全 文 ： 2009, Vol. 30, No. 24 食品科学 ※工艺技术118
改良DEAE-纤维素法制备龙须菜琼胶糖研究
戚 勃 1，杨贤庆 1 ,*，赵永强 1 ,2，李来好 1，陈胜军 1，岑剑伟 1，马海霞 1，刁石强 1
(1.中国水产科学研究院南海水产研究所，广东 广州 510300；2.广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524025)
摘 要：以龙须菜琼胶为原料，分别采用KMnO4-H2C2O4法漂白、乙醇处理和DEAE-纤维素纯化等工艺制备生化
级琼胶糖，并采用正交试验设计对工艺参数进行优化，对琼胶糖的理化指标和电泳性能进行测定。结果表明：漂
白实验的最佳工艺条件为KMnO4浓度 0.10%、pH6.0、漂白时间 5min、H2C2O4浓度 0.30%，漂白后琼胶白度(HW
值)为 82.98、凝胶强度为 1083g/cm2；乙醇处理的最佳工艺条件为料液比 1:40(g/ml)、乙醇体积分数 60%、处理时
间 6h，处理后琼胶透明度(透光率)为 50.2%。制备的琼胶糖灰分含量为 0.25%、凝胶强度为 1127g/cm2、硫酸基含
量为 0.24%；结晶紫电泳、电内渗测定和基因组DNA电泳实验表明，改良DEAE-纤维素法制备的琼胶糖具有优
异的电泳性能，适用于生物化学和分子生物学的凝胶电泳研究。
关键词：琼胶糖； DEAE-纤维素；DNA凝胶电泳
Preparation of Gracilaria lemaneiformis Agarose by Modified DEAE-cellulose Method
QI Bo1，YANG Xian-qing1,*，ZHAO Yong-qiang1,2，LI Lai-hao1，CHEN Sheng-jun1，CEN Jian-wei1
MA Hai-xia1，DIAO Shi-qiang1
(1. South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China；
2. College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524025, China)
Abstract ：Gracilaria lemaneiformis agarose was prepared through KMnO4-H2C2O4 bleaching, ethanol soaking and DEAE-
cellulose purification, respectively. Orthogonal experiments were used to optimize processing parameters. Physical and chemi-
cal index, and electrophoresis performance of agarose were also determined. Results showed that the optimal condition for
bleaching was 0.10% KMnO4, 0.30% H2C2O4, pH 6.0, bleaching time for 5 min. After bleaching treatment, whiteness (HW value)
of agar was 82.98 and gel strength was 1083 g/cm2. The optimal condition for ethanol soaking was 1:40 of solid-liquid ratio, 60%
ethanol, treatment time for 6 h. After ethanol soaking, transparency of 1.0% agarose (transmittance value) was 50.2%. The ash
content, gel strength and sulfate group content in agarose prepared by the optimal method were 0.25%, 1127 g/cm2 and 0.24%,
respectively. Gentian violet electrophoresis, electroendosmosis and genome DNA gel electrophoresis were also performed to
reveal that the agarose prepared by modified DEAE-cellulose method was suitable for biochemistry and molecular biology
electrophoresis.
Key words：agarose；DEAE-cellulose；DNA gel electrophoresis
中图分类号：Q539.9；TS245.9 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)24-0118-04
收稿日期：2009-08-12
基金项目：国家高技术研究发展计划项目(2007AA10Z345)；农业部公益性行业(农业)专项(200903030-E)；
广东省科技计划项目(2007A032600003)；广东省海洋渔业科技推广专项(A200899E01)；
中国水产科学研究院南海水产研究所中央级公益性科研院所专项资金项目(2007ZD06)
作者简介：戚勃(1978－)，男，助理研究员，硕士，主要从事水产品加工和质量安全研究。E-mail：qibo780210@163.com
*通讯作者：杨贤庆(1963－)，男，研究员，主要从事水产品加工和质量安全研究。E-mail：yxqgd@163.com
琼胶糖(agarose)是琼胶经过纯化分离除去硫琼胶
(agaropectin)部分，而得到硫酸根和灰分含量都很低的
链状多糖，琼胶糖的理化性质是近似理想的凝胶基质，
很适于生物聚合物的扩散和电动力移动[1]。因此，琼胶
糖广泛应用于生物化学、医学等领域中核酸、蛋白质
等生物大分子的凝胶电泳、对流免疫电泳以及多糖等大
分子的分离提纯。
琼胶糖在理论上不含硫酸基，由于红藻细胞壁中的
琼胶糖分子中的半乳糖羟基上或多或少地取代有硫酸
基，因此从红藻中制备的琼胶含有较高的硫酸基。琼
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胶则因硫酸基含量高，其凝胶在直流电场作用下产生对
流，从而被测物质得不到清晰的迁移和分离，因此琼
胶不能替代琼胶糖。琼胶糖的制备在于将琼胶中带有硫
酸基电荷密度最小的琼胶糖(SO4含量为0.1%～0.5%)与带
电荷密度较大(SO4含量为 3%～5%)的硫琼胶分离，从而
得到纯度较高的琼胶糖。
目前文献报道的琼胶糖制备方法主要有二甲亚砜
(DMSO)法、碘化钠和硫酸铵法、聚乙二醇法、EDTA-
Na2法以及DEAE-纤维素法[2]等。上述方法中，除了目
前常用的 DEAE-纤维素法外，其他方法都存在操作繁
冗、产率低、产品色泽差、凝胶强度低、透明度低
等问题。本实验以龙须菜琼胶为原料，在 DEAE-纤维
素法的基础上进行改进，从而获得品质优良的琼胶糖。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
龙须菜琼胶条(微黄色，凝胶强度约 1000g/cm2) 市售。
盐酸、无水乙醇、高锰酸钾、草酸、结晶紫、
丙三醇、三氯乙酸、明胶、氯化钡 (均为分析纯 )。
DEAE-52纤维素 Whatman公司；BIO WEST琼胶糖
(BR级) Gene tech公司；100bp DNA Ladder Takara公
司；基因组 DNA 实验室自制。
1.2 仪器与设备
LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗
器械厂；恒温磁力搅拌器、HWS 24型电热恒温水浴锅
上海一恒科学仪器有限公司；DC-P3型全自动测色色差
计 北京兴光测色仪器公司；Alpha 1-4 LSC型冷冻干燥
机 德国 Christ公司；微型粉碎机、VULCANTM 3-
550A马弗炉 美国 Ney公司；QTS25质构仪 美国
Brookfield公司；PowerPac Basic电泳仪 美国Bio-Rad
公司；Tanon1600 凝胶成像系统 上海天能公司；
GENESYSTM5型分光光度计 日本 Spectronic公司。
1.3 方法
1.3.1 改良DEAE纤维素法制备琼脂糖
1.3.1.1 琼胶的漂白
市售琼胶一般为微黄色，DEAE纤维素法制备琼胶
糖之前需要对琼胶进行漂白。实验采用 KMnO4-H2C2O4
漂白法处理琼胶，有文献[ 3]报道，KMnO 4漂白后琼胶
的凝胶强度会降低，因此实验以漂白后琼胶样品白度和
凝胶强度为衡量指标，选择高锰酸钾浓度、漂白 p H
值、漂白时间、草酸浓度 4因素进行 L 9(3 4)正交试验。
1.3.1.2 琼胶的乙醇处理
未经乙醇处理而制备的琼胶糖，透明度较差，因
此在制备琼胶糖之前可对琼胶进行乙醇处理，以提高其
透明度。试验以 1% 的琼胶糖溶液透明度为衡量指标，
选择料液比、乙醇体积分数和处理时间 3因素进行 L9(34)
正交试验。
1.3.1.3 DEAE纤维素吸附
称取 15.0g DEAE-52纤维素，加入 300ml去离子水
浸泡过夜，在 85℃水浴中预热，称取漂白和乙醇处理
后的琼胶 5.0g于 200ml去离子水中，加热溶解后与预热
的 DEAE-52纤维素混合，然后于 85℃条件下恒温搅拌
2 h，趁热抽滤，收集滤液、冷却、凝胶，将凝胶置
于－ 18℃条件下冷冻至完全冻结后取出，解冻脱水，然
后置于冷冻干燥机中干燥得片状琼胶糖，粉碎后过 120
目筛，即得白色琼胶糖粉末。
1.3.2 琼胶糖检测方法
1.3.2.1 白度测定
将漂白后的琼胶条干燥、粉碎、过 10 0 目筛后使
用全自动测色色差仪测定琼胶粉 L、A、B 值，然后按
公式HW=100－[(100－ L)2+A2+B2]1/2计算白度(HW)[4]。
式中：L表示明度，L=0为黑色，L=100为白色；A(+)
表示红色程度，A(－)表示绿色程度；B(+)表示黄色程
度，B (－)表示蓝色程度。
1.3.2.2 凝胶强度测定
按照文献[5]，略作改动。称取琼胶粉 1.0g(折算为
干物质后)于 100ml烧杯中，加水 100g，记录总质量(m)，
浸润 4h后，置压力锅内于 105℃保温 30min，使其溶解，
再用热水补充总质量至 m，搅拌，用保鲜膜封烧杯口，
至 20℃条件下静置 15h，在质构仪平台上用 1cm2的探头
测定其凝胶强度。
1.3.2.3 透明度测定[6]
取样品配制成1%琼胶糖溶液，将热胶液(大于95℃)
倒入比色皿中，室温放置 24h，用分光光度计在 400～
800nm间扫描，确定最大吸收波长为 700nm，在 700nm
处测定样品的透光率(T)。
1.3.2.4 灰分测定
按照参考文献[7]测定总灰分。
1.3.2.5 硫酸基测定
采用明胶 -氯化钡比浊法[8 ]。
1.3.2.6 琼胶糖结晶紫电泳[9]
分别将自制琼胶糖和Gene tech公司生产的琼胶糖配
制 1 % 的溶液，在同一块凝胶板上分别制备琼胶糖凝
胶，点样槽中注入 1%结晶紫溶液 10μl，在电泳缓冲
液(pH8.0)中以 90V恒压电泳 3h，取出测量结晶紫移动的
距离。
1.3.2.7 琼胶糖电内渗测定
参照文献[10]方法进行。
2－
2－
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1.3.2.8 基因组DNA琼胶糖凝胶电泳测定
将自制琼胶糖和GENE TECH琼胶糖配制成1%琼胶
溶液，倒胶，在点样孔中分别点入基因组DNA、100bp
DNA Ladder各 5μl、上样缓冲液各 1μl，在电泳缓冲
液(pH7.4)中以 110V恒压电泳 30min，在凝胶成像系统下
拍照分析。
2 结果与分析
2.1 琼胶KMnO4-H2C2O4法漂白正交试验
根据单因素预试验分析，分别选取 KMnO 4 浓度、
漂白 pH 值、漂白时间及 H 2C 2O 4 浓度为考察因素，各
取 3个水平，正交试验因素水平表见表 1。以琼胶白度
及凝胶强度为考察指标，选用 L 9(3 4)正交表安排试验，
结果见表 2。
水平
因素
A KMnO4浓度(%) B pH C漂白时间(min) D H2C2O4浓度(%)
1 0.05 2.0 5 0.20
2 0.10 4.0 10 0.30
3 0.15 6.0 15 0.40
表1 琼胶漂白工艺正交试验因素水平表
Table 1 Factors and levels of orthogonal test for agar bleaching
因素
试验号 A KMnO4 B C漂白 D H2C2O4 HW
凝胶强度
浓度(%) pH 时间(min) 浓度(%)
(g/cm2)
1 1(0.05) 1(2.0) 1(5) 1(0.20) 78.08 786
2 1 2(4.0) 2(10) 2(0.30) 79.27 937
3 1 3(6.0) 3(15) 3(0.40) 80.22 972
4 2(0.10) 1 2 3 78.69 868
5 2 2 3 1 81.24 1002
6 2 3 1 2 82.96 1076
7 3(0.15) 1 3 2 79.83 750
8 3 2 1 3 81.24 961
9 3 3 2 1 81.01 967
K1 79.19 78.87 80.76 80.11
HW
K2 80.96 80.58 79.66 80.69
K3 80.69 81.40 80.43 80.05
R 1.77 2.53 1.10 0.64
凝 k1 898 801 941 918
胶 k2 982 967 924 921
强 k3 893 1005 908 934
度 R 89 204 33 16
表2 琼胶漂白工艺正交试验结果
Table 2 Results of orthogonal test for agar bleaching
水平
因素
A料液比(g/ml) B乙醇体积分数(%) C处理时间(h)
1 1:30 40 2
2 1:40 60 4
3 1:50 80 6
表3 琼胶乙醇处理正交试验因素水平表
Table 3 Factors and levels orthogonal test for agar soaking in
etha nol
由表 2的极差分析可知，影响琼胶白度的因素大小
顺序为 B＞ A＞ C＞ D，以白度为指标的 4因素的最佳
组合为 A2B3C1D2。由凝胶强度指标的极差分析可知，影
响琼胶凝胶强度的因素大小顺序为 B＞ A＞ C＞D，以
凝胶强度为指标的 4因素的最佳组合为 A2B3C1D3。综合
考虑漂白后琼胶白度和琼胶的凝胶强度，琼胶的
KMnO4-H2C2O4漂白法试验的最佳工艺组合为 A2B3C1D2
(试验号 6)，即KMnO4浓度 0.10%、漂白 pH6.0、漂白
时间 5min、H2C 2O4浓度 0.30%。采用该最佳条件进行
重复实验，结果白度为 82.78、凝胶强度为 1083g/cm2，
表明在试验因素水平范围内 A2B3C 1D2为最佳组合。
2.2 琼胶乙醇处理正交试验
在单因素预试验的基础上选取料液比、乙醇体积分
数及处理时间 3个因素，各取 3个水平，以琼胶透明度
为考查指标对漂白后的琼胶作乙醇优化处理试验，正交
试验因素水平表见表 3，选取 L9(34)正交表安排试验，结
果如表 4 所示。
试验号
因素
A料液比(g/ml) B乙醇体积分数(%) C处理时间(h) D空列
透明度(%)
1 1(1:30) 1(40) 1(2) 1 36.7
2 1 2(60) 2(4) 2 39.6
3 1 3(80) 3(6) 3 48.6
4 2(1:40) 1 2 3 43.3
5 2 2 3 1 50.2
6 2 3 1 2 42.7
7 3(1:50) 1 3 2 43.1
8 3 2 1 3 43.7
9 3 3 2 1 5.1
K1 41.6 41.0 41.0
K2 45.4 44.5 42.7
K3 44.0 45.5 47.3
R 3.8 4.4 6.3
表4 琼胶乙醇处理正交试验结果
Table 4 Results of orthogonal test for agar soaking in ethanol
由表 4 正交试验结果分析可知，比较各因素的极
差，可得 RC＞ RB＞ RA，因此影响琼胶透明度的因素大
小顺序为C＞ B＞ A，琼胶乙醇处理试验的最佳工艺组
合为 A 2B 3C 3，即料液比 1:40、乙醇体积分数 80%、处
理时间 6h；在此优化条件下制备的琼胶透明度(透光率)
为 52.7%，优于正交试验中的任何组合。正交试验中试
验号 5——A2B2C3组合所得琼胶透明度为 50.2%，这与
A2B3C3组合所得结果相近，且乙醇体积分数低于 A2B3C3
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组合，因此考虑乙醇用量因素，A 2B 2C 3组合较 A 2B 3C 3
组合更经济。因此，乙醇处理时，选用 A 2B 2C 3 组合，
即料液比 1:40(g/ml)、乙醇体积分数 60%、处理时间 6h。
2.3 琼胶糖技术指标
分别测定改良DEAE-纤维素法制备的琼胶糖和BIO
WEST琼胶糖的灰分、凝胶强度、硫酸基含量、白度、
透明度、结晶紫电泳距离和电内渗，结果见表 5。
样品
灰分 凝胶强度 硫酸基
HW
透明度 结晶紫电泳
电内渗
(%) (g/cm2) 含量(%) (%) 距离(cm)
改良DEAE-纤维
素法琼胶糖
0.25 1127 0.24 92.72 62.5 7.4 0.16
BIO WEST琼胶糖 0.27 756 0.26 90.31 67.4 7.4 0.18
表5 不同琼胶糖技术指标对比
Table 5 Comparison of agarose prepared by different methods
由表 5可知，改良DEAE-纤维素法制备的琼胶糖，
其灰分、硫酸基含量、电内渗分别为 0.25%、0.24%、
0.16，均低于市售的BIO WEST琼胶糖指标(灰分 0.27%、
硫酸基含量 0.26%、电内渗 0.18)；自制琼胶糖的凝胶强
度和白度分别为 1127g/cm2和 92.72，均高于市售的 BIO
WEST琼胶糖指标(凝胶强度 756g/cm2、白度 90.31)；因
此，改良DEAE-纤维素法制备的琼胶糖，具有灰分低、
凝胶强度高、硫酸基含量低、电内渗低和白度高的优
点；自制琼胶糖透明度为 62.5%，略低于市售BIO WEST
琼胶糖指标(67.4%)；两种琼脂糖结晶紫电泳距离均为7.4cm，
因此两种琼胶糖都具有很好的电泳性能。
2.4 基因组DNA的琼胶糖凝胶电泳
分别用改良 DEAE-纤维素法提取的琼胶糖凝胶和
BIO WEST琼胶糖凝胶作为载体，进行基因组 DNA及
100bp DNA Ladder电泳实验，结果见图 1。
3 讨 论
3.1 以琼胶制备琼胶糖的关键技术，在于分离除去琼
胶中的带电基团(如硫酸基、羧基等)、提高透明度、增
加白度和凝胶强度。本实验采用KMnO4-H2C2O4法漂白
琼胶，其优点在于试剂浓度低、p H 值高、漂白时间
短，达到了漂白效果而又最大限度的保护了琼胶的凝胶
强度；采用乙醇浸泡处理，琼胶中的部分杂质可溶于乙
醇溶液，特别是色素物质等被分离除去，因此可以提
高琼胶糖的透明度，乙醇处理对琼胶透明度改善的具体
作用机理有待于进一步研究；DEAE-纤维素可以有效吸
附琼胶中的硫酸基、羧基等带电荷基团物质，从而得
到电中性的琼胶糖。本研究采用正交法优化漂白和乙醇
浸泡前处理工艺参数，DEAE纤维素吸附纯化等关键工
艺制备的生化级琼胶糖产品，其各项指标均达到或超过
市场同类产品指标。因此，改良 DEAE-纤维素法适合
生化级琼胶糖制备方法。
3.2 该方法制备琼胶糖成本的高低在于试剂回收与重复
利用。由于 DEAE-纤维素价格较高，因此为降低琼胶
糖制备成本，可对工艺中的DEAE-纤维素进行回收与再
生[11]。抽滤后的 DEAE-纤维素滤饼用热水煮溶后，于
100目滤布上反复洗滤至滤液澄清，然后用 1.5%的NaCl
溶液洗虑至白色，再分别用 0.5mol/L HCl、0.5mol/L
NaOH处理和去离子水洗涤至中性，即可重复使用；处
理琼胶后的乙醇水溶液可通过蒸馏的方法回收，乙醇水
溶液直接蒸馏收集 80℃馏分，随后加入固体氯化钠至饱
和，继续蒸馏可回收 7 0 %。
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对比图 1a、1b可见，两种琼胶糖不仅具有良好的
电泳性能，并且分离基因组DNA和 100bp DNA Ladder
的能力同样优异，达到生化实验要求。
a.改良DEAE-纤维素法制备琼胶糖电泳图；b.BIO WEST琼胶
糖电泳图；A、B、C为基因组DNA，D为 100bp DNA Ladder。
图1 基因组DNA琼胶糖凝胶电泳图
Fig.1 Pattern of genome DNA gel electrophoresis
a b
A B C D A B C D