全 文 ：第二军医大学学报 19 90 年第 n 卷第 1 期
P 物质对刀豆素 A 和美洲商陆诱导小鼠脾细胞产生 下干
扰素的调节作用
田野苹 郑玲莉 周正芳 (免疫学教研室 )
提要 本实验研究了不同浓度 ( 1 0一 ” 一 1『 ’ m fo / L ) P 物质 ( S P )在体外对刀 豆素 A ( Co n A ) 和奖洲商陆
( P WM )诱导 ,’.J 鼠脾细胞产生下干扰素 ( I F扮一 幻 的影响 . 结果显示 , 10 一 ” 一 10 “ ` m ol / L S P 对 10 脂 /m l
p W M 诱生 I F N 一 下没有影响 . 用 5 、 2 . 5 及 1 . 2 5脂 /m l C o n A 或 p WM诱生时 , 10一 , 一 10一 5 m ol / L S p 可
增高 I F N 一 下效价 , 10 “ ’ 一 10 一 , m ol / L S P 作用更明显 . 单独加 S P而不加诱生剂 , 未检测到 IF N 一 下. 先加
人 10 一 ’ 一 10 一 6 m o l / L S p 6 h 后 , 再加 C o n A 诱生的 I F N 一下效价 , 略高于 同时加入 10 一 ’ 一 10 一 6 m o l / L S p
时 C o n A 诱生的 I FN 一 , 效价 . 先加人 10一 ` m o l / L S P , I FN 一下效价并不比 同时加 10 一 , m ol / L S p 时增
高 , 反而有降低的趋势 . 在先加人 S P 时 , 10 一 “ m ol / L S P 即表现 出明显 的增高 IF N 一 下效价的作用 , 而同
时加 S P, 则在 10一 ’ m ol / L才有明显作用 .
关键词 P物质 ; 下干扰素 ; 刀豆素 ;A 奖洲商陆
P物质 ( s u b s t a n c e P , S P )是主要分布 1 . 1 . 5 病毒 水疤性 口炎病毒 ( V SV )
在脑和 胃肠道的一种神经肤 。 对于 S P 在 1 . 1 . 6 细胞培养板 2 4 孔和 9 6 孔细胞培
免疫应答中的作用 , 相继 已有许多新的发 养板均为西德和 日本产品 。
现 l[ 一 3〕。 我们对 S P能否影响下干扰素 ( I F N 一 1 . 2 方法
力的诱生进行 了研究 , 现将结果 报道如 1 . 2 . 1 小鼠脾细胞悬液制备 取 C 57 B L / 6
下 。 小鼠 , 断头放血处死 , 新洁尔灭浸泡消毒后 ,
、 : . ,一 ~ _ ~ 无菌取出小鼠脾脏 , 将脾脏压过不锈钢网 ,
1 材料与方法 岁生: 二 ` 岁“ : ;几 二 “ :厂二厂 ` , “花` ’泣丫` 一 ` 一” “ “ 一 加适量 H a n ks 液悬浮 , 经 1 00() r/ m in 离心
1
.
1 材料 10 m in , 弃上清 , 沉淀细 胞加 5 m l T r i s -
1
.
1
.
1 动物 C 57B L / 6 小鼠 , 雄性 , 6 一 8 N H ; C I缓冲液 , 静置 10 m in 溶解红细胞 , 离
周龄 , 由本校动物所提供 。 心弃上清 , 用 H an ks 液洗两次 ,最后用无血
1
.
1 2 主要试剂 S P 及刀豆素 A ( C o n A ) 清 16 40 培养基洗 1遍 , 细胞加完全 164 0 培
是美国 is g n a 公司产品 。 美洲商陆 ( P W M ) 养基悬浮 , 用 1% 台盼 蓝染色 , 活 细胞 >
是西德 B o e h r i n g e r M a n n h e im 公司产品 。 9 5% 。
1
.
1
.
3 16 40 完全培养基 R P M n 64 0 干 1 . 2 . 2 I F N 一 下的诱生 按实验设计 , 制备
粉( 日本制药株式会社产品 )加去离子双蒸 不同浓度的细胞悬液 , 加 不同量的 C o n A 、
水配成 , 含谷氨酞胺 Z m m ol / L , 丙酮酸钠 P W M 和 S P , 加人 24 孔细胞培养板中, 置
l m m o l / L
,
2 一 琉基乙醇 10 一 , m o l / L , H e 一 37 oC 、 5% C O : 孵箱中培养 72 h后 , 收集培
pe s 10 m m o l / L
, 青 、 链霉素各 10() U /m l , 养物 , 经 2 00 0 r / m i n 离心 10 m in , 收获 上
10 % 小牛血清 (本校与上海长 阳制药厂联 清 , 置 一 20 ℃冻存 , 待测效价 。
合生产 ) 。 1. 2 . 3 I F N 一 下的检测 按本室常规 4j[ 进
1
.
1
.
4 细胞系 L 92 9 鼠成纤维细胞 行 。
2 0第二军医大学学报 1 9卯 年第 n卷第 1期
2结 果
2
.
1不同细胞密度时仁。 n A与 PWM对
IF N一下的诱生作用 由于进 口 S P价格昂
贵 , 为减少 S P 的耗量 , 我们采用 24 孔细胞
培养板培养细胞 ,对 C O n A (10料g/ ml )和 PWM
( 10 群g /m l) 在不同细胞密度时诱生 I F N 一
下的作用进行比较 , 以了解在 2 4 孔培养板
上培养小鼠脾细胞 , 诱生 I F N 一下的最适条
件 。 结果见表 1 , 在 5 x l护 细胞 /m l 时 , 每
孔加细胞悬液 1 m l , 用 C o n A 或 P WM 诱
生的 I F N 一 7 效价较高 。
表 1 不同细胞密度时 C o n A 和 P WM 诱生的 下干扰素效价 *
T a b
.
1 I F N 一 7 r沂 e . i n d . 沈d b y C o n A a n d P W M i n d i fe r e n t
cl l d
e . d t y
C心 n u比 n b盯 /ml A m
O U n t of 份U
s us pe n 曰 on (ml /w e ll )
C o n A ( 1 0阳 /m l) PW M ( 10 尸g / m l )
10 x I J
s x 1)
2 s x l少
2
.
4 30 士 0
.
1 5少
2
.
7 3 1士 0
.
150
、
2
.
4 3 0 士 0 . 15守
2
.
8 8 1士 0 . 15伊
2
.
355 士 0
.
173
2
.
580 士 0
,
1 5介
2
.
90 6 士 0
.
14 1
3
.
1 3 1 士 0 . 2幻
么 98 1士 0 . 1 52
3
.
20 7 士 0 . 3 16
2
.
7 55 士 0 . 102
3
.
0 56 士 0
.
28 4
. L Og
:。 C P E I , U /m1
, 又士 S D , n = 4 ; P < 0 . 0 5: a v s . b an d d y 二 e ; P < 0 . 0 1: e ” . d
2
`
2 S P对P WM ( 10雌 / m l )诱生 I F N 习
的影响 采用上述最适培养条件 , 加 10 一 ”
一 10 一 6 m o l / L 的 S P , 对 P W M诱生 I F N 一
y 的影响进行了研究 . 结果表明 (表 2 ) , 加
与不加 S P , 以及加不同浓度 S P 之间 , P WM
( 10 雌 /m1 )诱生的 I F N 一 下效价无显著差
异 ( p > 0 . 0 5 ) 。
表 2 S P 对 P WM ( 10 科g /m l ) 诱导小
鼠脾细胞产生 下干扰紊的影响
T a b
.
2 E fc
e t o f S P o n t卜e I F N 一 下
Pr o d u e d o n i n m o ” s e s Pl e e n
e e l l s s t im u l a t e d w i ht P W M
( 1 0拜g /m l )
C o n c n tr a it o n of
`
S P ( m o l / L )
I F N 一 , it吮 (助 9 0 C P E I,
U /m L又士 SD , n = 3 )
0
1 0
一工,
10
一 ,o
10
一 ,
10一
10
一 ,
10
一 `
3
.
24() 士 0
.
154
3
.
172 士 0 . 254
3
.
172 士 0
.
0 58
3
.
207 士 0 . 174
3
.
2月0 生 0 . 230
3
.
308 士 0 . 174
3
.
27 2 士 0
.
1 18
2
.
3 S P 对不同浓度 P WM 诱生 I F N 一 下
的影响 出现表 2 中所示结果 , 可能是由于
S P 的作用在 10 咫 / m l P WM 诱生较高效
价 I F N 一下时 未能表现 出来 , 我们进一步
降低 P WM 浓度 , 观察了 S P 义J其谈注 I F N -
下的影响 。 由表 3 可见 , 阵着 S P 的浓度增
高 , 5 、 2 . 5 及 1 . 2 5拼g / m l P WM 诱生 的
IF N 一下效价也相应增高 , 10 ’ 7 一 10一 ’ m ol /
L SP 作用更明显 。 但不加 P WM , 单独加
不 同浓度 SP , 未检测到 I F N 一 下效价 。
2
.
4 S P 对不同浓度 C o n A 诱生 I F N 一 下
的影响 结果见表 4 。 5 、 2 . 5及 1 . 2 5咫 /m l
C o n A 诱生的 I F N 一 下效价也随 S P浓度增
高而增高 , 10 一 , 一 10 一 ’ m of / L S P有显著作
用 。
2
.
5 同时加 S P 与先加 S P 对 C o n A 诱生
IF N 一下效价的 比较 将不同浓度 S P先加
人细胞悬液 中 , 置 37 ℃ 、 5% C O : 中孵育
6 h
, 再加人 C o n A 继续培养 , 72 h 后收获上
清 , 检测 I F N 一下效价 。 在 5 、 2 . 5及 1 . 2 5
第二军医大学学报 1909 年第 U 卷第 l 期
脂 / m l C o n A诱生情况下 , 先加 10一 9一 10 一 6
m ol / L S P
, 比同时加 S P 的 IF N 一下效价略
高 , 但统计学处理无显著性差异(尸 > 0 . 0 5 )o
先加 or 一 ’ m ol / L S P , I F N 一 y 效价并不 比
同时加 10 “ m of / L S P 时 增高 , 而是趋于
下降 。 在先加人 S P时 , 10 一 , m o l / L S P即表
现出明显的增高 I F N 一 y效价的作用 ,而同
时加 S P , 则在 10 一 ? m of / L 才有明显作用 。
先加 S P 而无 C o n A 的培养上清中 , 未检测
到 I F N 一 下效价 。
表 3 S P 对不同浓度 P W M 诱导小鼠脾细胞产生 下干扰索 * 的影响
T a b
,
3 I n f l u e n “ o f S p o n th e i F N 一 下* P r o d . e it o n in m o u s e sP le既 “ 115
. t im u l a t e d w i t h 山价 r e . t co n ce n t ar d o . o f P WM
C o n c n t r硒 o n of
SP (m
o l / L )
P W M (雌/m l)
5 2 5 1
.
2 5
2
.
704 士 0
.
1 18
2
.
8 5 5 士 0 . 0 5万
3
. 的5 士 0 . 2 17
3
.
0 8() 士 0
.
1 88
、
3
.
2 3 1士 0
.
188
.
3
.
2 55 士 0 17 3 .
2
.
55 4 士 0
.
2 10
2
.
7 7 9 士 0 . 127
2
.
9 30 士 0
.
188
c
3
.
X() 5士 0
.
183
b
3
,
156 士 0
.
05 5
t
3
.
180 七 0
.
04 少
2
.
4 78 士 0 239
2 629 士 0
.
12 7
2
.
7 80 士 0 . 127
2
.
9 30 王.0 12夕
3
.
0 80 士 0 . 126 .
3
.
1 31 士 0 04 8 .
-9J刁`j10
*
L o g
:。
C P E I
二 U /m l , 又士 S D , n = 4 ; a p < 0
.
0 1
,
b p < 0
.
0 2
, e p < 0
.
0 5
com
p a r曰 iwt h co n tr o l
表 4 S P 对不同浓度 C o n A 诱导小鼠脾细胞产生 下干扰康 . 的影响
T a b
.
4 I n f l u e n e e o f S P o n t h e I F N 一 , * p r o d u e ti o n i n m o u s e o p l ce n e cl l s
s d m u l a t de w i t h d i f e r . t e o n e e n t ar t i砚 o f C o n A
C o n c
n t r a t io n of
S P (m ol / L )
C on A (解 g /m l )
5 2 5 1
.
2 5
2
.
529 士 0
.
0 50
2 4 5 4士 0 10 3
2
.
6() 5士 0 14 1
2
.
68 0 士 0
.
20 6
2
.
830士 0
.
050
t
2
.
90 6土 0
.
14 2
.
2
.
30 4士 0 14 2
2
.
3 79 士 0
.
20 5
2
.
4 7 8士 0 188
2
, 印5 士 0 . 19 ”
2
.
7 5 5 士 0 . 173 .
2
.
8 55 士 0
.
05 5
.
2
.
153 士 0
.
10 1
2
.
2 28 士 0 . 050
2
.
3 2 8 士 0 . 12 6
2
.
530 士 0
.
0 50
.
2
.
680 士 0 . 151.
2
.
779 士 0 . 127 .
9.臼,廿`甘皿」一.ùnù0ǎ1ù几`
ó .`L. .1目1几l
*
L o g
。
C P E I * U /m l
, 又士 S D , n = 4 ; a P < 0 . 0 1, b p < 0 . 0 5 co m p a r de w i th c o n tr o l
3 讨 论
本实验研究了 SP 在丝裂原诱导小 鼠
脾细胞产生 IF N 一 下中的调节作用 。 结果
表明 , S P 是在低浓度诱生剂诱生低效价 1F N
一 y 时 , 才表现出增高 IF N 一 下效价的作用 ,
并呈现剂量依赖性 , 10 一七 or 一 , m of / L S P
作用显著 。 单独加 S P 而不加诱生剂 , 细胞
培养 72 h 和 78 h 收集的上清中 , 都未检测
到 I F N 一 下, 表明 S P 并不直接诱导细胞产
生 I F N 一 丫。 虽然有报道称 , S P 本身就可刺
激 T 细胞增殖 , 并促使 D N A 、 RN A 的合
成阁 , 但 S P 未必直接对 I F N 一 下基因的起
动 , 进而产生 1F N 一下有作用 。 另有人报道 ,
S P 能促进肥大细胞释放过敏递质 , 它对免
疫应答的调节作用与细胞内磷脂代谢有关凡
所以 , S P 能增高 IF N 一下效价 , 可能是 由于
促使细胞释放 1F N 一 下, 或促进丝裂原诱导
I F N 一 下产生 。
用 5 、 2 . 5 及 1. 2 5月只 /m l C o n A 诱生
第二军医大学学报 1 90 9年第 1卷第 1期
F IN一 , 时乃动口10一 ’ 一 10一 6 m o l / L S P , 与
同时加人 10一 9一 10一 6 m o l / L S p 比较 I F N 一
下效价略有增高 , 但统计学上无意义 。 值得
注意的是 , 先加人 10 一 , m o l /L S P , I F N 悦 ,
效价并不 比同时加 10 一 s m ol / L S P 时增高 ,
反而有降低趋势 , 这提示先加人高浓度 SP
时 , 可能有抑制产生 I F N 一下的作用 。 同时
我们也观察到 , 先加人 SP 时 , 10 一吕m of / L
即开始出现明显的增高 I F N 一 下效价作用 ,
而同时加 S P 则在 10 一 m ol / L 时才出现 明
显作用 。 我们假设这与 T 细胞表面的 S P 受
体同 S P 结合的数量有关 。 C o n A 与 S P 同
时加人 , 在结合 T 细胞表面各 自的受体过
程中 , 可能存在空间位置的竞争或干扰 。 如
先加 S P , 让其充分结合于受体 , 预先使细
胞内准备好释放通道 , 再加人 C o n A 诱生
时 , 产生 IF N 一下并及时 、 顺利释放 。 所以
在较低浓度 ( 10 一 s m ol / L ) S P 时 就开始有
显著促进作用 。 先加人高浓度 ( 10 一 5m of / L )
S P 时 , S P 结合细胞表面受体多 , 细胞膜结
构改变明显 , 影响 C o n A 再结合于表面受
俐阳 , 阻碍了 C o n A 的诱导作用 , 而使 I FN 一
下效价出现下降趋势 。
实验中我们应用 C o n A 与 P WM 作为
诱生剂 , C o n A 只刺激 T 细胞 , 诱生出 I F N
一 下, P WM 对 T 细胞和 B 细胞都有刺激
作用 , 但经鉴定 , 细胞加 P WM 培养 3 d 所
诱生的也是 I F N 一下闭 。 E sP et in 曾报道 , 采
用荧光激活细胞分类器 ( F A C S ) , 将 T 、 B
细胞分开 , 并在巨噬细胞存在的条件下分
别研究 T 、 B 细胞对 P H A 和 P WM 的反
应 。 B 细胞在 P WM 刺激的第 3 d , 并不发
生 增殖和产生干扰素 ; 如 有巨噬细胞存在
的条件下 , 可于第 5 一 7 d 才出现增殖和干
扰素反应 。 我们在加人 P WM 72 d 后 , 便
收获培养上清 , 因此该上清中的 I F N 是 T
细胞所产生的 I F N 一 下。
IF N 一 下不仅具有抗病毒活性 , 还有多
种免疫调节功能 , 此外能抑制细胞生长和
抗肿瘤 , S P 对 I F N 一 下的产生具有调 节作
用 , 无疑它在神经内分泌免疫调节网络中 ,
是一种值得研究和重视的神经肤 。 比如 , 在
体内是否出现高浓度 S P 的抑制作用 , 如出
现 , 是在何种条件下发生? 这与某些疾病
状态下 , 生理功能紊乱又有什么联系 ? S P
影响细胞产生 I F N 一 7 的过程中 , 细胞 内
c A M P 及其他相关成分的代谢怎样变化?
这些问题将有待于进一步研究 。
参 考 文 献
1
.
S at in 女 A M , 。 t a l . D ileT er n it al e月忱 st o f v aso 即 it v e
in et ist n al p
e p idt
e , s u
b
s t a n ce P a n d os m at
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im m u n o g lo b u 五n s yn ht e苗5 a n d P r o il fe ar iot n b y l犯 11 -
Ph o e二八es ofr m P ey e r ’ 5 Pat e h es , m es e n 怡 ir e lym Ph
n o d
e s a n d s P le n
.
J Im m u n o l 19 8 6 ; 13 6 : 1 52
.
2
.
S tan isz A M
, e t a l
.
D is itr b u it
o n o
f n
e u or P e P it d e er ce
-
P t o sr o n m u ir n e ly m Ph o e yt e s
.
1
.
S u b s at n沈 P r以无 -
P to sr o n s P le n an d P
e y e r
’ 5 P a ct h T a
n d B c lls
.
J
Im m u n o l 19 8叉 13 9 : 74 9 .
3
.
B
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s
at
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T h e id 此 r e n it al e 压戈 t w i ht it m e
o f n e
u r o pe P t id e s o n ht
e P r ol ifc r a it ve esr P o
n
se s o f
m u ir n e P e y e r
’
5 p a thc an d sP le n i o lyln
Ph
o c yt e s
.
B r aj n
B e hva Im m u
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0
’
D
o n s io M S N
e u
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e m od u l
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imm u n e r e sP
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.
V i
r o lo gy 19 7 4 ; 5 9
: 4 0
.
198 9 年 7 月 4 日收稿 , 1 98 9年 12 月 8 日修回 )
。 .
90
· 第二军医大学学报 1侧臾】声第 1 巷第 l期
R雌笋 h幼枕 A e t i叨 of Su b 血口 ec P no In t州er o。 一下 P rt过Cu t lno 加 M心姗 S p el 目
〔笼 lb l砚Cu 曰 勿 C a侧 , 团 aI 粗 il n A a dn oP 址解“ 刃呱 t o g即
了功” 介 p认乐 et 以 (刀即峨脚咐 of l。 娜 ot 砂 )
T七 e i n fl鹅 n c s of id fe r e n t
con
t r a石 o sn ( 10一 ” 一 10一 ’枷 l / L ) o f s u b s ant c p ( S p ) o n ht e i n et fer r o n
一 , ( INF
一 下) podr 切 it o n i n mO CUS s IPeC n cu s i n d U` 思 d by c o n anC 直val in A ( oC n入 ) an d 即 k e w e d
。
而 t o罗 n ( p WM ) 加 “ 加 cw er st叻喊 hT e rCS ul st s h o w de t h at n o i n fl此 n ce o f 10一 ” 一 10一 ` m O I / L S p
o n t h e it cr of I F N 一下 idn u以泛 勿 P节月以 ( 10鸿 /lnI ) w as o b s e ver 氏 t h e it tr e s o f I FN 一 下 i n d u以沮 b y
C冶 n A o r p WM ( 5, 2 5 an d 1
.
2 5 ” g / ml ) we er e n h an c ed by 10
一 9一 10 一 ’ m o l / L S ;P t h i s e n h an ce me n t
was mo
二 目p 访can t at 10
一 7一 10 一 , mo l / L S p
.
NO it etr of I F N
一下
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d e et e et d i n t h e p r e se n ce o f S p
al o n e
.
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e it t茂 5 of I F N 一 下 in d川况d by oC nA ad d de at 6 h a ft e r ad id n g 10
一 9 ~ 10
一 6
onz l / L S p w
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正gh ltr ih gh e r ht an ht at in d u此 d by oC nA an d 10 一 , ~ 10 ’ ` om l/ L S P ad d de is m lu t a n e o slu y
.
Th e it er
of I FN 一下 i n d娜de b y oC n A an d 10一 , om l / L S p ad ds d in ad van 沈 et n de d t o er d cu it o n r a het r ht an
en h an cer
n t as e o m P助 de 初 t h ht at i n d u eC d 妙 oC n A an d 10 一 , 找幻】/ L ad de d s i m ul ant e o u目y
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