全 文 ：收稿日期:2008-09-02;修回日期:2008-10-07
作者简介:魏琦超(1980-),男 ,硕士 ,助教 ,从事植物生物技术方
面的研究 , E-mail:weiqc@ 126.com。
doi∶10.3969/j.issn.1008 -9632.2010.03.088
三种提取蓝猪耳总 DNA方法的比较
魏琦超 1 , 周　岩 1 , 畅丽萍2
(1.河南科技学院生命科技学院 , 2.新乡学院建筑工程学院 , 新乡 453003)
摘　要:针对蓝猪耳(ToreniafournieriL.)叶片中多糖 、色素等物质严重干扰总 DNA提取质量的问题 ,以蓝猪耳叶片
为试验材料 , 分别采用高盐低 pH值法 、SDS法 、CTAB法提取总 DNA, 并从样品电泳图谱 、纯度 、得率等方面对三种
方法进行评价。结果表明 , CTAB法提取总 DNA的产率较高 、纯度最好 , 是蓝猪耳总 DNA提取的最佳方法。
关键词:蓝猪耳;总 DNA提取;高盐低 pH值法;SDS法;CTAB法
中图分类号:Q946-33 文献标识码:B 文章编号:1008-9632(2010)03-0088-03
ComparisonofthreemethodsoftotalDNAextraction
fromtoreniafournieriL.
WEIQi-chao1 , ZHOUYan1 , CHANGLi-ping2
(1.HenanInstituteofScienceandTechnology, 2.XinxiangColege, Xinxiang453003, China)
Abstract:BasedonthequestionofpolyhexoseandpigmentinterferingthequalityofToreniafournieriL.totalDNAextractedserious-
ly, threemethodslikelowpHextractionmediumwithhighsaltsprecipitation, SDSprecipitationandCTABprecipitation, wereusedto
extracttotalDNAfromtheleavesofToreniafournieriL.Theresultswereevaluatedintermsoftheelectrophoresisresults, purityand
yieldoftheDNAsamplesandshowedthatCTABprecipitationisobviouslybetterthantheothermethods.
Keywords:ToreniafournieriL.;extractionoftotalDNA;lowpHextractionmediumwithhighsaltsprecipitation;SDSprecipitation;
CTABprecipitation
蓝猪耳又名夏堇 、虎口仔 ,是玄参科蓝猪耳属(翼萼
属)一年生草本植物。由于其具有生长周期短 、容易再生 、
种子小数量多 、适宜热带气候且具备特殊的裸露胚囊等特
点 ,是一种理想的研究植物细胞分化 、胚胎发育的模式植
物 [ 1-2] 。高质量总 DNA的制备是进行分子生物学下游实
验的基础之一 ,蓝猪耳叶片中富含的酚类物质不仅可介导
DNA降解 ,与 DNA结合形成沉淀物多呈黄色至黑褐色 ,
很难得到高纯度 DNA。同时 ,酚类及多糖类物质对反应
体系中酶活性产生抑制作用 ,严重影响分子生物学研究的
下游工作 。本研究拟以蓝猪耳为实验材料 ,摸索提取其总
DNA的最适条件 ,旨在为今后的基因克隆 、研究蓝猪耳胚
胎发育的分子机制及开展花型等方面的育种工作奠定基
础 。
1　材料与方法
1.1　植物材料
本实验所用的蓝猪耳种子购自广州市三力园艺有限
公司 ,采集实生苗新鲜幼嫩的叶片 ,并用灭菌去离子水冲
洗 3次 ,无菌滤纸吸干水分后备用。
1.2　主要药品与试剂
1.2.1　药品
DNA分子量 markerλ-HindⅢ、TaqDNA聚合酶均为
TaKaTa公司产品;DNAMarkerI购自天根生化科技(北
京)有限公司 ,其余均为国产或进口分析纯。
1.2.2　高盐低 pH值法所用主要试剂
提取缓冲液 [ 100 mmol/LNaAC(pH值 4.8), 50
mmol/LEDTA(pH值 8.0), 500 mmol/LNaCl, 2% PVP,
1.4%SDS, pH值 5.5] ;TE缓冲液 [ 10 mmol/LTris-HCl
(pH值 8.0), 1 mmol/LEDTA, (pH值 8.0)];氯仿∶异戊
醇(24∶1);2.5 mol/LKAc(pH值 4.8)。
1.2.3　SDS法所用主要试剂
提取缓冲液 [ 50 mmol/LTris-HCl(pH值 8.0), 500
mmol/LNaCl, 50 mmol/LEDTA] ;TE缓冲液;10%SDS;
5mol/LKAc;氯仿∶异戊醇(24∶1);3 mol/LNaCl;异丙醇 。
1.2.4　CTAB法所用主要试剂
1.5×CTAB提取液 [ 1.5%CTAB, 75mmol/LTris-HCl
(pH值 8.0), 1mol/LNaCl, 15mmol/LEDTA];10%CTAB
溶液;1%CTAB沉淀液 [ 1%CTAB, 50mmol/LTris-HCl(pH
值 8.0), 10mmol/LEDTA] ;氯仿∶异戊醇(24∶1);高盐 TE
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[ 1mol/LNaCl, 10mmol/LTris-HCl(pH值 8.0), 1mmol/L
EDTA] 。
1.2.5　肌动蛋白基因扩增用引物
上游引物　5′-ATGGCAGAAGCCGAGGATATTCAGC-3′
下游引物　5′-CGGGATCCTTAGAAGCATTTTCTGT-3′
1.3　方法
1.3.1　蓝猪耳总 DNA的提取
1.3.1.1　高盐低 pH值法　提取方法参考文献 [ 3-4] ,
并略有修改。 (1)称取样品 400mg,置于研钵中与液氮共
研成细粉。迅速加入预热至 65℃的 2mL提取缓冲液 ,于
65℃的水浴中温育 30min后 , 12000r/min离心 10min。
(2)吸取上清液 ,加入 2/3倍体积的 2.5mol/LKAc(pH值
4.8), 0℃放置 30min沉淀蛋白质 。(3)4℃ 12000r/min离
心 10min。吸取上清液转移至另一支离心管中 ,加入等体
积氯仿 ∶异戊醇 (24∶1)混匀 ,于 4℃ 12000r/min离心
10min,反复抽提一次至中间层无白色沉淀。 (4)上清液
加入 1倍体积异丙醇 ,置于 -20℃冰箱中 20min, 12000
r/min离心 15min,所得沉淀用 70%乙醇洗两次 ,待残留的
乙醇挥发后 ,将 DNA溶于 50μL无菌双蒸水中 ,加入 2μL
RNase, 37℃保温 1h。
1.3.1.2　SDS法　提取方法参考文献 [ 5-6] ,并略有修
改 。(1)称取样品 400mg,置于研钵中与液氮共研成细粉 。
立即加入 800μL提取液 、250μL10%SDS,混匀 ,于 65℃水
浴中保温 20 ～ 30min,并经常温和混匀 。(2)取出后立即
置于冰上 ,并加入 120μL5mol/LKAc,混匀后于冰上反应
40min,于 4℃12000r/min离心 20min。(3)取上清液加入
等体积的异丙醇 ,温和混匀。 -20℃放置 1h后 ,于 4℃
12000r/min离心 20min。 (4)弃上清液 ,用 500μLTE缓冲
液溶解沉淀 ,并加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)混匀 ,
于 4℃ 8000r/min离心 5min。 (5)吸取上清液加入 0.8倍
体积的异丙醇和 0.1倍体积的 3 mol/LNaCl,于 -20℃放
置 1h后 ,于 4℃ 12000r/min离心 20min。(6)弃上清液 ,
用 70%乙醇漂洗沉淀 1次 ,在通风橱中凉干后 ,加入 50μL
无菌双蒸水溶解沉淀 ,同时加入 2μLRNase, 37℃保温 1h。
1.3.1.3　CTAB法　提取方法参考文献 [ 7] ,并略有修
改 。(1)称取样品 400mg,置于研钵中与液氮共研成细粉 ,
迅速转入 2mL离心管中 。在离心管中加入 1mL1.5 ×
CTAB提取液 (已预热至 65℃), 65℃放置 30min,期间不
时摇动 ,使其充分混匀 。(2)取出离心管 ,冷却至室温 ,加
入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1),轻轻颠倒混匀 ,室温放
置 15min。(3)12000r/min离心 3min,小心吸取上清液 ,转
移至另一无菌离心管中。 (4)加入 1/10体积的 10%
CTAB溶液 ,混匀。加入等体积的沉淀液 ,摇匀 ,室温放置
10 ～ 15min。 12000r/min离心 10min。(5)弃上清后加入
200μL高盐 TE, 55℃轻轻振荡 ,使沉淀溶解。将溶液转入
2mL离心管中 ,加入 0.7倍体积的异丙醇 ,轻轻颠倒混匀 ,
室温放置 15min。 12000r/min离心 5min,去上清。 (6)用
1mL70%乙醇洗涤 , 12000r/min离心 1min,倒掉溶液 ,重
复洗涤一次 ,瞬时离心。 (7)尽量吸干溶液 ,室温下干燥
直到沉淀变为透明 。加入 50μL无菌双蒸水 ,溶解沉淀 ,
同时加入 2μLRNase, 37℃保温 1h。
1.3.2　蓝猪耳总 DNA样品质量的检测
1.3.2.1　DNA纯度 、产率的检测
将提取的 DNA样品(5μL)用重蒸水稀释至 50μL后 ,
测定样品液在 230nm、260nm、280nm的 OD值 , 并计算
OD260 / OD230、OD260 / OD280的比值 。根据 OD260 =1.0时溶
液浓度为 50μg/mL计算产率。
1.3.2.2　DNA分子量大小及完整性的检测
取 5μL上述 DNA样品和 5μLDNA分子量 markerλ-
Hind,分别于 0.8%琼脂糖上电泳 , GoldViewna染色后 ,凝
胶成像仪上进行观察并照相 ,以检测蓝猪耳总 DNA分子
量的大小 。
1.3.2.3　DNA样品用于 PCR扩增的适应性
取 5μL总 DNA溶液做为模板 ,用肌动蛋白特异性引
物进行 PCR反应 ,反应体积为 50μL。其中 10 ×bufer
5μL, dNTP4μL, 上下游引物各 1μL, TaqDNA聚合酶
0.25μL, Mg2+浓度梯度分别为 0.9mmol/L、1.2mmol/L、
1.5mmol/L、 1.8mmol/L、 2.1mmol/L、 2.4mmol/L, 并 以
Mg2+为 1.5mmol/L设置阳性和阴性对照。反应程序为:
预变性 94℃ 3min;第 1 ～ 35个循环为 94℃ 30s, 56℃
1min, 72℃ 2.5min;72℃ 10min;4℃保存。
取 2μL扩增产物于 1%琼脂糖上电泳 ,电压 5V/cm,
电泳时间 45min。
2　结果与分析
2.1　三种提取方法的 DNA纯度和产率
上述三种提取方法均能从蓝猪耳叶片中提取出总
DNA,但从表 1中可以看出提取效果有明显差异。从每种
方法重复三次所得数据的平均值来看 ,采用高盐低 pH值
法和 SDS法提取的总 DNA,其 OD260 /OD280 >1.90,说明样
品中有少量的 RNA污染;OD260 /OD230 <2.0,说明 DNA样
品中存在着盐或小分子杂质等的污染 。而采用 CTAB法
提取的总 DNA, OD260 /OD280为 1.84, OD260 /OD230 >2.0,两
项指标均到达了 DNA样品的纯度测定标准 ,其纯度高于
另外两种提取方法 。就 DNA产率而言 , SDS法最高 ,
CTAB法次之 ,高盐低 pH值法最低。综合考虑 , CTAB法
提取的蓝猪耳总 DNA,纯度最高 ,产率较高 。
表 1　三种方法提取蓝猪耳总 DNA紫外吸收分析结果
Table1UVscanningresultsofgenomicDNA
withthreemethodsonToreniafournieriL.
提取方法
Extractingmethod OD260/OD280 OD260/ OD230
DNA产率(μg/g)
Yield
高盐低 pH值法(LowpHextrac-
tionmedium withhighsaltspre-
cipitation)
1.91±0.04 abAB 1.97±0.12 aAB 15.33±1.59cB
SDS法(SDSprecipitation) 1.99±0.02aA 1.41±0.28bB 76.61±9.82 aA
CTAB法(CTABprecipitation) 1.84±0.05bB 2.12±0.08aA 43.31 ±10.54 bB
注:大写字母表示 0.01水平差异显著性 ,小写字母表示 0.05水平差异显著性
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2.2　三种提取方法的 DNA完整性
图 1　三种提取方法的 DNA电泳图谱
Fig1Agarosegelelectrophoresisanalysis
ofgenomicDNAwiththreemethods
1:DNA分子量markerλ-HindⅢ;2 ～ 4:CTAB法;5 ～ 7:SDS法;8～ 10:
高盐低 pH值法
DNA样品琼脂糖凝胶电泳分析图谱见图 1,可见 ,三
种方法均提取出了较完整的总 DNA,其片段大于 23kb,
RNA降解较为完全 。从图中还可看出 ,虽然电泳前上样
量相同 ,但 DNA条带亮度有很大区别:SDS法提取的 DNA
样品(5 ～ 7泳道)通过 260nm时的吸光度值计算 ,判断其
产率最高 ,但在电泳时发现其 DNA条带亮度较低 、点样孔
较亮且主带下方有拖带现象 ,说明在样品中可能存在多糖
等杂质的污染;CTAB法提取的总 DNA条带明亮;高盐低
pH值法仅见微量 DNA,这与紫外检测结果相一致。因
此 , CTAB法提取的 DNA纯度高 、产率高 、完整性好 。
2.3　肌动蛋白基因扩增
为了验证 CTAB法提取的总 DNA样品进行 PCR反应
的适应性 ,并摸索 PCR扩增时的最适条件 ,取 5μLDNA溶
液作为模板建立反应体系。结果如图 2所示 ,采用 CTAB
法提取的总 DNA完全满足 PCR反应的要求 ,在 Mg2+终浓
度为 1.5或 1.8mmol/L时 ,能有效扩增出符合预期大小的
约 1300bp片段 ,经序列测定判断为蓝猪耳肌动蛋白基因
(测序及序列分析结果拟另文发表)。
图 2　CTAB法提取总 DNA作为 PCR反应模板
Fig2PCRamplificationusinggenomicDNAextracted
withCTABprecipitationastemplate
1:DNA分子量 markerλ-HindⅢ;2:Mg2+浓度为 0.9mmol/L;3:Mg2+
浓度为 1.2mmol/L;4:Mg2+浓度为 1.5mmol/L;5:Mg2+浓度为
1.8mmol/L;6:Mg2+浓度为 2.0mmol/L;7:Mg2+浓度为 2.4mmol/L;
8:阳性对照;9 ～ 11:阴性对照;12:DNAMarkerI
3　讨论
3.1　植物总 DNA提取
基因克隆等分子生物学实验多以提取研究对象的总
DNA作为研究的起点 ,由于植物组织材料的来源 、部位 、
形态等外在性质的不同 ,以及化学成分 、组织结构等内在
特点的差异 ,在提取总 DNA时需要选择不同的方法 ,或作
一些特殊的处理 ,以减少多糖及酚 、酯 、萜等次生代谢产物
的残留 。目前 ,植物总 DNA的提取方法主要有 SDS法 、
CTAB法和高盐低 pH值法等。在本实验中 , SDS法提取
的总 DNA样品经计算虽然产率较高 ,但所得产物含糖类
等杂质较多;一般认为高盐低 pH值法的酸性提取缓冲液
可避免多酚类物质的电离化和进一步氧化 ,但在本实验中
产率较低;事实证明 , CTAB法是蓝猪耳总 DNA提取的最
适方法 ,可供研究人员参考。
3.2　PCR扩增
本人在多次 PCR实验中发现 ,由于反应体系或反应
条件的不适 , PCR反应常出现两种极端现象:(1)经过完
整的 PCR反应后 ,通过凝胶电泳检测却发现扩增不到任
何产物;(2)经过完整的 PCR反应后 ,非特异性扩增严重 ,
产生许多不确定的产物 ,表现为凝胶电泳时泳道有模糊的
亮区。遇到这种情况 ,在确定引物设计无问题后 ,需要通
过改变模板浓度 、引物用量 、dNTP浓度 、Mg2+浓度 、缓冲
液 pH值等加以优化。其中 , Mg2+浓度直接影响引物与模
板结合的特异性 、产物特异性 、酶的催化能力和准确性 ,因
而是做 PCR条件优化试验时需要特别重视的因素 。本实
验使用的 Taq酶为宝生物公司产品 ,其推荐的 Mg2+终浓
度为 2.0mmol/L,为了验证 CTAB法提取的总 DNA用于
PCR反应的适应性 ,同时摸索扩增蓝猪耳肌动蛋白基因的
最适条件 ,实验中设置了 Mg2+浓度为 0.9、1.2、1.5、1.8、
2.0、2.4mmol/L的浓度梯度 , 发现当 Mg2+浓度为
1.5mmol/L或 1.8mmol/L时 ,扩增的产量最高 、特异性条
带明显 ,经后续的鉴定工作证实扩增条带即为目的条带 。
该结果说明 ,由于在具体的 PCR反应体系中 ,模板的纯度
和浓度 、引物浓度等条件的不一致 , Mg2+的最佳浓度应视
具体情况做适当调整。
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