全 文 ：西北大学学报(自然科学版)
2011年 4月 , 第 41卷第 2期 , Apr., 2011, Vol.41, No.2
JournalofNorthwestUniversity(NaturalScienceEdition)
　　收稿日期:2009-03-19
　　基金项目:陕西省自然科学基金资助项目(2003C1-21);陕西省教育厅专项科研计划基金资助项目(04JK159);陕西省
中医管理局 2004科研基金资助项目(2004-18)
　　作者简介:殷红 ,女 , 陕西汉中人 , 西北大学教授 ,从事植物和真菌生理研究。
贝母内生真菌产西贝素发酵条件的研究
殷　红 ,陈娟丽
(西北大学 生命科学学院 ,陕西 西安　710069)
摘要:目的　优化从平贝母鳞茎中分离出的内生真菌菌株 Fu7的培养条件 ,以提高菌株产贝母生物
碱的能力。方法　以菌丝干重和西贝素产量为指标 ,通过对各种培养条件和培养基成分的单因素
对比和正交试验 ,筛选出有利于菌株发酵生产贝母碱的条件。结果　在筛选出的豆芽汁基本培养
基的基础上 , Fu7菌株发酵的最佳碳源 、氮源和温度分别是葡萄糖 、尿素和 26℃。进一步的正交试
验结果显示 ,在豆芽汁基本培养基中添加 6%葡萄糖和 0.05%尿素 ,初始 pH6.0时 ,最适于其菌丝
生长;而添加 0.10 ～ 0.15g/L尿素 , 6% ～ 7%葡萄糖 , pH6.0 ～ 6.5则有利于西贝素的积累。在相
应的优化条件下 ,菌丝干重和西贝素含量分别比在基本培养基中提高了约 155%和 77%。结论　
在优化的实验条件下 ,内生真菌菌株 Fu7的菌丝生长速率和贝母碱生产能力都有了明显的提高。
关　键　词:平贝母;内生真菌;西贝素;生物碱;发酵条件;药用植物
中图分类号:Q935　　文献标识码:A　　文章编号:1000-274Ⅹ (2011)02-0261-04
Thefermentationconditionsofasipeimineproducing
endophyticfungusisolatedfromFritilariaussuriensis
YINHong, CHENJuan-li
(ColegeofLifeScience, NorthwestUniversity, Xi′an710069, China)
Abstract:Aim　TooptimizethecultureconditionsofthestrainFu7, inordertoincreaseitspeimineproductiona-
bility.Methods　Usingthebiomassandsipeimineyieldasindexes.Thesuitableculturalconditionswereselected
accordingtotheresultsofsinglefactorcomparisonsandanorthogonalexperiment.Results　Theoptimumbasicme-
dium, nitrogensource, carbonsourceandculturetemperaturewerebeansproutsmedium, urea, glucoseand26℃,
respectively.ThefurtheroptimizationbytheorthogonalexperimentofL16(44)showedthatadding6% glucoseand
0.05% urineinbeansproutsmedium, pH6.0, wasfitformycelialgrowth;andadding6% ～ 7% glucose, 0.10%
～ 0.15%urine, pH6.0 ～ 6.5, wassuitableforsipeimineyield, theoxygenrequirementofsipeimineproductionis
higherthanthatofmycelialgrowth.Thebiomasandsipeimineyieldinoptimizedconditionswereincreasedbya-
bout155%and77%comparedwiththatinbasicmedium.Conclusion　Themycelialgrowthrateandpeiminepro-
ductiveabilityofthestrainFu7wasobviouslyincreasedinoptimizedfermentationconditions.
Keywords:Fritilariausuriensis;endophyticfungus;sipeimine;alkaloid;fermentationconditions;medicinal
plant
　　平贝母(FritilariaussuriensisMaxim)为百合科
多年生草本植物 ,其干燥鳞茎是我国传统中药材 ,已
被《中华人民共和国药典 》收载 [ 1] ,具有清热润肺 、
镇咳祛痰 、平喘等良好功效。现代研究表明 ,其主要
DOI :10.16152/j.cnki.xdxbzr.2011.02.018
有效成分为包括西贝素等在内的甾体生物碱类 。由
于贝母类植物有性繁殖周期长 ,无性繁殖系数低 ,野
生资源随着人类需求量的不断增加而日益匮乏 ,而
人工栽培又对生长环境要求较高 ,自 1987年便被
《中国珍稀濒危保护植物名录 》列为渐危种 [ 2] 。虽
然已有通过植物组织培养等方法获得贝母生物碱的
研究 ,但尚未达到规模生产阶段 。
1993年美国学者 Stierle等发现 ,从太平洋红豆
杉 (Taxusbrevifolia)树皮内获得的一种内生真
菌 ———安德氏紫杉霉(Taxomycesandreanae)能产生
其宿主植物的药用成分紫杉醇 [ 3] 。其后 ,对药用植
物内生真菌的研究受到了越来越广泛的重视。大量
的工作证明 ,以内生真菌为主的内生微生物在植物
体内的存在具有普遍性 ,而且其中有一些的确能产
生其宿主所特有的生物活性物质 [ 4-5] 。由于真菌具
有易培养 、易控制 、成本低 、生长快等优点 ,并可通过
诱变育种等手段来提高菌种性能 ,所以工业生产容
易实现 。因此 ,利用从药用植物中筛选出的内生真
菌 ,通过发酵方法生产其宿主特有的药用活性成分 ,
有望成为解决某些植物药物资源短缺问题的可能途
径之一 。我们已经对平贝母的内生真菌进行了分离
和筛选 ,并从中筛选出了一株能够产生贝母生物碱
的菌株 [ 6] ,本研究的主要内容是优化其发酵条件 ,
为工业化生产其药用成分打下良好基础。
1　材料与方法
1.1　菌　种
本实验室从平贝母鳞茎中分离获得的经鉴定能
够产生贝母生物碱西贝素的菌株 Fu7。
1.2　标准品
西贝素(sipeimine),购于陕西省药品检验所 ,中
国药品生物制品检定所鉴定。
1.3　基本培养基
马铃薯培养基 、豆芽汁培养基 、查氏培养基 、合
成培养基和 MM培养基 ,均按照文献 [ 7]的配方配
制 。
1.4　实验方法
1.4.1　产物提取和测定　产物提取:将摇瓶培养物
采用酸性乙醇结合氯仿提取的方法制备待测样
品[ 8-9] 。
HPLC-ELSD分析采用 Agilent1100高效液相色
谱仪和 Altech2000ELSD检测器。色谱条件:流动
相:乙腈 /水(71∶29;V/V)含有 0.03%的三乙胺 ,流
速:0.8mL/min;操作系统:浙江大学 N2000色谱工
作站;色谱柱:AgilentZORBAXSB-C18 (150 mm×
4.6 mm, 5 μm);柱温:30℃;进样量:20 μL。 ELSD
条件:气化温度:85℃,氮气流速:2.1L/min。
标准曲线绘制:精密称 60℃干燥至恒重的西贝
素标准品 ,配成 0.1 mg/L的西贝素甲醇溶液 ,梯度
稀释成浓度为 0.01, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08 mg/L的
标准溶液系列 。依次进样每个浓度的标准液 ,以西
贝素浓度为横坐标 ,峰面积积分值为纵坐标绘制标
准曲线。
分别进样标准品和 Fu7菌株发酵提取物 ,根据
标准曲线确定样品中西贝素的含量。
1.4.2　基本培养基的选择　分别以 10%(V/V)接
种量等量接种 Fu7种子液到无琼脂的马铃薯 、豆芽
汁 、合成和 MM液体培养基内 , 25℃摇床培养。培养
结束后 ,过滤分离菌丝体 ,烘干 ,称重;按 1.4.1的方
法从菌丝体和发酵液中提取生物碱 , 并用 HPLC-
ELSD检测样品中西贝素的含量 。
1.4.3　发酵条件的单因素优化　以 1.4.2中选择
出的最佳液体培养基为基本培养基 ,以 10%接种量
接种 Fu7种子液 ,分别在 24℃, 26℃, 28℃, 30℃和
32℃条件下震荡培养 ,进行培养温度的筛选;分别以
不同碳源和氮源等量更换基本培养基中的碳源和氮
源 ,进行最佳碳 、氮源的筛选 。培养和测定方法均同
1.4.2。
1.4.4　发酵条件的正交试验优化　根据 1.4.3的
结果 ,再对碳源浓度 、氮源浓度 、培养基装量和 pH
这 4个因素进行 L16(44)正交试验 ,在 1.4.3选择
出的最适温度下摇床培养 ,以进一步优化发酵条件。
各因素及水平见表 1。
表 1　正交试验因素水平表
Tab.1　Levelsoffactorsoftheorthogonalexperiment
因　素 水　　平
1 2 3 4
A碳源浓度(%, W/V) 4 5 6 7
B氮源浓度(%, W/V) 0 0.05 0.10 0.15
C培养基装量(mL/500mL) 75 100 125 150
DpH 6.0 6.5 7 7.5
—262— 西北大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　　第 41卷
2　实验结果与讨论
2.1　标准曲线
图 1表明在 0.01 ～ 0.08 mg/L范围内 ,西贝素
浓度与其相应的峰面积之间有着良好的线性关系 ,
据此可计算样品中的西贝素浓度。
图 1　西贝素溶液标准曲线
Fig.1　Thecalibrationcurveofstandardsipeiminesolution
2.2　基本培养基的选择
菌株 Fu7在不同培养基中的生物量与生物碱的
产生情况见图 2。可以看出 ,马铃薯培养基和豆芽
汁培养基较有利于菌丝生长;而豆芽汁培养基适于
西贝素的产生。鉴于本实验的主要目的是获得贝母
生物碱 ,故选择豆芽汁培养基作为后续工作使用的
基本培养基 。
图 2　Fu7在不同培养基中的生长量以及生物碱产量
Fig.2　Themycelialbiomassandalkaloidyieldofthestrain
Fu7 indifferentliquidmedia
2.3　发酵条件的单因素优化
由图 3可以看出 ,不同碳源对内生真菌 Fu7的
菌丝生长量有着不同的影响。在含有淀粉和麦芽糖
的培养基中菌丝生物量较大 ,葡萄糖和糊精中次之 。
在含有葡萄糖的培养基中贝母生物碱的产量较高 ,
蔗糖中次之 。综合菌体生长和贝母碱产生情况 ,选
葡萄糖作为较适宜的碳源 。
由图 4可见 , Fu7菌株在各种所试氮源中均能
良好生长 ,其中在以 NH4NO3为氮源时生物量最大 。
但不同氮源对 Fu7产生物碱的影响有较大差异 ,在
以尿素为氮源的培养基中西贝素含量最高 ,因此选
择尿素作为较适宜的氮源 。
在实验所选温度条件下 , 28℃为菌株 Fu7的最
适生长温度 , 26℃和 30℃次之;26℃时西贝素产量
最高 , 32℃最低(见图 5),可能是由于在此温度下有
关代谢过程的酶活性受到影响所致 ,故选用 26℃为
最适发酵温度 。
图 3　不同碳源对 Fu7菌丝生长以及生物碱产生的影响
Fig.3　Effectsofdifferentcarbonsourcesonthemycelial
growthandthealkaloidyieldofFu7 strain
图 4　不同氮源对 Fu7菌丝生长以及生物碱产生的影响
Fig.4　Efectsofdifferentnitrogensourcesonthemycelial
growthandthealkaloidyieldofFu7 strain
图 5　不同温度对 Fu7菌丝生长以及生物碱产生的
影响
Fig.5　Efectsofdifferenttemperatureonthemycelial
growthandthealkaloidyieldofFu7 strain
2.4　正交试验优化
利用正交试验对 Fu7的培养条件进行进一步优
化的结果及分析见表 2。
从表 2可知 ,当 A, B, C, D分别为 A3B2C4D1
时 ,菌丝干重量最大 ,即当豆芽汁培养基中含 6%葡
萄糖和 0.05%尿素 ,装液量为 150 mL/500 mL, pH
6.0时 ,最有利于 Fu7的菌丝生长 。由极差 R值可
见 ,各因素对菌丝干重影响的主次顺序是 B>C>D
>A,即氮源浓度的影响最大 ,装液量(即通气状况)
和酸碱度影响次之 ,碳源浓度影响最小 。在这种条
件下 ,菌丝干重比在基本培养基中提高了约 155%。
—263—第 2期　　　　　　　　　　　　　　　殷红等:贝母内生真菌产西贝素发酵条件的研究
表 2　正交试验结果与分析
Tab.2　Resultsandanalysisoftheorthogonalexperiment
实验号 实验条件A B C D 菌丝干重 /g· L
-1 西贝素浓度 /mg· L-1
1 1 2 3 2 0.684 0.086 2
2 2 4 3 3 0.687 0.051 7
3 3 4 1 2 0.525 0.099 8
4 4 2 1 3 0.572 0.077 1
5 1 3 1 4 0.53 0.055 3
6 2 1 1 1 0.177 0.044 4
7 3 1 3 4 0.189 0.004 8
8 4 3 3 1 0.524 0.099 7
9 1 1 4 3 0.287 0.005 7
10 2 3 4 2 0.635 0.048 0
11 3 3 2 3 0.603 0.034 4
12 4 1 2 2 0.166 0.054 4
13 1 4 2 1 0.481 0.027 1
14 2 2 2 4 0.504 0.025 2
15 3 2 4 1 0.694 0.042 6
16 4 4 4 4 0.613 0.067 1
k1 0.495 5 0.204 8 0.451 0 0.469 0k2 0.500 8 0.613 5 0.438 5 0.502 5k3 0.502 8 0.573 0 0.521 0 0.537 3 RB>RC>RD>RA①k4 0.468 8 0.576 5 0.557 3 0.459 0R 0.034 0 0.408 7 0.118 8 0.078 3k′
1 0.043 6 0.027 3 0.069 2 0.053 5k′2 0.042 3 0.057 8 0.035 3 0.072 1k′3 0.045 4 0.059 4 0.060 6 0.042 2 R′B>R′D>R′C>R′A②k′4 0.074 6 0.061 4 0.040 9 0.038 1R′ 0.032 3 0.034 1 0.033 9 0.034 0
　　注:①为各因素对菌丝干重的影响;②为各因素对西贝素产量的影响
　　从极差 R′值可见 ,各因素对西贝素产生影响的
顺序是 B>D>C>A,但 R′B和 R′D极为接近 ,即氮
源浓度和酸碱度影响最大 ,装液量次之 ,碳源浓度影
响较小 。实验组合 3和 8产生西贝素的量几乎相
同 ,西贝素的含量均较优化前提高了约 77%。综合
分析这些结果 ,可见对于西贝素积累而言 ,所需初始
氮源浓度明显较菌丝生长的为高 , 在 0.10% ～
0.15%范围;装液量较少 ,为 75 ～ 125 mL/500 mL,
说明其对氧气的需要量大于菌丝生长过程 。较为适
宜的 pH值和碳源浓度都与菌丝生长接近 ,分别在
pH6.0 ～ 6.5和 6% ～ 7%之间。
根据我们的实验观察 ,内生真菌 Fu7是从其生长
的静止期前开始出现生物碱的[ 6] 。因此 ,在实际生产
中 ,可以考虑先用适宜于菌丝生长的条件进行培养 ,然
后再适时调整实验条件 ,包括补加尿素 ,适当增加通气
量等 ,应更有利于目的产物西贝素的生产。
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(编　辑　徐象平)
—264— 西北大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　　第 41卷