全 文 ：第 33 卷第 8 期
2012 年 8 月
环 境 科 学
ENVIRONMENTAL SCIENCE
Vol． 33，No． 8
Aug．，2012
蛋白核小球藻 Chlorella pyrenoidosa-15 的异养培养条
件优化及污水养殖
王秀锦，李兆胜，邢冠岚，李卓凝，袁红莉，杨金水*
(中国农业大学生物学院，农业生物技术国家重点实验室，北京 100193)
摘要:为了提高微藻的生物量及油脂产量以降低微藻生物柴油的生产成本，采用光异养培养模式对蛋白核小球藻进行培养，
确定其最适生长的碳源为葡萄糖，氮源为大豆蛋白胨．采用响应面设计的方法对蛋白核小球藻 Chlorella pyrenoidosa-15 光异养
培养过程中的最佳碳氮源浓度进行了优化，在葡萄糖含量为 17. 53 g·L －1，大豆蛋白胨含量为 8. 67 g·L －1时，生物量最大产量
为 0. 63 g·(L·d)－ 1，与模型预测结果［0. 62 g·(L·d)－ 1］基本吻合，此时其油脂含量为 19. 25%，油脂产量达到 121. 3
mg·(L·d)－ 1 ．污水养殖结果显示，在以北京市城市生活污水为培养基的情况下，微藻 Chlorella pyrenoidosa-15 对污水具有良好
的净化能力，COD的去除率达到 80. 9%，总氮的去除率达到 69%，同时其也具有较好的产油效率，生物量和油脂含量分别可达
到 1. 00 g·L －1和 24. 12%，具有进一步研究的理论及应用价值．
关键词:微藻;蛋白核小球藻;异养培养;生物柴油;污水养殖
中图分类号:X382 文献标识码:A 文章编号:0250-3301(2012)08-2735-06
收稿日期:2011-10-11;修订日期:2011-12-14
基金项目:中央高校基本科研业务费专项 (2011JS109，2011-BKS-
22)
作者简介:王秀锦(1986 ～) ，女，硕士研究生，主要研究方向为环境
微生物学，E-mail:nitchaya． tk@ hotmail． com
* 通讯联系人，E-mail:yangjsh1999@ 163． com
Optimization of Chlorella pyrenoidosa-15 Photoheterotrophic Culture and Its Use
in Wastewater Treatment
WANG Xiu-jin，LI Zhao-sheng，XING Guan-lan，LI Zhuo-ning，YUAN Hong-li，YANG Jin-shui
(State Key Laboratory of Agro-Biotechnology，College of Biological Sciences，China Agricultural University，Beijing 100193，China)
Abstract:To improve the biomass and lipid productivity of the microalgae Chlorella pyrenoidosa-15，the carbon and nitrogen sources
were screened to culture it heterotrophically． The best carbon and nitrogen sources were glucose and soy peptone，respectively． The
carbon and nitrogen concentrations were optimized with the help of response surface design． The maximum biomass productivity was
predicted to be 0. 62 g·(L·d)－ 1 with glucose and soy peptone concentrations of 17. 53 g·L －1 and 8. 67 g·L －1，respectively． The
results of response surface design were validated with biomass productivity of 0. 63 g·(L·d)－ 1 and lipid content of 19. 25% ． The lipid
productivity reached 121. 3 mg·(L·d)－ 1 ． In the research of Chlorella pyrenoidosa-15 cultured in non-autoclaved Beijing urban
wastewater，the maximum algae biomass dry weight of 1. 00 g·L －1 was achieved with a lipid content of 24. 12% ． Results also showed
that the treatment using Chlorella pyrenoidosa-15 effectively reduced the COD values and total nitrogen content in the wastewater，with
a COD degradation rate of 80. 9%，and a 69% decrease in total nitrogen content．
Key words:microalgae;Chlorella pyrenoidosa;heterotrophic culture;biodiesel;wastewater treatment
随着近年来化石燃料的日益枯竭以及全球变暖
等问题的凸显，寻求一种清洁的可持续的替代能源
已经成为解决这一问题的迫切需求． 生物燃料具有
清洁，可再生，减少二氧化碳排放等优点，已成为最
近人们关注的焦点［1］． 而作为生物燃料之一，生物
柴油在替代化石燃料柴油上具有非常大的潜力．
生物柴油的原料主要来自植物油脂(大豆油、
玉米油、菜籽油、棕榈油等)、动物油脂(各种动物
脂肪)、微藻油脂以及废弃食用油(地沟油)等． 目
前以植物油脂和动物油脂为原料生产的生物柴油大
约占所需柴油的 3%，这远远不能达到替代化石燃
料柴油的需求，而且如果增加以植物油脂和动物油
脂为原料的生物柴油的产量必将导致世界粮食供应
问题［2］．作为生物柴油重要原料之一，微藻有着生
产率高，占用耕地面积和淡水资源少，不与人争粮，
不与粮争地的优点［3］．加之其能够通过光合作用获
取无机或有机碳源，适应多变的环境条件，并且可以
利用废水或海水进行生长［4］，使得微藻生物柴油成
为化石燃料具有极大潜力的替代品之一．然而，微藻
生物柴油的广泛生产和使用因成本过高而受到了极
大的限制．以目前的条件，假设微藻含油量为 55%，
生产 1 t微藻生物柴油，成本约为3 000美元．而生物
柴油的生产成本需要低于 340 美元·t － 1才能与 100
美元·桶 － 1的石油经济效益相当［5］． 因此，降低生产
成本是目前微藻生物柴油开发的基本要求．
DOI:10.13227/j.hjkx.2012.08.003
环 境 科 学 33 卷
微藻培养是微藻生物柴油生产的一个重要环
节，通常可以通过增加生物量产量或提高油脂含量
来提高微藻油脂产量． 使微藻处于恶劣的环境(如
氮饥饿)可以提高其油脂含量，但这往往是在牺牲
生物量产量的基础上实现的［6］． 而油脂产量则更能
体现微藻的产油能力．研究表明，通过异养培养来增
加生物量产量的同时，油脂产量也呈现出上升的趋
势［7］．因此通过异养培养增加生物量产量是提高油
脂产量行之有效的方法．
影响微藻生长的因素包括营养条件，光照，温度
等．研究表明，在异养培养条件下，碳、氮、磷是影
响微藻生长的 3 种重要元素［8］． 其中碳、氮对微藻
生长的影响更加明显一些，而培养基中极少量的磷
就足够微藻的生长［9］．因此，对微藻培养基中碳、氮
进行优化是提高微藻油脂产量的有效方式．
微藻异养培养意味着大量有机原料的投入，城
市污水中含有丰富有机及无机碳氮等营养物质［10］，
将其与污水处理相结合则能够很好地解决这一问
题． 目前，已有很多使用微藻进行污水处理的研
究［11，12］，但是将微藻产油和污水处理相结合的研究
还处于起步阶段，因此，研究微藻在污水中的生长特
性具有重要的实用价值和理论意义．
本研究以小球藻 Chlorella pyrenoidosa-15 为出
发藻株，采用响应面法优化其最佳碳源和氮源，并使
用不同处理的城市污水对小球藻进行培养，以期为
微藻产油和污水培养的实际结合提供理论基础．
1 材料与方法
1. 1 菌株及培养
实验使用的藻株为本实验室诱变得到的突变株
Chlorella pyrenoidosa-15． 将藻种接种于装有 100 mL
培养基的300 mL三角瓶中，置25℃，140 r·min －1光照
摇床培养，光照强度为 50 μmol·(m2·s)－1，培养时间
为 7 d． 每升接种量约为 1010个细胞． 培养结束后，
6 000 r·min －1离心 10 min收集藻体，并冷冻干燥．
基本培养基为 BG11 培养基，其成分为每升培
养基 1. 784 g KNO3，0. 02 g Na2CO3，0. 025 g
NaH2PO4·2H2O，0. 075 g MgSO4，0. 027 g CaCl2和 1
mL 微量元素母液，pH为 7. 0．每升微量元素母液含
有 6 g 柠檬酸，6 g 柠檬酸铁氨，1. 192 g EDTANa2，
2. 86 g H3BO3，1. 86 g MnCl2·4H2O，0. 22 g ZnSO4·
7H2O，Na2MoO4·2H2O，0. 08 g CuSO4·5H2O 和
0. 05 g Co(NO3)2·6H2O．
通过向 BG11 培养基中加入有机碳源来选择最
优碳源． 加入的有机碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳
糖、甘油、甘露醇、乙酸、乳酸和乙醇．加入的碳含量
均为 4 g·L －1 ． 加有葡萄糖的培养基在 115℃ 灭
菌［13］．
同时通过将 BG11 培养基中的 KNO3 换为其它
氮源来选择最优氮源． 替换的氮源包括酸水解酪蛋
白、酵母粉、脲、硫酸铵、硝酸钠、大豆蛋白胨、鱼
蛋白胨、胰蛋白胨和蛋白胨． 按原培养基中的含氮
量定量加入．
1. 2 实验设计和响应面分析
1. 2. 1 最陡爬坡实验
为逼近微藻的最大生物量产量，以建立更有效
的响应面方程，根据预实验设计最陡爬坡实验．
1. 2. 2 响应面实验
本 实 验 使 用 Design-Expert 中 的 Central-
Composite设计响应面实验来对培养基中碳氮含量
进行优化．因素分别为碳氮源选择实验中确定的碳
源和氮源的量，单位为g·L －1 ．根据最陡爬坡实验的
结果来设计因素水平中心点和最低最高水平，编码
值为 － 1、0 和 1，响应值为生物量产量，单位为
g·(L·d)－ 1 ． 最终结果通过 Design-Expert 进行分析
并对最优结果进行预测．
1. 3 油脂提取
采用改进的酸热法［14］对微藻油脂进行提取．称
取 0. 5 g干藻粉，加入 20 mL 4 mol·L －1的 HCl溶液，
室温放置 30 min后沸水浴 3 min，然后冰浴速冷．将
处理好的样品转入 50 mL 玻璃离心管，加入等体积
(20 mL)体积比为 1∶ 2的氯仿∶甲醇溶液，振荡混匀，
1 000 r·min －1离心 5 min，取下层溶液于预先称重的
玻璃离心管中，置通风橱中氮气吹干(气压表维持
在 0. 2 MPa)．
1. 4 污水参数测定及微藻污水培养
污水 COD 使用哈希 DR1010 COD 测定仪进行
测定，污水总氮采用《水质总氮的测定碱性过硫酸
钾-消解紫外分光光度法》(GB 11894-89)进行测定．
污水初始 COD 为3 226 mg·L －1，总氮为 70. 86
mg·L －1 ．将污水进行不同的处理:①灭菌;②稀释 1
倍并灭菌;③以 5 g·L －1的量补充葡萄糖并灭菌，以
污水原液作为对照． 分别按照上述处理对微藻 C．
pyrenoidosa-15 进行培养，培养后收集藻体，检测不
同处理下，微藻的生长产油情况及其对污水的处理
效果．
1. 5 显著性分析
使用 SPASS 1. 7 中的单因子方差分析和
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8 期 王秀锦等:蛋白核小球藻 Chlorella pyrenoidosa-15 的异养培养条件优化及污水养殖
Duncan分析方法对碳氮源选择实验数据进行显著
分析，显著性差异水平为 P ＜ 0. 05．
2 结果与讨论
2. 1 碳氮源选择
蛋白核小球藻在分别以葡萄糖、蔗糖、淀粉、
乳糖、甘油、甘露醇、乙酸、乳酸、乙醇为碳源的培
养基中的生长情况如图 1 所示．从中可以看出，以葡
萄糖为碳源时生物量浓度最高，可达到 0. 977
g·L －1，是 BG11 培养生物量浓度(0. 143 g·L －1)的 6
倍，相对其他处理的生物量也要高得多．也有很多相
关研究表明，蛋白核小球藻能够对葡萄糖进行很好
地利用．马华继等［15］对蛋白核小球藻活性污泥固定
化培养的研究表明，蛋白核小球藻在加有葡萄糖的
自养培养基中生长具有适应期较短、对数期较长、
藻细胞最大生长率高，且最大生长率出现时间早的
特点．另外，从结果可以看出，在加入乙酸和乳酸的
BG11 培养基中，蛋白核小球藻均不能生长．
图 1 碳源对蛋白核小球藻细胞生长的影响
Fig． 1 Effect of carbon sources on cell growth of C． pyrenoidosa-15
蛋白核小球藻在分别以酸水解酪蛋白、酵母
粉、尿素、硫酸铵、硝酸钠、大豆蛋白胨、鱼蛋白
胨、胰蛋白胨、蛋白胨为氮源的培养基中的生长情
况如图 2 所示．从中可以看出，以大豆蛋白胨为氮源
的生物量浓度最高，为 0. 203 g·L －1 ． 另外，以蛋白
胨、尿素和胰蛋白胨为氮源的生物量浓度相对于用
BG11 培养也有较大的提高．但由于培养基灭菌过程
中尿素的热不稳定性以及蛋白胨、胰蛋白胨价格昂
贵的缺点，使得大豆蛋白胨成为最优的选择．以硝酸
铵为氮源的培养中，蛋白核小球藻受到明显的抑制，
这和王顺昌等［16］的研究结果相符合，即氨态氮作为
氮源的生长状况相对于硝态氮会受到明显的抑制．
图 2 氮源对 C． pyrenoidosa-15 细胞生长的影响
Fig． 2 Effect of nitrogen sources on cell growth of C． pyrenoidosa-15
因此，选择葡萄糖和大豆蛋白胨作为蛋白核小
球藻后续培养的最适碳氮源．
2. 2 培养基碳氮源响应面优化
设计最陡爬坡实验检测不同葡萄糖和大豆蛋白
胨浓度下蛋白核小球藻的生长情况，以确定响应面
设计的中心点．最陡爬坡实验设计如表 1 所示．
表 1 最陡爬坡实验设计 / g·L －1
Table 1 Steepest ascent experimental design /g·L －1
组号 葡萄糖含量 大豆蛋白胨含量
A 5 2
B 15 6
C 25 10
D 35 14
E 45 18
F 55 22
最陡爬坡实验结果如图 3 所示，在葡萄糖和大
豆蛋白胨浓度为 B 水平，生物量产量的值最大． 因
此，以 B 为中心点，选择合适的步长使用 Design-
Expert中的 Central-Composite设计响应面实验，因素
水平设置如表 2 所示，实验设计结果如表 3 所示．根
据设计进行实验，最终得到的生物量产量结果如表
3 所示．使用 Design-Expert对结果进行回归拟合，得
到的以因素编码值计量的拟合方程如下:
Biomass = 0. 53 + 0. 15 A +0. 17 B + 0. 028 AB －
0. 12 A2 － 0. 091B2 － 0. 13A2B － 0. 15 AB2
表 2 实验因素水平设置 / g·L －1
Table 2 Quantitative values of the encoded factor levels /g·L －1
因素
水平
－ 1 0 1
葡萄糖 5 15 25
大豆蛋白胨 2 6 10
7372
环 境 科 学 33 卷
对以上模拟方程的方差分析结果如表 4 所示．
模型的显著性以及失拟性的非显著性可以说明此拟
合方程是可信的． 另外，R2 (0. 975 8)以及 Adj R2
(0. 919 4)也进一步说明了拟合方程的可信性．
图 4 为培养基中葡萄糖和大豆蛋白胨的含量对
生物量产量的交互效应图．从中可以看出，葡萄糖和
图 3 最陡爬坡实验结果
Fig． 3 Results of the steepest ascent experiments
大豆蛋白中的交互作用是比较明显的． 在葡萄糖含
量为 15 ～ 25 g·L －1，大豆蛋白胨为 6 ～ 10 g·L －1时，
生物量产量能达到最大值．
根据拟合模型对最优值预测，结果显示，在培养
基中葡萄糖含量为 17. 53 g·L －1，大豆蛋白胨为
8. 67 g·L －1时，生物量产量能达到 0. 62 g·(L·d)－ 1 ．
表 3 Central-Composite实验设计及生物量
产量的实验值和预测值
Table 3 Central-Composite Design matrix with experimental and
predicted values for microalgae biomass productivity
实验组
因子 生物量产量 / g·(L·d)－ 1
A /葡萄糖 B /大豆蛋白胨 实验值 预测值
1 － 1 － 1 0. 28 0. 30
2 1 － 1 0. 22 0. 25
3 1. 414 0 0. 53 0. 51
4 0 － 1. 414 0. 13 0. 11
5 0 0 0. 50 0. 53
6 0 0 0. 56 0. 53
7 － 1. 414 0 0. 11 0. 078
8 － 1 1 0. 31 0. 34
9 1 1 0. 37 0. 40
10 0 1. 414 0. 62 0. 60
11 0 0 0. 54 0. 53
图 4 葡萄糖和大豆蛋白胨含量对生物量产量的交互效应
Fig． 4 Interinfluence of glucose and soy peptone concentrations on biomass productivity
表 4 响应面模拟方程的方差分析1)
Table 4 Analysis of variance for response
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性
模型 0. 32 7 0. 046 17. 30 0. 019 7 显著
残差 0. 008 0 3 0. 002 6 — — —
失拟 0. 005 9 1 0. 005 9 5. 80 0. 137 7 不显著
纯误差 0. 002 1 2 0. 001 0 — — —
总和 0. 33 10 — — — —
1)R2 = 0. 975 8，Adj R2 = 0. 919 4
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8 期 王秀锦等:蛋白核小球藻 Chlorella pyrenoidosa-15 的异养培养条件优化及污水养殖
2. 3 响应面优化结果的验证以及产油分析
使用优化后培养基进行培养，验证其生物量产
量，并检测油脂含量及油脂产量． 结果显示，蛋白核
小球藻-15 在优化后培养基中生长 7 d后，生物量浓
度可达(4. 423 4 ± 0. 008 9)g·L －1，产量为(0. 63 ±
0. 001 3)g·(L·d)－ 1，和预期结果相符． 另外，培养
后微藻油脂含量为(19. 25 ± 0. 48)% ． 最终油脂产
量可达 121. 3 mg·(L·d)－ 1 ．
2. 4 微藻污水培养
为考察微藻 C． pyrenoidosa-15 在污水中的生长
与产油情况，对北京市城市生活污水样品经不同处
理后培养 C． pyrenoidosa-15．培养 7 d 后，对其生物
量浓度，油脂含量，对污水的处理效果进行了检测，
结果如表 5 所示． 相对于其他不同的处理，C．
pyrenoidosa-15 在污水原液中生长状况更为可观，生
物量浓度能达到 1 g·L －1 ． 另外，实验组 3 中微藻油
脂含量达到了 30. 89%，比在污水原液中培养的微
藻高出了 28. 07%，可以看出，添加一定的碳源更有
利于微藻油脂的积累．从实验 1、2 组的结果可以看
出，对污水进行灭菌处理似乎并不利于微藻 C．
pyrenoidosa- 15 的 生 长． 这 有 可 能 是 由 于 C．
pyrenoidosa-15 能够和污水中的好氧细菌形成共生
关系而能够更好地利用污水中的营养物质［17］，但具
体原因还有待进一步研究．
目前用于污水培养生产生物柴油研究的藻类
主要 有 Chlorella minutissima、Chlorella vulgaris、
Chlorella pyrenoidosa 等． Bhatnagar 等［18］ 对
Chlorella minutissima 在污水中的生长情况进行了
研究，发现经过稀释的污水比污水原液更利于微
藻的生长;刘建强等［19］利用 COD 为 100 mg·L － 1
左右的低浓度市政污水来培养小球藻 Chlorella
vulgaris 用于生产生物柴油，COD 和 N 的去除率分
别为 26. 0%和 50. 0%，油脂产量达 0. 001 g·L － 1;
卢淑萍［20］在实际污水中培养 Chlorella pyrenoidosa，
油脂产量为 0. 1 g·L － 1，污水的处理效果没有测
定．本实验使用高 COD的污水对 C． pyrenoidosa-15
进行培养，C． pyrenoidosa-15 在污水原液中生长最
佳，生 物 量 最 高，油 脂 产 量 也 达 到 了 241. 1
mg·L － 1，COD和总氮的去除效果最佳，COD 去除
率达到 80. 9%，总氮的去除率达到 69. 22%，明显
优于目前已有的研究报道，具有进一步研究的实
际应用潜力．
表 5 微藻污水处理后的结果
Table 5 Cell growth，lipid accumulation，COD and TN degradation rate in different wastewater culture media
样品编号 培养基
生物量
/ g·L －1
油脂含量
/%
油脂产量
/mg·L －1
COD去除率
/%
TN去除率
/%
CK 污水原液 1. 00 24. 12 241. 1 80. 9 69. 22
1 灭菌污水 0. 52 22. 31 114. 9 22. 7 16. 43
2 50%稀释灭菌污水 0. 39 17. 31 68. 2 8. 87 8. 02
3 补充碳源灭菌 0. 96 30. 89 295. 5 16. 3 23. 84
3 结论
通过 培 养 基 碳 氮 源 的 选 择，确 定 了 C．
pyrenoidosa-15 最适碳氮源为葡萄糖和大豆蛋白胨．
通过响应面实验对培养基中葡萄糖和大豆蛋白胨的
浓度进行优化，最终得到葡萄糖和大豆蛋白胨分别
为 17. 53 g·L －1和 8. 67 g·L －1时，生物量产量为 0. 63
g·(L·d)－ 1，油脂含量为 19. 25%，油脂产量可达
121. 3 mg·(L·d)－ 1 ．通过 C． pyrenoidosa-15 在污水
中生长情况的研究表明，C． pyrenoidosa-15 比较适
合在污水中养殖，可以对其进行进一步的研究来实
现微藻产油和污水处理的最优化．
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