全 文 ：收稿日期:2013 － 11 － 10;修回日期:2014 － 03 － 03
基金项目:国家 高 技 术 研 究 发 展 计 划“863”项 目
(2013AA065805);国家重点基础研究发展计划“973”项目
(2011CB2009001) ;国家自然科学基金项目(31170337) ;广
东省低碳发展专项资金(2011 － 051)
作者简介:高保燕(1988) ，女，硕士研究生，研究方向为藻类
生物技术和生物能源(E-mail)gaobaoyan1211@ 126． com。
通信作者:张成武，教授，博士生导师(E-mail)tzhangcw @
jnu． edu． cn。
微生物油脂
布那迪栅藻异养培养条件的优化和生化组成含量分析
高保燕，陈小妹，雷学青，万凌琳，李爱芬，张成武
( 暨南大学 生态学系，水生生物研究中心，广州 510632)
摘要:研究了布那迪栅藻( Scenedesmus bernardii) 异养培养条件及不同碳源、氮源对其生化组成的影
响。结果表明:异养培养时所需的最佳碳源为葡萄糖，其最适质量浓度为 50． 0 g /L;最佳氮源为酵母
提取物，其最适质量浓度为 2． 7 g /L;摇瓶培养时所获得的最大生物量达 24． 8 g /L。布那迪栅藻异养
培养时细胞内主要积累碳水化合物，其含量达到细胞干重的 58． 2%，最高产率为1． 05 g / ( L·d) ;其次
积累总脂，含量为细胞干重的 30． 9%，最高产率为 0． 64 g / ( L·d)。
关键词:布那迪栅藻;异养培养; 总脂; 碳水化合物; 产率
中图分类号:TS222;Q936 文献标志码:A 文章编号:1003 － 7969(2014)06 － 0063 － 05
Optimization of heterotrophic cultivation conditions and biochemical
components of Scenedesmus bernardii
GAO Baoyan，CHEN Xiaomei，LEI Xueqing，WAN Linglin，
LI Aifen，ZHANG Chengwu
(Ｒesearch Center for Hydrobiology，Department of Ecology，Jinan University，Guangzhou 510632，China)
Abstract:The heterotrophic cultivation conditions of Scenedesmus bernardii and the different carbon
sources and nitrogen sources on its biochemical components were studied． The results showed that the
best carbon source for Scenedesmus bernardii under heterotrophic growth was glucose，and its optimal mass
concentration was 50． 0 g /L;the best nitrogen source for Scenedesmus bernardii under heterotrophic
growth was yeast extract，and its optimal mass concentration was 2． 7 g /L． Under the optimal heterotroph-
ic growth conditions，the maximum biomass was up to 24． 8 g /L． The carbohydrates mainly accumulated
in the cell of Scenedesmus bernardii under heterotrophic growth conditions，accounting for 58． 2% of the
cell dry weight，and the highest yield was 1． 05 g /(L·d) ;the next was the total lipid，accounting for
30． 9% of the cell dry weight，and the highest yield was 0． 64 g /(L·d)．
Key words:Scenedesmus bernardii;heterotrophic cultivation;total lipid;carbohydrates;yield
随着全球日益严重的能源和环境问题，寻求新
型、可再生、环境污染小的生物燃料已成为普遍关注
的焦点。生物柴油是一种无毒、环保、与石化柴油热
值相近的可再生生物燃料。产油微藻因其生长速度
快，油脂产率高，培养时不占用农业耕地等特点，已
成为极具潜力的生物柴油开发新资源。
微藻的异养生长一般是指在培养基中添加有机
碳源和(或)有机氮源而不依赖光照进行增殖的过
程。与光自养培养相比，可进行异养生长的微藻具
有生长周期短、比生长速率高、生物质浓度高(可达
到 50 ～ 100 g /L)等优点［1］。其异养培养时可在工
业发酵罐中进行，扩大培养更加简便;成熟的微生物
发酵技术和微藻培养技术，简化了生产工艺，使整个
操作流程具有极高的可控性，不依赖于外界环
境［2 － 3］。但并不是所有的微藻都能进行异养生长，
362014 年第 39 卷第 6 期 中 国 油 脂
因此针对不同的藻种选择不同的培养方式和培养基
以期获得较高的油脂产率非常重要。
本研究以一株新近分离的淡水绿藻———布那迪
栅藻(Scenedesmus bernardii)为研究对象，该藻株光
自养培养时能够积累较高含量的储藏性脂类，而且
能够在黑暗条件下进行异养生长。通过研究不同形
式的碳源、氮源及其浓度对布那迪栅藻异养生长时
生物量积累和生化组成的影响以提高其油脂产率，
以期为生物柴油的生产提供较好的生物资源。
1 材料与方法
1． 1 实验材料
1． 1． 1 原料与试剂
布那迪栅藻(Scenedesmus bernardii，S． bernar-
dii) ，来自于暨南大学水生生物研究中心微藻生物
技术与生物能源实验室。蛋白胨，酪蛋白，酵母提取
物，硝酸钠，尿素，葡萄糖，蔗糖，甘油，醋酸钠，二甲
基亚砜，甲醇，正己烷，乙醚，苯酚，硫酸，氢氧化钠。
1． 1． 2 仪器与设备
D －1 型高压蒸汽灭菌锅，SW － CJ － 1F 型超净
工作台，ZQWY － 200G 型恒温振荡培养箱，Binder
型恒温干燥箱，Sorvall Biofuge 型高速冷冻离心机，
Virtis Wizard 2． 0 型冷冻干燥机，94 － 2 Thermo
Finnigan型恒温磁力搅拌器，N － EVAPTM 111 型氮
吹仪。
1． 2 实验方法
1． 2． 1 培养基的优化
1． 2． 1． 1 最佳氮源筛选
BG －11 培养基为基础培养基，以 10． 0 g /L 的
葡萄糖作为碳源，分别以酪蛋白 1． 9 g /L、酵母提取
物 2． 7 g /L、蛋白胨 1． 7 g /L、尿素 0． 5 g /L和硝酸钠
1． 5 g /L 为氮源。取在摇床中培养 4 d 左右的布那
迪栅藻(S． bernardii)作为藻种，等量接种于装有
150 mL培养基、容量为 250 mL的三角瓶中，置于摇
床中 黑 暗 培 养。摇 床 温 度 为 30℃，转 速 为
180 r /min，每个实验组设计 3 个平行，每天取样测
定生物量，每 3 d收集 1 次藻粉，培养周期为培养到
该藻生长的平台期。
1． 2． 1． 2 最佳碳源筛选
BG －11 培养基为基础培养基，以 2． 7 g /L 的酵
母提取物作为氮源，分别以葡萄糖 10． 0 g /L、醋酸钠
13． 7 g /L、甘油 8． 1 mL /L 和蔗糖 9． 5 g /L 为碳源。
培养方法和取样方法同 1． 2． 1． 1。
1． 2． 1． 3 葡萄糖质量浓度优化
BG －11 培养基为基础培养基，以 2． 7 g /L 的酵
母提取物作为氮源，分别以 5． 0、10． 0、20． 0、30． 0、
40． 0、50． 0、60． 0 g /L的葡萄糖作为碳源。培养方法
和取样方法同 1． 2． 1． 1。
1． 2． 1． 4 酵母提取物质量浓度优化
BG －11 培养基为基础培养基，以 50． 0 g /L 的
葡萄糖作为碳源，分别以 1． 4、2． 7、4． 1、5． 4 g /L 的
酵母提取物作为氮源。培养方法和取样方法同
1． 2． 1． 1。
1． 2． 2 生物量测定
将孔径为 0． 45 μm 的混合纤维滤膜预先于
105℃烘箱中烘干至恒重(W1) ，取 10 mL 藻液(V)
用烘干的滤膜进行真空抽滤，再置于 105℃烘箱中
烘干至恒重(W2) ，于干燥器中冷却至室温后称重。
生物量 =(W2 －W1)/V
1． 2． 3 微藻藻粉制备
将不同培养时期的藻液，利用低速离心机 3 500
r /min离心 5 min，收集藻泥，将藻泥置于冷冻干燥
机中冷冻干燥。将得到的藻粉置于冰箱(－ 20℃)
中保存备用。
1． 2． 4 总脂含量测定
总脂含量的测定按照文献［4］的方法并稍作修
改。取 100 mg藻粉(m0)置于 25 mL 具磁力搅拌子
的玻璃离心管中，加入 2 mL 二甲基亚砜 －甲醇(体
积比 1∶ 9)溶液，50℃水浴搅拌提取 1 h，3 000 r /min
离心 5 min，收集上清液。藻渣中加入正己烷 －乙醚
(体积比 1 ∶ 1)4 mL，于冰浴下磁力搅拌提取 1 h，
3 000 r /min离心 5 min，收集上清液，之后再按上述
过程重复操作至藻渣呈灰白色。合并上清液后加入
4 mL去离子水，振荡使其充分混匀，静止分层，收集
上层有机相，用氮气吹干，再用乙醚溶解并转移至已
称重(m1)的 1． 5 mL 塑料离心管中，用氮气吹干至
恒重(m2)。
总脂的含量 =(m2 －m1)/m0 × 100%
1． 2． 5 总碳水化合物含量测定
利用苯酚 －硫酸法测定藻细胞内总碳水化合物
含量。配制不同浓度梯度的葡萄糖标准液，加入浓
H2SO4和 6%苯酚，490 nm 波长下测定吸光度，以葡
萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲
线，得到回归方程。脱脂藻粉中总碳水化合物的提
取采用 0． 5 mol /L的 H2SO4，在 100℃水浴中磁力搅
拌提取 4 h，冷却后 3 500 r /min 离心 5 min，将上清
液转移至 50 mL 容量瓶中，用去离子水洗涤藻渣
3 次后定容至 50 mL，取 1 mL 样品液依次加入浓
H2SO4和 6%的苯酚进行显色，测定 490 nm 波长下
的吸光度，通过回归方程计算总碳水化合物的含量。
1． 2． 6 总蛋白质含量的测定
46 CHINA OILS AND FATS 2014 Vol. 39 No. 6
用 0． 5 mol /L NaOH 提取脱脂藻粉 3 次，3 500
r /min离心 5 min 后将上清液转移至 50 mL 容量瓶
中，用去离子水洗涤藻渣 3 次，制备成样品液，再按
Lowry法进行测定。
1． 2． 7 数据处理
用 Excel 2010 和 Origin 8． 5 对数据进行分析处
理、作图。
2 结果与分析
2． 1 培养基优化
2． 1． 1 最佳氮源筛选
图 1 为不同氮源对布那迪栅藻(S． bernardii)异
养生长的影响。
图 1 不同氮源对布那迪栅藻(S． bernardii)异养生长的影响
从图 1 中可以看出，布那迪栅藻(S． bernardii)
可以利用不同形式的氮源进行异养生长，且该藻对
酪蛋白、酵母提取物、蛋白胨、硝酸钠和尿素 5 种氮
源的利用效率各不相同。对酵母提取物的利用效率
最高，在整个培养周期中，该组生物量一直较高，并
在 3 d达到最高，为 6． 1 g /L;其次为酪蛋白、蛋白胨
和尿素;对硝酸钠的利用效率最低。有机氮源对该
藻的生长总体优于无机氮源，表明有机氮源更有利
于布那迪栅藻(S． bernardii)的生长，与前人的研究
结果一致［3］。
2． 1． 2 最佳碳源筛选
图 2 为不同碳源对布那迪栅藻(S． bernardii)异
养生长的影响。
图 2 不同碳源对布那迪栅藻(S． bernardii)异养生长的影响
由图 2 可知，布那迪栅藻(S． bernardii)能利用
有机碳源进行异养生长，且该藻对葡萄糖、醋酸钠、
甘油和蔗糖的利用效率存在较大差异。布那迪栅藻
(S． bernardii)对葡萄糖的利用效率最高，其生物量
在 2 d达到最高，为 7． 4 g /L，3 d 略有下降，之后趋
于稳定，保持在 6． 6 g /L左右;而该藻对另外 3 种碳
源的利用效率较低，生长缓慢，因此葡萄糖是布那迪
栅藻(S． bernardii)进行异养生长的最佳碳源。此研
究结果与季祥［5］、Liang［6］等的研究结果相一致。
2． 1． 3 葡萄糖质量浓度优化
图 3 为不同质量浓度葡萄糖对布那迪栅藻
(S． bernardii)异养生长的影响。
图 3 不同质量浓度的葡萄糖对布那迪栅藻(S． bernardii)
异养生长的影响
由图 3 可知，较低的葡萄糖质量浓度不利于布
那迪栅藻(S． bernardii)的异养生长。较高的葡萄糖
质量浓度在培养初期对该藻生长有略微的抑制作
用，但并不明显。随着培养时间的延长，最终的生物
量随葡萄糖质量浓度的增加而上升，当葡萄糖质量
浓度超过 50． 0 g /L时抑制该藻生长，生物量开始下
降，说明该藻对葡萄糖具有一定的耐受性，超过一定
量，则会出现抑制作用。因此，布那迪栅藻(S． ber-
nardii)异养生长的最佳葡萄糖质量浓度为 50． 0 g /L，
最高生物量为 24． 8 g /L，比李玉芹等［7］报道的若夫
小球藻(C． zofingiensis) (30． 0 g /L)异养培养时的最
适葡萄糖质量浓度高，说明葡萄糖质量浓度对微藻
的影响因藻种而异，布那迪栅藻(S． bernardii)对葡
萄糖具有更高的耐受性。布那迪栅藻(S． bernardii)
摇瓶异养培养时的最高生物量为 24． 8 g /L，高于许
多异养培养的微藻［5 － 10］，表明布那迪栅藻(S． ber-
nardii)具有很高的异养生长潜力，能大大降低培养
成本。
2． 1． 4 酵母提取物质量浓度优化
图 4 为不同质量浓度的酵母提取物对布那迪栅
藻(S． bernardii)异养生长的影响。从图 4 中可以看
出，酵母提取物质量浓度 1． 4 g /L 组在培养初期因
氮浓度不足而阻碍了布那迪栅藻(S． bernardii)的
生长，随着培养时间的延长，生物量逐渐上升并超过
4． 1 g /L组和 5． 4 g /L组;4． 1 g /L组和 5． 4 g /L组由
于氮浓度过高，对该藻的生长具有抑制作用;而 2． 7
562014 年第 39 卷第 6 期 中 国 油 脂
g /L组的生物量在整个生长周期中一直高于其他
组，且该组在 12 d 时生物量达到最高，为 22． 7 g /L，
因此布那迪栅藻(S． bernardii)异养生长的最适酵母
提取物质量浓度为 2． 7 g /L。
图 4 不同质量浓度的酵母提取物对布那迪栅藻
(S． bernardii)异养生长的影响
2． 2 异养培养对布那迪栅藻( S． bernardii) 代谢产
物的影响
2． 2． 1 不同质量浓度葡萄糖对布那迪栅藻(S． ber-
nardii)细胞内生化组分含量的影响
图 5 为不同质量浓度葡萄糖对布那迪栅藻
(S． bernardii)细胞内碳水化合物、总脂和蛋白质
含量的影响。
图 5 不同质量浓度葡萄糖对布那迪栅藻(S． bernardii)
细胞内生化组分含量的影响
从图 5 中可以看出，异养培养时，布那迪栅
藻(S． bernardii)细胞内主要积累碳水化合物，其
含量显著高于其他两种组分。碳水化合物的含
量随葡萄糖质量浓度的增加先上升后下降，并在
葡萄糖质量浓度为 30 ． 0 g /L 时达到最高，为细胞
干重的 58 ． 2%;葡萄糖质量浓度范围在 10 ． 0 ～
50 ． 0 g /L 时，总脂含量随着葡萄糖质量浓度的增
加而不断升高，说明在异养条件下，一定范围内
高葡萄糖质量浓度有利于该藻总脂的积累，但超
过 50 ． 0 g /L 时，总脂含量开始下降，说明超过一
定的范围，葡萄糖则会抑制其总脂的积累，即在
葡萄糖质量浓度为 50 ． 0 g /L 时，总脂含量最高，
占细胞干重的 30 ． 7%;而蛋白质的含量随葡萄糖
质量浓度的增加不断下降，但高于 50 ． 0 g /L 时，
蛋白质含量略有上升，最高蛋白质含量在葡萄糖
质量浓度 5 ． 0 g /L时获得，为 39 ． 8%，可见低质
量浓度葡萄糖有利于该藻细胞内蛋白质的积累。
2． 2． 2 不同质量浓度酵母提取物对布那迪栅藻
(S． bernardii)细胞内生化组分含量的影响
图 6 为不同质量浓度酵母提取物对布那迪栅藻
(S． bernardii)细胞内碳水化合物、总脂和蛋白质含
量的影响。
图 6 不同质量浓度酵母提取物对布那迪栅藻
(S． bernardii)细胞内生化组分含量的影响
由图 6 可知，酵母提取物质量浓度对该藻细胞
内碳水化合物的含量影响较小，均为细胞干重的
50． 0%左右;而酵母提取物质量浓度对总脂和蛋白
质含量的影响正好相反，当酵母提取物质量浓度高
于或低于 2． 7 g /L时，总脂含量均减少，蛋白质含量
均增加，酵母提取物质量浓度为 2． 7 g /L 时，总脂含
量最高，为细胞干重的 30． 9%，此时蛋白质含量最
低，最高蛋白质含量在酵母提取物质量浓度为 5． 4
g /L时获得，占细胞干重的 26． 7%。可见在异养培
养条件下布那迪栅藻(S． bernardii)的代谢途径发生
了明显的变化，总脂的积累显著减少，碳水化合物含
量有所增加。
2． 2． 3 不同质量浓度葡萄糖对布那迪栅藻(S． ber-
nardii)各生化组分产率的影响
图 7 为不同质量浓度葡萄糖对布那迪栅藻
(S． bernardii)各生化组分产率的影响。
图 7 不同质量浓度葡萄糖对布那迪栅藻(S． bernardii)
各生化组分产率的影响
从图 7 中可以看出，葡萄糖质量浓度对布那迪
栅藻(S． bernardii)碳水化合物和总脂的产率影响较
大，对蛋白质产率的影响较小。在葡萄糖质量浓度
66 CHINA OILS AND FATS 2014 Vol. 39 No. 6
为 5． 0 ～ 50． 0 g /L 时，碳水化合物和总脂的产率随
葡萄糖质量浓度的升高而增加，而蛋白质的产率随
葡萄糖质量浓度的升高无明显变化;当葡萄糖质量
浓度高于 50． 0 g /L时，碳水化合物和总脂的产率开
始下降，蛋白质的产率略有升高，说明在一定范围
内，葡萄糖质量浓度的增加能显著提高该藻碳水化
合物和总脂的产率，超过此范围，则出现明显的抑制
作用。因此，葡萄糖质量浓度为 50． 0 g /L 时，布那
迪栅藻(S． bernardii)的碳水化合物和总脂的产率最
高，分别为 1． 05 g /(L·d)和 0． 64 g /(L·d)。
2． 2． 4 不同质量浓度酵母提取物对布那迪栅藻
(S． bernardii)各生化组分产率的影响
图 8 为不同质量浓度酵母提取物对布那迪栅藻
(S． bernardii)各生化组分产率的影响。
图 8 不同质量浓度酵母提取物对布那迪栅藻
(S． bernardii)各生化组分产率的影响
从图 8 中可以看出，酵母提取物质量浓度对布
那迪栅藻(S． bernardii)碳水化合物和总脂的产率影
响较大，对蛋白质产率的影响较小。三者的变化均
呈现先增加后降低的趋势，酵母提取物质量浓度为
2． 7 g /L时，碳水化合物和总脂的产率达到最大值，
分别为 0． 95 g /(L·d)和 0． 56 g /(L·d) ，而酵母提
取物质量浓度为 4． 1 g /L 时，蛋白质的产率达到最
大值，为 0． 26 g /(L·d)。
3 结 论
布那迪栅藻(S． bernardii)异养培养的最佳碳源
为葡萄糖，最适质量浓度 50． 0 g /L;最佳氮源为酵
母提取物，最适质量浓度 2． 7 g /L。摇瓶异养培养时
最大生物量达 24． 8 g /L。布那迪栅藻异养培养时细
胞内主要积累碳水化合物(最高含量为 58． 2%，最
高产率为 1． 05 g /(L·d) ) ，其次是总脂(最高含量
为 30． 9% ，最高产率为 0． 64 g /(L·d) ) ，说明异养
培养是一种有效的培养方式，适合于该藻的生物质
及其细胞内储藏性能量物质(总脂和碳水化合物)
的积累。
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