 25 一 30 ℃ ;抱子萌发的适宜温度范围为 5 一 35
℃ ,最适 25 ℃ 。 在 p H3 一 10 的范围内该菌均能生长和产抱 ,菌丝生长最适 p 7H 一 8 ;产生分生抱子最适 p H 为 7 ,
抱子萌发最适 pH 6 一 8 。 抱子的致死温度为印 ℃ ,持续时间 10 而 n 。
关健词 : 奥榕盘长抱刺盘抱 ;培养条件 ;菌丝生长 ;产抱 ;抱子萌发
中图分类号 : 5 4犯 . 4 文献标识码 : A 文章编号 : 1仪 X) 一 2324 ( 2以刃 ) 01 一 0 27 一 05
B IO L O G I C A L C HA R A C T E R I S T IC S O F C O L L E TO T R I C H UM G LO EO SPO R I 0 1D E S PE N Z
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,
th
e
SQD
一 10 7 w a s i s o l a t e d for m
a n t h ar e n o s e d l
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( Ai la nt hus
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p er s e n t s t u d y
, t h e e fe
e t o f m e d i a
, e
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o n s o u cr e s
, n i加罗 n s o u cr e s , te m伴ar t u er s a n d pH v a l u e s o n m y e e l i a l -
脚w ht , s卿ur lat i o n a n d e o n id ial g emr i n a t i o n o f SQD 一 107 w a s t e s t e d a n d a n al y z e d . hT e er s u l ts i n d i e a t e d th a t
即 taot s u e or s e a笋 ( SP A ) w a s fo u n d t h e be s t m e d iu m fo r m y e e l ial 脚讯h an d s op ur l a t i o n Of ht e fu n即 5 . hT e
m y e e l i a l 笋w m u e h fa s t e r a n d p or d u e e d 5 1, i if e a n t ly m o er e o n id i a o n SP A . W h e n d i fe er n t C a n d N s o u祀 e s
w e er t e s te d
, s u c or s e o r g lu e o s e a n d N H
; N 0 3 o r N H ; C I w e er t h
e
be
s t so u cr e s fo
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e
fo
n娜 m y e e l ial 脚wt h .
SQD 一 107 e o u ld g旧w n o mr al ly a t 10 一 3 5 ℃ , b u t ht e b e st m y e e l i a l 脚讯 h w as er e o司 e d a t 25 ℃ . hT e s u i t a b l e
pH v al u e s w e er for m pH 3 t
o pH 1 0
,
w i t h ht e o p t im u m b e i n g p7H
一 8
.
SQD
一 107 s p o ur l a t e d n o mr al ly
a t 1 0 一 35
℃ a n d pH 3 一 10 , w i th t h e o p tim u m s be i n g 25 ℃ a n d p H 7 , er s邵 e t iv e ly . hT e 即 t t e m eP ar t u er s fo r e o n id i a l g e -r
m i n a ti o n ar n罗d for m s ℃ t o 35 ℃ , a n d th e o p t im u m w a s 2 5 ℃ . hT e ar n罗 o f p H v a l u e s fo r e o n id i a 罗mr i n a ti o n
w a s p H Z 一 1 1 , t h e o p t im u m b e in g p H6 一 8
.
C o n id i a o f t h e fu n , 5 w e er i n a e ti v at e d a t 60 ℃ fo r 10 m i n .
eK y
w o r ds : Aial nt h su a l山 iam ; OC l l e忿o t成 h u m g俪。柳 ior i凌 5 ; e u l tu er e o n d i ti o n s ; m y e e l ial 脚 w th ; s p o ur l a -
t i o n : e o n id i a l ge mr i
n a ti o n
.
臭椿 ( ter e 一 o f 一 h e a v e n , Ai la n t h o a lt is ima ( M i l l . ) Sw i n g l e )属于苦木科 ( s im aor u b a e e ae )臭椿属 A i la n -
收稿 日期 : 2以沁 一 07 一 27
墓金项 目 : 国家西部交通建设科技项 目 ( 20 3 3 18 223 34)
作者简介 :王教敏 ( 19 82 一 ) ,男 ,在读研究生 ,研究方向为植物病害及有益微生物的应用 。
’ 通讯作者 : A u th o r fo r e o er s即 n d e n e e , E 一 m a il : fu w d @ cj a e . o吧 . e n
山东农业大学学报 (自然科学版 ) 第 40 卷
ht u s De sf
,
18 世纪作为观赏植物及药用植物由中国传人北美。 至今臭椿在美国广泛分布 , 已成为美国重点
防治的外来人侵树种川 。 近年来利用微生物防治杂草等有害生物的成就为生物防治臭椿提供了一条有
效途径 ,且微生物除草剂具有对靶标生物安全 、对环境无污染 、安全性高的特点 。 在中国寻找臭椿的生物
控制因子是中美生物防治合作项目之一 2j[ ,本实验室对采自山东青岛地区的臭椿病样进行了病原菌的分
离 、纯化和鉴定 ,发现一种能够引起臭椿炭疽病的盘长抱刺盘抱菌株 SQD 一 or 7 。 经致病力测定表明 ,该菌
致病力强 ,发病后期能够造成臭椿大量落叶 ,并且在此之前已有成功应用该类真菌作为生防菌的范例 : 如
美国的 R id i n , 等用盘长抱刺盘抱合萌专化型 ( C . g阮。铆南 j郎 L s p . a e s e h y n o m e n )生产的 “ C o l l e即 ” 生物
除草剂已被注册用于控制稻田杂草弗吉利亚合萌 ( Ase c h” 切 me en vi gr in她 ) 汇’ 〕 ;我国山东农科院研制成功的
能够有效防除大豆冤丝子的“ 鲁保一号 ” 等 l4[ 。 因此 , 菌株 sQD 一 10 7 作为臭椿的生防菌有很好的前景 。
本实验研究了不同营养及环境因子对菌株 SQD 一 10 7 菌丝生长 、产抱量 、抱子萌发的影响 , 同时测定了分
生抱子的致死温度 ,为进一步应用该菌进行生物防治臭椿提供一定的理论依据 。
1 材料与方法
1
.
1 材料
菌株 s QD 一 10 7 是从山东青岛采集具有典型症状的病叶按常规方法【’ 〕进行组织分离培养 ,单抱纯化
并验证其致病性后移人 SP A 培养基试管斜面上保存的 。 试验开始前先将菌株移人 P D A培养基平板上 , 25
℃培养 6 d 后供测试用 。
1
.
2 不同培养荟对菌丝生长和产抱的影响
供试培养基 :
P D A : 马铃薯 20 9 ,琼脂粉 20 9 ,葡萄糖 20 9 ,加蒸馏水至 l。吠) m L 。
SP A
:马铃薯 20 9 , 蔗糖 20 9 ,琼脂粉 20 9 ,加蒸馏水至 l lX刃 m L 。
C A :胡萝 卜20 9 ,琼脂粉 20 9 ,葡萄糖 巧 g ,加蒸馏水至 l。以〕 m L 。
WA :琼脂粉 20 9 ,加蒸馏水至 l《X洲) m L 。
YP A
: 马铃薯 20 9 ,琼脂 20 9 ,葡萄糖 or g ,酵母粉 1 . 0 9 , 活性炭 0 . 3 9 ,加蒸馏水至 l x X) m L 。
C MV
: 玉米粉 3X() g ,琼脂粉 20 9 ,加蒸馏水至 l仪X) m L 。
OM A
:燕麦片 30 9 ,琼脂粉 20 9 ,加蒸馏水至 l0( X) m L。
V S :番茄汁 2的 m L ,琼脂粉 20 9 , C a C0 3 3 g ,加蒸馏水至 l《X刃 m L 。
每种培养基经灭菌后分别倒平板 ,移人直径为 4 m m 的菌饼 ,置于 12 h 光照培养箱中 , 25 ℃下恒温培
养 , 每处理 3 皿 ,重复 3 次 (下同) ,于第 7 d 测量菌落直径和产抱量 。
1
.
3 碳派 、 氮派对菌丝生长的影晌
分别以相同含碳量的 D 一甘露糖 、葡萄糖 、麦芽糖 、淀粉 、 D 一 果糖 、 L 一 山梨糖 、乳糖 、蔗糖替换 P DA 培
养基中的葡萄糖 ,配制成含不同碳源的培养基 ;分别以相同含氮量的硝酸按 、氯化按 、硫酸按 、甘氨酸 、蛋白
陈 、颇氨酸 、酵母粉 、尿素为氮源替换 P D A培养基中的葡萄糖 ,配制成含不同氮源的培养基 ;每种培养基中
分别移人直径为 4 m m 的菌饼 , 28 ℃下恒温培养 ,于第 7 d 测量菌落直径和产抱量 。
1
.
4 沮度对菌丝生长 、产抱及抱子萌发的影响
在 SP A平板上移人直径 4 m m 的菌饼 , 分别置于 5 、 10 、 15 、 20 、 25 、 30 、 35 和 40 ℃的温度下培养 , 于第 7
d 用十字交叉法测量菌落直径 ,并在显微镜下用血球计数板测定产抱量 (下同 ) 。 将 SP A 上培养 6 d 产生
的分生抱子用无菌水配制成浓度约为 1 x l0 5个 / m L 抱子悬浮液 , 将抱子悬浮液滴于凹玻片上 ,分别置于
5
、
10
、
1 5
、
2氏 25 、 28 、 30 、 35 和 4 0 ℃的恒定温度下培养 , 24 h 后镜检萌发率 , 每次检查 30 个抱子 , 重复 3
次 (下同 ) 。
1
.
5 p H 值对菌丝生长 、产抱及抱子萌发的影响
咫 A培养基灭菌后 ,用 N a o H 和 H e l 调节 pH 分别为 3 、 4 、 5 、 6 、 7 、 s 、 9 、 10 、 1 1 ’和 12 , 然后制作平板 , 移
人直径为 4 m m 的菌饼 ,置于 25 ℃下恒温培养 (下同 ) ,于第 7 d 测量菌落直径和产抱量 。 用 N a 0 H 和 H CI
第 1 期 王教敏等 :臭椿炭疽病菌盘长抱刺盘抱 ( C耐扮勿`成人“ m g阮。柳riO 拓陇 3Pe nz .)生物学特性研究 · 2 9 ·
调节无菌水 p H分别为 l 、 2 、 3、 4 、 5 、 6 、 7 、 8 、 9 、 10 、 11 和 12 ,配制不同 p H 抱子悬浮液 ,滴于凹玻片上 , 25 ℃
下保湿培养 24 h 后镜检萌发率。
1
.
6 分生抱子致死温度的测定
取 2 m L抱子悬浮液 (浓度约为 1 x l 0 6个 / m L ) 于灭菌离心管 ( 1 m L ) 中 ,分别于 45 、 50 、 55 、 6() 、 65 和
70 ℃的恒温水浴锅内 ,处理 10 m in 后取出 , 迅速放人冷水中冷却。 取处理后的抱子悬浮液 0 . l mL 滴于直
径为 9 c m 的 SP A 平板上 , 涂布均匀 , 25 ℃下培养 , Z d 后观察菌落的形成情况 , 无菌落形成的视为抱子已
全部死亡 , 以未处理的抱子悬浮液作对照 。
2 结果与分析
2
.
1 培养性状
在 SP A 培养基上菌株 SQD 一 107 菌落圆形 , 呈地毯状平铺 , 初期为白色 , 逐渐变为灰白 ,最终变为灰
色 , 后期偶有扇变 ;气生菌丝由白色至灰白色 ,渐变为深灰色絮状或绒状 ;分生抱子堆棕色 ,胶质状 ;分生抱
子和附着抱形态均符合 su ot n 提出的盘长抱刺盘抱 (肠班花`。 t ihcr “ 。 g坛即柳而山 eP 二 . ) 形态标准 【` ] 。
2
.
2 不同培养墓对菌丝生长和产抱的影晌
在 8种培养基上试验的结果表明 , 菌株 SQD 一 or 7 在 SP A 培养基上菌丝生长最快 , 其次为 CA 、 V S 培
养基 ;在 SP A 培养基上产抱量最大 ,其次为 YP A 和 PD A 培养基 (表 1 ) 。
衰 1 不同培养基对菌丝生长和产抱的影晌
T知b le I E肠ec 妇 of v a d ous m目 aj on m y eC hal gl , 侧山 . n d 51 . 门山 d o . or SQD 一 107
培养基
Mde ia
菌落直径 ( m m )
Di
ame
* e r Of e o lo n y
显著性
Sign i6
c an e e at P 暇 0 . 0 5
产抱量 ( 10 6个 /皿 )
Sop ur l丽。
显著性
Si gn iif e a n e e a I P` 0 . 0 5
巧 A 印 . 2 土 0 . 7 6 a 12 8 .印 士 4 . 49 a
PY A 49
.
5 士 0 . 17 d 11 6 . 2 1 士 7 . 7 0 b
PD A 4 9
.
3 士 1 .的 d e 104 . 2 3 土 4 . 3 3 e
V S 55
.
5 土 0 . 2 8 e 56 . 7 9 士 6 . g l d
C A 58
.
0 士 0 . 2 8 b 36 . 17 士 3 . 7 9 f
OM A 4 9
.
7 土 0 . 4 3 d 4 2
.
8 土 2 3 l e
CM A 4 8
.
7 土 0 . 46 d e 2 1
.
14 士 10 . 4 9
WA 34
.
7 士 0 . 4 f o 土 o h
注 :表中每个数据为三次试验测定的平均值 ,差异比较采用邓肯氏新复极差检验 ( P < 0 . 05 ) 。
Noet
: Eac h d a t 。 i。 山。 t曲 le i。 山e m ea 。 of 山比 e er lP ie aest
,
N u创比m be ar in g阮 d ife er n t 一et 。 。 。i , 币 e an d y d ife er n l w i山 山 e un n e an ’ 。 m u l一i p一e
, 罗 * e st ( P < 0
.
0 5 )
.
2
.
3 病原菌对不同碳 、 氮源的利用
在供试的 8 种碳源中 , 该菌在蔗糖 、葡萄糖为碳源的培养基上生长最快 , 其次是以 D 一果糖为碳源的
培养基 。 在 D 一甘露糖 、 L 一 山梨搪为碳源的培养基上生长较差 ;在供试氮源中 , 该菌在硝酸铁 、舰化钱为
氮源的培养基上生长较快 ,在酵母粉 、甘氨酸 、蛋白陈为氮源的培养基上生长较差 ,尿素最差 (表 2 ) 。
2
.
4 温度对菌丝生长 、产抱及抱子萌发的影响
试验结果表明 , 以 SP A 为培养基 ,菌株 SQD 一 107 在 5 ℃ 、 40 ℃下均不能生长 ,该菌菌丝生长的温度
范围为 10 一 35 ℃ ,最适生长温度为 25 ℃ ;该菌产生分生抱子的温度范围是 10 一 30 ℃ ,最适产抱温度为 25
一 30 ℃ (图 1 ) 。 分生抱子在无菌水中萌发的温度范围是 5 一 35 ℃ ,最适萌发温度为 25 ℃ (图 2) 。
2
.
5 p H 值对菌丝生长 、 产抱及抱子萌发的影响
实验表明 ,菌株 SQD 一 107 在 p H 3 一 10 内的 PS A 培养基上均可生长 , 菌丝生长的最适 p H值为 7 一 ;8
p H 值对该菌产抱的影响显示 , pH 值为 4 一 1 条件下均可产抱 ,最适 p H值为 7( 图 3 ) 。 pH 值对该菌分生
泡子萌发的影响显示 ,在 p H 值为 2 一 1 分生抱子均可萌发 ,最适 pH 值为 6 一 8 , 其中 p H 值为 7 时萌发率
最高( 图 4 ) 。
3 0 山东农业大学学报 (自然科学版 ) 第 40 卷
衰 2 不同碳派 、氮派对菌丝生长的影晌
T a b el Z E肠Ce St of v翻 dOI 明 。回比 . 叨 d 目 . , 宇 . 战旧 r以活 ou my eC肠al gl m份山 or S QD 一 107
碳源
C
a d旧 n 80 u r c e.
菌落直径 ( , )
Di翻 e* e r Of e o lo yn
显著性
Si gn币 e an ce a t P鉴 0 . 05
氮源
iN加 ge n osu ~
菌落直径 (~ )
Di翻 e比 r Of e o lon y
显著性
51, i 6
e an e e at P` 0 . 0 5
a
abb
ed5印3846900土4ōf曰on,47653硝酸按 ( N H4 N o 3 )
抓化铁 ( NH 4 e l )
硫酸按 ( ( N H; ) 2 ()S 4 )
领氮酸 ( v al in e )
醉母粉 ( y一 即 w d e r )
甘氛酸 ( L 一砂y e in )
蛋白陈 ( pe pot ne )
尿素 (~ )
2 8
.
1
2 7
.
1
2 8
.
4
17
.
8
aLDCUJer
了16387415200
nU土士月峙,`矛尸J17`n甘-5984123蔗搪 ( su
~
)
葡萄俯 (砂u e , )
O
一 果据 (加 d . e )
麦芽糖 ( . . 1姗 )
淀粉 ( .扭况 h)
乳糖 (流 to6e )
D一甘耳籍 (~ n , )
L一 山梨据 ( L一 os d扣 se )
(注 :表中每个数据为三次试验测定的平均值 ,差异比较采用邓肯氏新复极差检验 (尸 < 。 . 05 ) 。
N讹 : 肠h dat i。 山 e 汕一e 15 山 e m aen of ther er lP ie at es , N u成、 悦颐 n g 山。 山 fe er n t le l t esr aer s i , i6 e an d y d政 er n t w i山山 e nu n e an ’ s m u lt ip le
I’a n , el8t ( p < 0
.
05 ) )
.
圈 3 不同 p H值对蔺丝生长和产抱的影晌
n g
.
3 E肠 eC st or p H 加 m yeC肠目 g均 w山 朋 d
s脚门山如 n or QS D 一 107
圈 4 不同叫值对抱子萌发的影晌
F ig
.
4 E肠 eC st of 禅 o n s op 比 乎门曲 . d o n
or SQ D
一 107
第 l期 王教敏等 :臭椿炭疽病菌盘长抱刺盘抱 (肠之花
~
h , 砂虎叭四 iOr 比酝舀 eP o . )生物学特性研究 · 3 1 ·
2
.
6 分生抱子致死温度的测定
菌株 s QD 一 107 分生抱子在 45 、 50 、 5 ℃下处理 10 m in 后 ,抱子均能在 咫A 平板上萌发并形成菌落 ,
形成的菌落数量随温度的升高而减少 ,说明有部分分生抱子在处理过程中丧失了萌发力 ;而在 o ℃处理
10 而 n 后 ,该菌的分生抱子已不能在 SP A 平板上萌发并形成菌落 , 表明分生抱子的致死温度为 60 ℃ 10
3 结论与讨论
臭椿炭疽病是本实验室最新报道的一种臭椿病害 ,其生物学特性也是初次研究 , 国内外对引起其它
植物炭疽病的胶胞炭疽病菌的生物学特性有过一些研究报导 [, 一 ’ 0] 。 研究结果表明 ,该菌株在 sP A 培养基
上的菌丝生长最快 、产抱量最大 ;在供试的 8 种碳源中 ,该菌在蔗糖 、葡萄糖为碳源的培养基上生长最快 ,
这说明该菌株能很好利用碳源中的单 、双糖类 ,而这两类物质在植物组织中的含量较高 ,为病原物生长提
供了一个适合的营养环境 ,使得病原物能快速的侵人 、生长繁殖 。 在供试的 8 种氮源中 ,该菌在硝酸按 、氛
化按为氮源的培养基上生长较快 。 通过对菌株 SQD 一 107 营养利用情况的研究 , 为进一步应用该菌提供
了一定的理论依据 。
试验结果表明 , 在玲A 培养基上该菌株菌丝生长的温度范围是 10 一 35 ℃ ,最适生长温度为 25 ℃ ;该
菌株产生分生抱子的温度范围是 or 一 30 ℃ , 最适产抱温度为 25 一 30 ℃ ;分生抱子在无菌水中萌发的温度
范围是 5 一 35 ℃ ,最适萌发温度为 25 ℃ 。 这些特性与臭椿炭疽病野外发生动态密切相关 。 青岛地区臭椿
炭疽病发生于 7 月中旬 , 由于该地区 8 月份阴雨连绵 ,平均气温也在 25 ℃左右 ,这些环境因素都非常有利
于病原菌生长 、产抱以及抱子萌发完成侵染 , 该时期为臭椿炭疽病发病高峰期 , 发病后期会导致臭椿大量
落叶 ;到 or 月初病情严重植株叶片可全部落光 。 菌株 SQD 一 107 在 p H3 一 10 内的 SP A 培养基上均可生
长 ,在 p4H 一 1 条件下均可产抱 ,在 pZH 一 1 分生抱子均可萌发 ,最适 p H6 一 ;8 分生泡子的致死温度为印
℃ l/ 0 m in 。 这也充分体现了该菌株对酸碱度和高温环境适应能力强 ,在一些逆境中也能保持较高的繁殖
和存活能力 ,这更为应用其进行生物防治莫定了基础 。
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