全 文 ：收稿日期:2012 － 12 － 05;修回日期:2013 － 01 － 05
基金项目:国家“863”计划资助项目(2009AA063005) ;安徽省自然科学基金项目(11040606M26) ;安徽光学精密机械研究所所长基金项目
(Y03AG31144)
作者简介:方 丽(1987 －) ，女，硕士，研究方向为水体有毒污染物监测，E-mail:lfang@ aiofm． ac． cn;
通讯作者:赵南京(1976 －) ，男，汉，博士，研究员，主要从事环境污染光学与光谱学监测新技术与方法研究，E-mail:njzhao@ aiofm． ac． cn。
doi∶10． 3969 / j. issn. 2095 － 1736． 2013. 03. 033
四尾栅藻对铜绿微囊藻光合活性及
毒素产生与释放的影响
方 丽1，刘文清1，赵南京1，段静波1，王志刚1，2，
肖 雪1，张玉钧1，刘 晶1，殷高方1，石朝毅1
(1． 中国科学院环境光学与技术重点实验室 中国科学院安徽光学精密机械研究所，合肥 230031;
2． 扬州大学扬子津校区环境学院，扬州 225127)
摘 要:采用将铜绿微囊藻与四尾栅藻混合培养的方法，初步研究了四尾栅藻对铜绿微囊藻生长、产毒及光合作用
能力的影响。对照组为铜绿微囊藻单种培养。以细胞计数仪测藻生物量，Water-PAM 测定暗适应后最大叶绿素荧
光量子产量 Yield(Fv /Fm) ，高效液相色谱分析细胞内及细胞外微囊藻毒素 MC-LR 浓度。结果表明:在生物量上，
整个生长过程中铜绿微囊藻单种培养比与四尾栅藻混合培养大，而胞外及胞内毒素 MC-LR浓度始终是前者低于后
者。混合藻的 Yield值总是大于单种培养的铜绿微囊藻。实验结果证明四尾栅藻的存在对铜绿微囊藻生物量、光
合作用活性、毒素产生与释放均有影响。混合培养时，最大生物量提前，且数值比单种培养低，每个细胞能产生并且
释放更多的毒素。Yield值上升时，生物量呈对数增长，Yield达到最大则生物量数量级达到最大，不再增加。
关键词:铜绿微囊藻;四尾栅藻;混合培养;微囊藻毒素 LR;光合作用活性
中图分类号:X131． 2 文献标识码:A 文章编号:2095 － 1736(2013)03 － 0033 － 05
The influence of Scenedesmus quadricanda on MC-LR producing，
releasing and photosynthetic activity of Microcystis aeruginosa
FANG Li1，LIU Wen-qing1，ZHAO Nan-jing1，DUAN Jing-bo1，WANG Zhi-gang1，2，
XIAO Xue1，ZHANG Yu-jun1，LIU Jing1，YIN Gao-fang1，SHI Chao-yi1
(1． Key Laboratory of Environmental Optics and Technology，Anhui Institute of Optics and Fine Mechanics，
Chinese Academy of Sciences，Hefei 230031;2． Yang Zi Jin Canpus Enviromental Sciences，
Yangzhou University，Yangzhou 225127，China)
Abstract:Mixed culture of Microcystis aeruginosa and Scenedesmus quadricanda was carried out to research the influence of Scenedes-
mus quadricanda exerting upon Microcystis aeruginosa on toxins producing and photosynthetic capacity． The control group was the cul-
ture of Microcystis aeruginosa only． Counter Star was used to obtain the biomass of the algaes． The maximum chlorophyll fluorescence
quantum yield(Fv /Fm)was measured by Water-PAM after dark adaptation． The intracellular microcystin-LR(MC-LR)of Microcystis
aeruginosa was extracted by boiling water bath at 100℃ for 20 minutes． The extracellular and intracellular MC-LR content was detected
with high performance liquid chromatographic(HPLC)． Result showed that during the whole growth stage the biomass of Microcystis
aeruginosa was higer in the control group． But both of the extracellular and intracellular MC-LR contents were lower in the control group
than that in the experimental group． The value of the yield of mixed cultured algae was higher than that of the pure cultured Microcystis
aeruginosa． The results proved that the existence of Scenedesmus quadricanda influenced the Microcystis aeruginosa on biomass，photo-
synthetic activity，toxins producing and releasing． Each Microcystis aeruginosa cell would produce and release much more toxins when
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mixed and cultured with Scenedesmus quadricanda． When the value of yield rised，the biomass of the algae cells increased logarithmical-
ly and the value of yield reached the maximum．
Keywords:Microcystis aeruginosa;Scenedesmus quadricanda;co-culture;microcystin-LR;photosynthetic activity
湖泊富营养化日益加剧，随之而来的蓝藻水华成
为全球关注的热点环境问题。水华暴发会进一步加剧
水体污染，带来更严重的危害，如造成水体恶臭，产生
毒素等，给饮用水处理造成困难。铜绿微囊藻(Micro-
cystis aeruginosa)是全球蓝藻水华的常见藻种之一，属
于蓝藻门蓝藻纲微囊藻科。细胞结构简单，为单细胞
个体或群体，群体种类在细胞壁外分泌果胶类物质构
成胶质鞘膜［1］。它产生的微囊藻毒素(MCs)是一类具
有生物活性的环状七肽化合物，对哺乳动物、鱼类、鸟
类以及无脊椎动物皆有毒性［2］。据报道，微囊藻毒素
有 60 多种同分异构体，其中微囊藻毒素 LR(MC-LR)
就是最常见的三种之一。长期以来，各国学者对铜绿
微囊藻进行了大量的研究报道，包括其生长、产毒和环
境影响因子等方面。四尾栅藻(Scenedesmus quadrican-
da)隶属于绿藻门绿藻纲绿球藻目栅藻科，为不运动的
单细胞，通常由 2、4 或 8 个细胞组成。已有报道从竞
争的角度研究铜绿微囊藻的产毒机理。许秋瑾［3］等的
研究结果表明存在竞争时，铜绿微囊藻比单种培养时
产生更多的毒素。万蕾等［4］研究了不同营养条件下，
铜绿微囊藻与四尾栅藻的竞争实验。结果表明在贫营
养水平下栅藻能够刺激微囊藻生长，富营养水平下，竞
争抑制作用与 N /P 有关，在较低氮磷浓度的水体中，
微囊藻容易成为优势种，而在较高氮磷浓度的水体中，
四尾栅藻更容易成为优势种。张坤等［5］研究了 5 种微
藻对铜绿微囊藻生长的影响。结果表明 5 种微藻的初
始密度对铜绿微囊藻的生长有显著影响。当铜绿微囊
藻初始密度较小时，微藻密度增加对铜绿微囊藻生长
抑制效果越明显，而当铜绿微囊藻的初始密度较高时，
5 种微藻密度的增加对铜绿微囊藻生长抑制效果不明
显。Fogg等［5］研究发现藻类在生长发育过程中会不断
向周围环境中释放碳水化合物、酶、脂类、抑制或促进
因子、毒素等来影响水体中其他藻类的生长发育。Pi-
azzi 等［6］研究了 2 种微藻种内和种间竞争，发现在细
胞密度较低时，2 种微藻竞争不明显，随着培养时间的
增加，细胞密度变大，微藻间的抑制作用变得明显，培
养后期的竞争可能是因为空间和营养资源缺乏。
由于藻类是光合自养生物，光合作用很重要，藻类
各种结构和生理过程都影响生长，但与生长关系最密
切的是光合作用［7］，研究藻类生物量与光合作用活性
之间的关系，通过监测藻类荧光预知其生长潜能，对水
华预警有重要意义。本实验选择产 MC-LR 的铜绿微
囊藻与不产该种毒素的四尾栅藻为实验藻种，进行了
为期 58 天的检测分析，研究了四尾栅藻对铜绿微囊藻
毒素 MC-LR产生与释放的影响，以及光合作用活性与
生物量的相关性，为进一步研究野外混合藻的生长与
产毒打下基础，以及为通过活性预警蓝藻水华提供基
础理论依据。
1 材料与方法
1. 1 仪器与试剂
实验分析过程中用到的仪器主要包括:防交叉干
扰自动固相萃取装置(美国 sigma 公司) ;C18 固相萃
取小柱(500 mg /3 mL supelco En-vi小柱) ;Agilent 1200
高效液相色谱仪;Eclipse XDB-C18 色谱柱;水样荧光
仪(WATER-PAM，walz，Germany) ;HP400G 型智能光
照培养箱(武汉瑞华仪器设备有限责任公司) ;Molecu-
lar超纯水机;不锈钢手提式压力蒸汽灭菌器;迷你水
浴锅(W1106-230) ;H-1650R 型台式高速冷冻离心机;
NMT-2800 氮吹仪(天津奥特塞恩斯) ;细胞计数仪
CounterStar(上海睿钰生物科技有限公司)。
实验所用试剂主要有:甲醇(色谱纯) ;三氟乙酸
(色谱纯) ;去离子水;纯净水;磷酸盐缓冲溶液(0. 05
mol /L) ;
标准样品的配制:MC-LR 标准样品购于北京伊普
瑞斯公司。用 20%甲醇(分析纯)将标准毒素配制成
50、20、10、5、2、1、0. 5、0. 2、0. 1、0 μg /mL，采用 HPLC进
行分析，以测量标准样品谱线峰面积与其对应的浓度
制作标准曲线，结果如图 1 所示。
液相色谱条件:色谱柱温度 40 ℃;流动相为甲醇
与磷酸盐缓冲溶液按体积比 57 ∶ 43 混合;检测器为二
极管阵列检测器波长 238 nm;流速为 1 mL /min，进样
量为 20 μL［8］。
图 1 微囊藻毒素 LR标准曲线
Fig 1 The standard curve of Microcystin-LR
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1. 2 实验材料
实验所用铜绿微囊藻(FACHB-905)及四尾栅藻
(FACHB-1297)购自中科院水生所。取 60 个灭菌的
250 mL锥形瓶，分别加入 130 mL 已灭菌的 BG-11 培
养基及 3 mL(2. 5 × 105个 /mL)对数生长期的铜绿微囊
藻。分为 A，B两组，每组 30 瓶 ，向 B组锥形瓶中分别
加入 3 mL(2. 5 × 105个 /mL)对数生长期的四尾栅藻。
两组藻在培养箱中随机放置，每天摇动一次并随机交
换位置。在光照度 3000 lx、温度为 25 ℃、光暗比为 14
h /10 h下培养(在预实验中，该条件下四尾栅藻及铜绿
微囊藻在 BG-11 培养基中均能很好的生长)。每隔 2 d
测定藻细胞数、胞外毒素 MC-LR、胞内毒素 MC-LR 及
光合活性，每次 2 个平行样，后期藻生长缓慢，采样间
隔适当增大。
1. 3 藻细胞计数
分别取 1 mL 样品于 250 mL 锥形瓶中，用去离子
水稀释至 100 mL，采用细胞计数仪分别计数两种藻活
细胞个数。
1. 4 胞外毒素 MC-LR测定
分别取 100 mL藻液，离心分离藻细胞，上清液过
0. 45 μm玻璃纤维醋酸酯膜后固相萃取，依次用 10 mL
纯水、10 mL20% 甲醇淋洗，再用 5 mL 90% 甲醇(含
0. 1%三氟乙酸)洗脱［9］。洗脱液在 40 ℃水浴中氮气
吹干，1 mL甲醇将吹干物转移至 HPLC 进样瓶中(分
两次，每次 0. 5 mL)。再次氮气吹干，用 50%甲醇定容
至 200 μL，待测。测定结果以藻液体积归一化，转化成
锥形瓶中的毒素浓度。计算公式如下:
c = 0. 2x100 × 100
其中，c为锥形瓶中毒素 MC-LR浓度，单位 μg /L;
X为测得的色谱进样瓶中的 MC-LR 浓度，单位 μg /
mL;0. 2 为定容体积 200 μL;100 为藻液体积 100 mL。
1. 5 胞内毒素 MC-LR测定
上述离心后的藻细胞用去离子水转移至锥形瓶
中，沸水浴处理 20 min［10 － 11］，提取毒素，离心，取上清
液，残渣用去离子水洗涤一次，离心，合并上清液。其
余处理同细胞外毒素。为了方便对比，最终以藻液体
积归一化内毒素水平，单位为 μg /L。
1. 6 光合活性测定
藻的光合作用活性以叶绿素 a 荧光表示。叶绿素
荧光分析技术利用植物体内叶绿素作为天然探针，研
究和探测细胞光合生理状况及各种外界环境因子对其
细微影响［12］。Yield值为光系统Ⅱ(PSⅡ)实际光化学
量子效率，即实际光合效率，它反映 PSⅡ反应中心在
有部分关闭情况下的实际原初光能捕获效率，细胞不
经过暗适应在光下直接测得:
Yield =(Fm － F)/ F
其中，F—光下最大荧光，光适应下全部 PSⅡ中
心都关闭时的荧光强度
F—实际荧光产量，仪器测定时 F值为打开饱和脉
冲前的荧光
经暗适应后测得的 Yield为 PSⅡ最大光合效率:
Yield =(Fm － F0)/Fm
其中，Fm—最大荧光，已经暗适应的光合机构全
部 PSⅡ中心都关闭时的荧光强度
F0—最小荧光或初始荧光，已经暗适应的光合机
构全部 PSⅡ中心都开放时的荧光强度
各参数由水样荧光仪(WATER-PAM，Walz，Ger-
many)测定［9］。为减小误差，测定时间均在 9 点钟左
右，于室温下暗适应 5 min 后测定 F0及 Fm，计算得出
Yield值。
2 结果与讨论
2. 1 四尾栅藻对铜绿微囊藻生物量及活性的影响
A、B组铜绿微囊藻生物量如图 2 所示。培养前 12
d，A、B组藻细胞生物量均呈对数增长，之后缓慢增长，
数量级不变。达到最大值后，由于营养盐的限制，藻生
长受到抑制，生物量开始下降。几乎在整个生长周期
中，A组铜绿微囊藻生物量均大于 B 组。这与许秋瑾
等的研究结果一致［3］，是因为 B 组四尾栅藻与铜绿微
囊藻竞争营养盐及生长空间，抑制了藻的大量增殖。
A组生物量约在第 38 d 达到最大值，B 组提前 8 d 左
右达到最大值。
A、B组藻的光合作用活性如图 3 所示。利用 Wa-
ter-PAM测定了两组藻 yield 值，其中 B 组为铜绿微囊
藻与四尾栅藻混合藻液的 yield 值。yield 值是 PSⅡ最
大光化学量子产量，反映了植物对光量子的最大利用
潜能，非胁迫条件下该参数的变化极小，不受物种和生
长条件的影响，胁迫条件下该参数明显下降，是用来研
究植物受到胁迫对光合作用影响的重要指标［13，14］。
由图可见，培养前期两组藻 yield 值不断增大，第 12 d
达到最大。结合生物量数据来看，前 12 d 生物量呈对
数增加，即对数期藻光合作用活性较强，藻生长潜能
大。随后 yield值开始逐渐下降，生物量呈稳定增加，
数量级达到最大，不再增加。从开始培养至测量结束，
B组 yield值均高于 A 组，前期二者差距较小，随着培
养时间的增加，差距也在增大。58 d 内，平均高出
0. 037。分别培养蓝藻和绿藻时，蓝藻的 yield 值一般
较低，符合蓝藻的生理特点，绿藻则较高［14］。本实验
中 B组 yield值始终高于 A组，就是因为 B组中存在绿
藻。目前无法分开测定混合藻中铜绿微囊藻的光合作
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用活性。关于光合作用活性的研究多集中在环境影响
因子、营养盐限制等方面，种间竞争对光合作用活性的
研究几乎还是空白。本实验结果初步证明，藻类生长
过程中，光合作用活性与生物量之间存在一定的相关
性，活性大，藻生长迅速，活性小，则生物量增加缓慢，
数量级不变。监测自然水体中藻类光合作用活性，对
蓝藻水华有预警作用，值得更加系统深入的研究。
2. 2 四尾栅藻对铜绿微囊藻胞外毒素 MC-LR的影响
A、B两组藻液的细胞外 MC-LR 毒素浓度如图 4
所示。A组藻液胞外 MC-LR 毒素始终处在较低水平，
总体呈缓慢上升趋势。因为此次实验，营养盐较丰富，
整个实验周期中，藻生长尚未达到衰亡期，细胞没有开
始大量死亡，释放毒素较缓慢。而 B 组培养 38 d 后，
胞外毒素浓度上升加快，说明此时藻已开始大量死亡。
由图可见，B组毒素浓度始终高于 A组，培养后期 B组
上升速度加快，导致两者差距越来越大，约第 55 d 达
到最大值，此时 B 组胞外毒素比 A 组高 606. 7 μg /L。
由此得出，当起始浓度相同时，铜绿微囊藻单种培养比
与四尾栅藻共培养释放出更少的毒素 MC-LR，这是由
于四尾栅藻的存在，增加了铜绿微囊藻的生存压力，释
放出更多的毒素，从而在竞争中占据优势。同时四尾
栅藻也会分泌某些物质抑制铜绿微囊藻的生长。有研
究表明某些真核藻分泌的化感物质可有效抑制铜绿微
囊藻的生长和光合作用，具体影响有待更深入的研究。
一般认为微囊藻毒素为细胞内毒素，在细胞内合成，细
胞死亡破裂后释放到环境中。但是已有研究发现藻类
在死亡之前也会向水体中释放毒素，相关研究报道还
不多，尚无明确结论。
图 4 四尾栅藻对铜绿微囊藻胞外毒素 MC-LR的影响
Fig 4 The effect of Scenedesmus quadricanda on the
extracellular MC-LR released by Microcystis aeruginosa
2. 3 四尾栅藻对铜绿微囊藻胞内毒素 MC-LR的影响
A、B 两组藻整个生长过程中细胞内毒素 MC-LR
浓度水平见图 5。其中 A 组总体呈上升趋势，38 d 达
到最大值 78. 53 μg /L，随后开始下降。B 组胞内 MC-
LR浓度也始终高于 A 组，最大值出现在第 46 d，为
334. 35 μg /L。后期与 A组距离逐渐拉大。
关于微囊藻毒素产生机理的研究是目前的热点，
有很多假设，但还无令人满意的结果。有两种可以考
虑的可能性，一是遗传差异即微囊藻有毒株和无毒株
的遗传结构不同，另一种是环境因子影响或改变毒
性［15］。本文研究表明，存在竞争时，铜绿微囊藻产毒
会发生变化。以往已有研究表明，混合培养比单种培
养产生更多的毒素［3］。本研究结果与此一致，A 组生
物量较 B组大，但细胞内外毒素 MC-LR 均低于 B 组。
随着培养天数的增加，细胞内毒素水平上升。达到最
大值后逐渐下降。日本学者 Watanabe 等人的研究表
明，铜绿微囊藻停止生长后，在一段时间内存在于固形
物(包括藻和其他微生物)中的藻毒素含量与存在于
水体中的藻毒素有很好的消长关系［16］。直至细胞全
部死亡后，固形物中的毒素为零而水体中毒素达到最
大，随后开始被色素、光、微生物等降解，浓度开始下
降。本次实验中 A、B 两组藻均遵循这个规律。参考
细胞生物量数据，本研究还发现，A组铜绿微囊藻个数
总是比 B组多，由此再结合细胞内、外毒素 MC-LR 浓
度可初步推断，在四尾栅藻存在的情况下，每个铜绿微
囊藻细胞会产生更多的毒素，且释放出比单种培养更
多的毒素到水体中。关于单个藻细胞产毒量的研究报
道还不多，有待进一步更精确的研究。
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图 5 四尾栅藻对铜绿微囊藻胞内毒素 MC-LR的影响
Fig 5 The effect of Scenedesmus quadricanda on the
intracellular MC-LR released by Microcystis aeruginosa
3 结论
本实验初步得出以下结论，铜绿微囊藻与四尾栅
藻共培养时，生长受到一定的限制，最大生物量提前，
单个铜绿微囊藻细胞比纯种培养时产生更多的毒素。
Yield值上升时，生物量呈对数增加，藻生长潜能大，暴
发蓝藻水华可能性大。Yield值达到最大，则生物量数
量级也达到最大，不再增加。通过在线监测藻类荧光，
可使预警蓝藻水华成为可能。实验初步研究了实验现
象，关于机理还需更加深入的研究。共培养时，不仅生
物量、毒素产生与释放、光合作用活性等发生了变化，
藻细胞尺寸大小的变化也同样反应了藻体特征参数的
改变，而关于这方面的研究报道还很少，有待完善。
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第 30 卷第 3 期
2013 年 6 月
生 物 学 杂 志
JOURNAL OF BIOLOGY
Vol. 30 No. 3
Jun，2013