全 文 ：第 19卷第 4期
1998年 7月
环　　境　　科　　学
ENV IRONM EN TAL SCIEN CE
Vol. 19, No. 4
Jul. , 1998
低 pH、铝及钙铝比对斜生栅藻 (Scenedesmus
obliquus )的生理生化影响*
孔繁翔　桑伟莲　胡　伟
(南京大学环境科学与工程系污染控制与资源化研究国家重点实验室 ,南京　 210093　 E-mai l: kong fx @ pub. jlonline. com)
摘要　为探讨酸沉降对生物早期伤害的作用机理 ,研究不同 pH条件下 ,铝及钙 /铝比对斜生栅藻与磷和氮营养代谢有关酶活
性的影响 .结果表明 ,铝对酸性磷酸酶和硝酸还原酶活性有显著抑制作用 .当 pH为 6. 8和 5. 2,铝浓度为 0. 7mg /L时 ,酸性磷酸
酶活性仅分别为对照组的 46%和 56% ,而硝酸还原酶活性仅为对照组的 37%和 30% ;当培养基中加入适当量的钙离子 ,会一定
程度保护藻细胞中这 2个酶活性不受低 pH及铝的伤害 ,钙的缓解作用取决于钙与铝的相对量 ;生物体内酶活性对环境比较敏
感 ,可作为对环境进行早期监测的生化指标 .
关键词　斜生栅藻 ,低 pH,铝 ,钙 ,酶活性 .
* 　国家自然科学基金资助项目 ( Project Supported by Na-
tional Natu ral Science Foundation of China): 39570150孔繁翔:男 , 41岁 ,硕士 ,副教授
收稿日期: 1997-10-24
Biochemical Responses of Scenedesmus obliquus to Low pH , Al
and Ratio of Ca to Al
Kong Fanxiang　 Sang Wei lian　 Hu Wei
( State Key Lab. of Pollution Cont rol and Resou rces Reuse, Dep t. of Envi ron. Sci. and Eng. , Nan jing Univ. , Nanjing 210093
E-mai l: kong fx @ pub. jlonlin e. com )
Abstract　 The ef fects of low pH value, Al and various ra tios of Ca to Al on the enzymes associ-
ated wi th the phosphorus and nit rog en in g reen alga Scenedesmus obl iquus were studied. The re-
sul ts showed tha t the activi ties o f acid phosphatase and nit rate reductase were signi ficant ly in-
hibi ted by Al. After treated wi th 0. 7 mg /L Al at pH 6. 8 and 5. 2, acid phosphatase show ed on-
ly 46% and 56% activi ty , nit rate reductase showed 37% and 30% activ ity, relativ e to that in the
control respectiv ely. Supply o f Ca to g row th medium had a pro tectiv e effect on these tw o en-
zymes against Al and low pH injury. The ex tent o f protectiv e effect w as depended on the ra tio
o f Ca to Al. The enzymes acted as the biochemical indicato rs a re v ery sensitiv e, and they can be
used to early moni to r the ef fects o f chemical compounds on envi ronment.
Keywords　 Scenedesmus obliquus , low pH, Al, Ca, enzyme activi ty.
　　 McCain和 Davies曾报道 ,铝有可能导致
植物根部的磷缺乏 .例如 ,在有铝存在的培养基
中加入足够量的磷 ,将会使植物免受铝的伤
害 [1 ] .早期的研究以及放射性元素示踪实验已
证明 ,在低 pH下 ,铝抑制了水生生物对 45 Ca的
吸收 [ 2, 3 ] .有研究表明 ,环境中的铝钙比对铝的
生物毒性具有一定的调节作用 [4 ] .但对钙缓解
低 pH和铝对生物毒性作用机理仍在探讨中 .
Taylo r报道了铝、钙、磷和 pH之间的复杂相互
作用及其对植物生长的影响 ,并肯定了钙和磷
保护植物不受铝及低 pH的伤害作用 [5 ] .
本实验选择常见水生藻类生物斜生栅藻作
为实验生物 ,以酸性磷酸酶 (acid pho sphatase,
AP)和硝酸还原酶 ( ni t rate reductase, N R)作为
指标 ,研究不同 pH条件下铝离子的存在以及
不同钙铝比 ( Ca /Al )对这 2个与藻类生物的磷
和氮营养关系密切的酶的影响 ,以深入研究酸
DOI : 10. 13227 /j . hjkx. 1998. 04. 015
雨对生物早期伤害的作用机理 .
1　材料与方法
1. 1　生物及培养方法
斜生栅藻 ( Scenedesmus obliquus Kutz)从
中国科学院水生生物研究所获得 .培养于 250
m l锥型瓶内 80 ml水生四号培养基中 .置于光
照培养箱内振荡培养 , 25℃ , L D为 14 10h.
1. 2　溶液 pH值及铝浓度设置
用 1 mo l /L HCl调节培养液的 pH分别为
6. 8和 5. 2,并在 2个 pH处理组中各加入
Al2 ( SO4 ) 3 ,使其 Al3+ 理论浓度为 0. 0, 0. 25,
0. 45, 0. 7, 1. 4mg L- 1.在分光光度计上测定藻
培养液光密度 ,并在 4d后取样 ,离心收集 ,用蒸
馏水洗涤数遍 ,在干燥箱 105℃中烘干至衡重 ,
测定单位体积培养液中藻细胞干重 ,以确定不
同 pH条件下铝的 96 h EC50 .
1. 3　钙 /铝比对生物影响实验
在确定了 Al3+ 96 h EC50后 ,在 pH分别为
6. 8和 5. 2的培养基中 ,选择 0. 7mg L- 1为铝实
验浓度 ,同时加入相应量的钙 ,使培养基中的钙
/铝离子比 (摩尔浓度比 )分别为 0 /0, 0 /1, 0. 5 /
1, 1 /1和 2 /1.然后接入新鲜藻培养液 ,使初始藻
细胞密度为 3. 0- 5. 0× 106cell L- 1 ,培养方法
同上 . 4d后 ,藻细胞经离心收集并洗涤后 ,用液
氮冷冻 ,低温真空干燥 14d.称重 ,待用于酶活性
测定 .每个处理为 3个平行样 ,并重复实验 .
1. 4　酶的提取及活性测定
称取一定量干燥的藻细胞 ,用 Tris 硼酸
盐缓 冲液 ( 0. 1 mol /L 0. 3mol /L, pH7. 5,
5mmo l /L EDT A, 7 mmo l /L β-巯基乙醇 )在
0℃下提取 10 min,离心 , 10 000g , 4℃ , 10 min,
上清液保存于 - 30℃下 ,用于酶活性和蛋白质
含量测定 .
AP活性用 Boller和 Kende方法 [ 6] ,在 405
nm处测定底物释放速率 ; N R活性按 Hageman
和 Reed法测定 [7 ] .单位干重藻细胞中蛋白质含
量用 Folin-酚方法测定 ,以牛血清蛋白 ( BSA)
为标准蛋白 [8 ] .
本实验中所用生化药品来自 Sigma,酶活
性测定数据统计分析用 ST ATGRAPHICS软
件包进行 .
2　结果与讨论
2. 1　低 pH及铝对酶活性的影响
不同 pH及 Al3+ 对 AP和 NR活性影响测
定结果见图 1和 2.从图中可知 ,当 pH为 5. 2时 ,
AP的活性与 pH6. 8时的活性相比 ,虽然有差
异 ,但并不十分明显 .在 2个 pH处理组中 ,当钙
/铝比为 0 /1(即 Al3+ 浓度为 0. 7mg L- 1 ,钙为
0. 0mg L- 1 ) , AP活性均有明显下降 .如在 pH
为 6. 8处理中 ,其活性仅为对照组的 46% ,
pH5. 2处理组中仅为对照组的 56% .可见 ,铝对
该酶活性有显著的抑制作用 (P < 0. 01) .
图 1　钙 /铝比及 pH对 AP活性的影响
图 2　钙 /铝比及 pH对 NR活性的影响
　　铝的存在对于 NR活性的影响比对 AP的
影响更为明显 .在 pH为 5. 2和 6. 8,钙 /铝比为
0 /1(即铝离子浓度为 0. 7mg L- 1 ,钙为 0. 0mg
L
- 1
)时 ,该酶的活性仅分别为对照组的 30%和
37% .这表明 , N R对铝十分敏感 (P < 0. 01) .比
较不同 pH条件下 NR活性测定结果 ,可以看
到 ,当培养基中无铝存在时 (钙 /铝比为 0 /0) ,该
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酶活性在不同 pH值处理组中无明显差异 ;但
当同时加入铝离子时 ,在所有处理组中 , pH5. 2
中的酶活性均明显低于 pH6. 8的处理组 .这可
能是由于铝和低 pH环境的联合毒性 ,抑制了
该酶的活性 .
2. 2　不同钙 /铝比对酶活性影响
酶活性测定结果表明 , AP和 NR活性对
钙 /铝比有类似的反应 (图 1和图 2) .当培养基中
加入适当量的钙离子 ,均会改变低 pH及铝对
藻细胞中这 2个酶活性的作用效果 .实验结果表
明 ,当培养基中钙 /铝比从 0 /0提高到 0. 5 /1,也
就是说 ,钙离子的浓度逐步增加 ,在 pH为 5. 2
和 6. 8两处理组中 ,均导致所测 2个酶活性上升 .
当钙铝比为 1 /1时 ,虽然其活性仍然低于对照
组 ,但与其它不同钙 /铝比值的处理组相比较 ,
AP和 NR的活性均达到最大值 (P < 0. 05) .当
钙 /铝比为 2 /1,酶的活性又有所下降 .这说明 ,
钙的作用不仅决定于其加入量 ,同时还取决于
与铝的相对量 .
生物体内的酶对物质的分解、合成的催化
作用 ,是生态系统中物质循环正常进行的基础 .
AP和 NR与生物的磷和氮营养代谢过程十分
密切 . AP可以将环境中的有机磷分解为无机
磷 ,提高了环境中生物可利用磷的浓度 ,使藻类
得以吸收利用 ; N R可将植物所吸收的氧化态
氮化合物转为还原态氮 ,进一步合成氨基酸及
蛋白质 .形成初级生产力 .如果环境因子降低了
生物体内这些与营养代谢关系密切的酶活性 ,
将会改变藻类的营养平衡 ,藻类的生长和繁殖
受到抑制 ,种群增长受阻 ,并通过食物链 ,对整
个群落及生态系统的结构与功能产生影响 .因
此选择特定的酶活性作为生物标志 ,是研究污
染物质对生态系统影响机理的重要手段之一 .
本研究结果证明 ,在低 pH条件下 ,一定浓
度的铝明显抑制 AP和 NR的活性 ,影响了藻
类正常的磷和氮代谢过程 ,导致藻细胞对环境
中营养物质的吸收与利用不足 ,这可能是酸雨
对生物产生毒害的重要原因之一 .而在培养基
中加入适当量的钙离子 ,会在一定程度上保护
关键酶活性不受伤害 ,以减缓酸性环境以及铝
对藻类的伤害 .使藻体内氮、钙和磷的代谢能够
在一定水平上正常进行 ,这可能是钙的缓解作
用 ,保护植物不受伤害的机理之一 .同时 ,本研
究结果也证明 ,由于生物代谢过程中一些关键
酶的活性对环境因子的改变比较敏感 ,其变化
比生物的生长、种群的增长以及群落的演替等
变化更灵敏 ,测定周期更短 .因此 ,可以作为生
化指标 ,对环境中的污染物浓度进行早期监测 ,
对环境质量作出更为准确的预报 .
3　结论
( 1)在低 pH条件下 ,铝对 AP和 NR的活
性有显著抑制作用 ;
( 2)当培养基中加入适量钙离子 ,会改变低
pH及铝对藻细胞中这 2个酶活性的作用效果 .
当钙 /铝为 1 /1时 ,酶活性达最大值 .钙的缓解作
用主要取决于钙与铝的相对量 ;
( 3)生物代谢过程中一些关键酶的活性对
环境因子的改变比较敏感 ,可以作为生化指标 ,
对污染物对环境的影响进行早期监测 .
参 考 文 献
1　 McCain S and Davies M S. Effect s of pret reatm ent w i th
ph osphate in natural populations of A grost is capil lar is L.
Ⅱ : Interactions wi th aluminum on the acid ph osphatase
activity and potas sium leakage of intact root s. New Ph y-
tol. , 1984, 96: 589- 599
2　孔繁翔 ,周风帆 ,陈爽 .低 pH值及铝对泥鳅吸收 45Ca的影
响 .环境科学 , 1996, 17( 6): 57- 59
3　 Spry D J and Wood C M. Ion f lux rates , acid-base s tatus
and blood gas es in rain bow t rou t, Salmo ga ird neri , ex-
posed to toxic zinc in natural s of t w ater. Can. J. Fish.
Aquat. Sci. , 1985, 42: 1332- 1341
4　 Truman R A, Humph reys F R and Ryan P J. Ef fect of
varying solution ratios of aluminium to calcium and mag-
nesium on th e uptake of phosph orus by Pinus ra diata.
Plan t Soil, 1986, 96: 109- 123
5　 Taylor G J, Ad riano D C and Johnson A H ( eds ) . Alumini-
um toxicity and tolerance in plants. Acidic Precipitation ,
Vol 2. New York: Spinger-V erlag, 1989: 327- 361
6　 Bol ler T and Kende H. Hydrolyt ic enzym es in th e cent ral
vacuole of plant cel ls. Plan t Ph ysiol , 1979, 63: 1123- 1132
7　 Hag eman R H and Reed A J. Nit rate reductase f rom high er
plan ts. Meth ods Enzymol. , 1980, 9: 270- 280
8　 Low ry O H and Rosenb rough N R et al. . Pro tein measure-
ment wi th th e folin ph en ol reagent. J. Biol. Chem. , 1951,
193: 263- 275
58 环　　境　　科　　学 19卷