全 文 ：不同磷条件下斜生
栅藻胞外ALP 和 ACP 的变化
谢　影1 ,于　敏2 ,魏亦军1 ,陈永红1
(1.淮南师范学院 化学生物系 ,安徽 淮南　232001;2.安徽大学 生命科学学院 ,安徽 合肥　230039)
摘　要:不同培养液磷的含量对斜生栅藻胞外 ALP、ACP的活性有显著影响 , 在磷胁迫
时 ,胞外 ALP 的活性显著增加 , ACP的活性有类似的变化 ,但上升幅度小于 ALP。在有机磷
存在时 , ALP的活性变化与磷胁迫时相近 ,而 ACP对不同磷源的变化反应不明显。 pH 对斜
生栅藻胞外 ALP和 ACP 的影响不明显 ,但可以显著提高胞外 CA 活性。
关键词:斜生栅藻;碱性磷酸酶;酸性磷酸酶;磷
中图分类号:Q949.2　　文献标识码:A　　文章编号:1000-2162(2004)03-0070-05
斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)是淡水中常见的藻类 ,由于具有一定的除磷效果 ,近
年来广泛用于环境生态方面的研究[ 1] ,近年来对淮河浮游植物的采集中发现 ,淮河的所有
季节都具有较大的生物量 ,随着对淮河生态治理的开展[ 2] ,它可能会成为评估淮河水体富
营养化的重要指示生物。磷是植物生长发育的三大营养元素之一 ,对藻类生长有重要的影
响 ,往往成为藻类生长的限制因子 。许多藻类都可以利用不同形式的磷作为生长发育的磷
的来源。如沙角衣藻(Chlamydom onassajiao Lewin)、斜生栅藻都可以利用矿石作为磷的
来源[ 3] 。一些藻类在磷胁迫或使用不同形式的磷作为磷的来源时 ,在生化指标等方面会产
生一定的变化 ,沙角衣藻在磷胁迫时 ,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase , ALP)的含量显著增
加。藻类在生长发育过程中会向环境中分泌一些酶类 ,如 ALP 和碳酸酐酶(carbonic anhy-
drase , CA)等 ,构成了水体中各种酶的主体 。这些酶的活性在不同的培养条件下会发生一
定的改变 ,莱氏衣藻胞外碳酸酐酶受环境的 pH 改变而变化[ 4] 。本文对不同培养条件下 ,斜
生栅藻胞外碱性磷酸酶和酸性磷酸酶(acid phosphatase , ACP)的活性进行了研究 。
1　材料和方法
1.1　藻　种
实验所用的斜生栅藻是 2002年 9月从淮河水中分离 ,经多代培养获得 。实验前再经数
代接种 ,使藻类细胞生长处于基本同步状态 。采用朱氏 10号完全培养基进行振荡培养 ,培
养光照 2000Lux ,光周期 12h ,培养温度为 25℃。
收稿日期:2004-01-09
基金项目:安徽省教育厅基金资助项目(2003KJ294)
作者简介:谢　影(1960-), 女 ,安徽怀远人 , 淮南师范学院讲师.
　　　　　2004 年 5 月第 28 卷 第 3 期　　 　
安徽大学学报(自然科学版)
Journal of Anhui University Natural Science Edition
　　 　 May 2004
Vol.28 No.3
1.2　培养基
实验用水为去离子水 ,按 Zanot to[ 5]等方式配制的人工淡水 ,采用朱氏 10号培养基为基
本培养基 ,先配制不含磷的培养基 ,然后根据实验要求 ,改变培养基的成分或性质 ,接种藻种
进行培养 。
1.3　不同磷浓度对斜生栅藻胞外酶的影响
实验使用的磷源为磷酸二氢钠 , 设计磷浓度梯度为 0.0mg·L-1 , 40.0mg·L-1 , 和
100.0mg·L-1 ,将配制好的培养基接种后 ,按适当条件进行培养 ,分别在接种后 8h , 32h ,56h
和 80h时取样进行测定 。
1.4　不同磷源对斜生栅藻胞外酶的影响
为考查无机磷和有机磷对斜生栅藻胞外 ALP 和 ACP 活性的影响 ,在无磷朱氏培养基
内分别加入磷酸二氢钠和 β-甘油磷酸钠 30m mol·L-1 ,以不添加组作为对照 ,分别接种上述
经无磷培养基培养 80h的藻种 ,在接种后 8h ,32h 和 56h分别取样测定胞外酶活性 。
1.5　不同 pH对斜生栅藻胞外酶的影响
调节朱氏 10号完全培养基的 pH ,使之分别为 6.0 ,7.5和 9.0 ,然后接种斜生栅藻 ,同
上面条件进行培养 ,在接种 24h后取样品进行测定。
1.6　接　种
取对数生长期的藻种 100mL ,4000rpm 离心 15min ,弃上清液 ,用培养用水洗涤一次 ,再
离心 ,然后接种于特定的培养液中 ,常规条件培养 。
1.7　酶活性测定
ALP 和 ACP 的测定直接采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)进行比色测定 ,以磷
酸苯二钠作底物 ,水解释放出酚与 4-氨基安替比林和铁氰化钾形成稳定的紫红色物质。分
别取 3mL 培养液于 Eppendo rf管中 ,加缓冲液和底物 , 37℃水浴 30min后离心 ,最后加入显
色剂显色 ,540nm 波长比色 ,酶的活性单位以每小时每 10万细胞水解磷酸苯二钠释放的酚
的μg 数计算 。CA的测定按参考文献[ 4]进行。细胞数的测定采用比色法 。
1.8　数据处理
实验设置 5组平行 ,所有数据均采用平均值±标准差表示 ,结果用方差分析进行处理 。
2　结　果
2.1　不同磷浓度下斜生栅藻胞外 ALP和 ACP活性的变化
不同磷浓度条件下 ,斜生栅藻胞外 ALP 活性变化显著(图 1 , a)。在接种培养 8h 时 ,不
同磷浓度下 ALP 的活性无显著变化(P >0.05)。从接种培养 32h 起 ,不同磷浓度对栅藻胞
外ALP 的活性影响显著 ,其中不添加组(磷饥饿)ALP 活性最高 ,达 0.57U ,添加 100mg/L
的仅为 0.21U 。培养 56h和 80h时的测定结果同 32h类似 ,但 56h 和 80h 时 ,添加 40mg/L
和100mg/L 之间无显著变化。实验同时发现 ,在相同的 P 添加水平下 ,随着培养时间的延
长 ,胞外 ALP 的活性呈上升的趋势 ,尤其是磷饥饿组上升最快 ,从 8h 时的 0.41U 升高到
80h时的 3.33U;而在 40mg/L 和 100mg/ L 的培养液中 , ALP 的水平分别从 0.40U 和
0.25U上升到 0.68U 和 0.54U 。
71第 3 期谢　影 ,等:不同磷条件下斜生栅藻胞外 ALP和 ACP 的变化
图 1　不同磷浓度下斜生栅藻胞外 ALP(a)和 ACP(b)活性的变化
ACP 的活性在不同培养条件下变化也比较显著(图 1b),其中在接种后 8h时 ,以磷饥饿
组最高 ,为 8.18U;接种后 32h ,各实验组 ACP 水平均有显著的下降 ,但仍以磷饥饿组为最
高 ,为 7.51U ,添加 100mg/L 磷的那一组最低 ,为 4.2U 。从接种后 56h开始 ,各实验组斜生
栅藻胞外 ACP 的活性逐渐上升 ,总体趋势是不添加磷的组水平高于添加组。
2.2　不同磷源条件下斜生栅藻胞外 ALP和 ACP活性的变化
在使用 30mmol.l-1磷酸二氢钠和 β-甘油磷酸钠进行培养时 ,斜生栅藻胞外 ALP 和
ACP 活性也呈现出不同变化(图 2)。在接种后 8h时 ,磷饥饿组胞外 ALP 的活性达3.31U ,
显著高于 β -甘油磷酸钠和磷酸二氢钠添加组 ,在连续培养到 32h和 56h 时 ,其活性无显著
变化。而添加 β-甘油磷酸钠后 ,随着培养时间延长 ,胞外 ALP 的活性也不断上升 ,分别从
8h的 0.50U 上升到32h的 1.89U 和56h的 3.21U 。添加无机磷组的 ALP 一直保持在比较
低的水平 ,从接种后 8h到 56h ,变化不显著。ACP 的变化与 ALP 有所不同 ,首先 ,不同磷源
对ACP活性影响较小 ,除磷胁迫组在接种后 56h 较高外 ,其余时段在各组间无显著差异。
三组 ACP 的活性在接种后 8h时无显著差别 ,分别为 5.05 , 4.90和 5.41 ,接种后 32h ,各组
均有显著的下降 ,然后又继续上升 。除在磷胁迫的情况下高于 8h外 ,其余两组同8h时无显
著差异。
图 2　不同磷源时斜生栅藻胞外 ALP(a)和 ACP(b)活性的变化
72 　　　　　　　　　　安徽大学学报(自然科学版) 第 28卷
2.3　不同 pH下斜生栅藻胞外 CA、ALP和 ACP的变化
将斜生栅藻分别接种于 pH 为 6.0 ,7.5和 9.0的培养基中 , 24h后测定胞外 CA , ALP
和ACP 活性的变化 。结果发现 ,pH 对斜生栅藻胞外 CA的活性有显著影响 ,其中当 pH 从
6.0上升到 7.5时 ,CA 无明显变化 ,但当继续升高 pH 至 9.0 时 ,胞外 CA迅速上升(见表
1)。而ALP 和ACP 的活性受 pH 影响很小 ,当pH 从 6.0升高到9.0时 ,它们的活性没有显
著变化。
表 1　不同 pH 下斜生栅藻胞外 CA、ALP 和 ACP 活性的变化
pH CA ALP ACP
6.0 2.24±0.32a 0.39±0.05a 5.01±0.45a
7.5 2.52±0.34a 0.40±0.06a 4.85±0.47a
9.0 6.80±1.88b 0.41±0.03a 5.25±0.26a
　　　　　注:同列中具相同字母代表差异不显著(P<0.05)
3　讨　论
磷是各类植物正常发育所必需的营养元素 ,磷的水平和磷源的特点都会对植物的正常
生长发育带来影响。许多藻类对磷非常敏感 ,它们可以在培养条件下 ,利用各种形式的磷作
为生长发育之需 ,如沙角衣藻 、斜生栅藻等[ 2] 。ALP 同植物对磷的利用有关[ 6] ,对许多藻类
来讲 ,ALP 和 CA均是诱导酶[ 4 , 7] ,容易受到环境因子的影响 。ACP 是一类金属水解酶 ,能
催化磷酸酯或酸酐的水解而生成无机磷酸根 ,同样与对磷的利用有关[ 8] 。
无论是 ALP 还是ACP都容易受到培养液中磷水平的影响 ,在磷饥饿时具有较高的活
性水平 。但二者又表现出不同的特征 ,其中 A LP 在接种后 8h 时水平较低 ,以后逐渐上升 ,
受诱导作用更加明显 ,而 ACP 在接种后 8h时 ,无论是在磷饥饿组或是在添加磷的情况下均
具有较高的水平 ,以后表现出短暂的下降 ,在接种后 32h ,其活性又开始上升 。这似乎意味
着对斜生栅藻来说 ,胞外 ALP 和 ACP 是一种诱导酶 ,当环境中磷缺乏时被大量诱导 ,而且
随着培养液中磷的消耗 ,这两种酶的活性均会逐渐上升 。不同磷源对斜生栅藻胞外 ALP 和
ACP 的影响有所不同 ,在磷饥饿时 ,胞外 ALP 水平处于比较高的状态 ,但在加入无机磷后
8h ,胞外 ALP 便迅速下降 ,而加入有机磷时 ,胞外ALP呈快速上升的趋势 。而 ACP 在利用
有机磷和无机磷时未表现出显著差异。这表明对于不同形式的磷的利用 ,ALP 起着更积极
的作用。另外 ,环境中 pH的变化并未对斜生栅藻胞外 ALP 和 ACP 的活性带来影响 ,但对
胞外 CA 的影响比较显著。
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The ALP and ACP activities of Scenedesmus obliquus
at different ambient phosphate levels and sources
XIE Ying1 , YUMin2 , WEI Yi-jun1 , CHEN Yong-hong1
(1.Faculty of Chemistry and Biolog y , Huainan Normal University , Huainan　232001 , China;
2.School of Life Science , Anhui University , Hefei　230039 , China)
Abstract:The ex tracellular ALP and ACP activi ties of Scenedesmus obliquus are affected
signif icantly by the ambient phosphate levels.On the condition of phosphate deficiency , the ex-
tracellular ALP levels rise signif icantly , so do the ext racellular ACP , but the extent is smaller
than that of ALP.The variat ion of ALP activities at the org anic phosphate condition is just like
that of phosphate deficiency , but the ACP has litt le changes at different phosphate sources.
There are no significant changes of A LP and ACP at dif ferent pH condit ions w hile the ext racel-
lular carbonic anhydrase activity increase sharply under these conditions.
Key words:Scenedesmus obliquus ;alkaline phosphatase;acidic phosphatase;phosphate
74 　　　　　　　　　　安徽大学学报(自然科学版) 第 28卷