全 文 ：植物生理学报 , 1 9 92 , 18 ( 2 ) ; 2 13一 2 16 2 1 3
研究简报
干旱影响露花叶片PE P梭化酶蛋白合成的同位素证据
王岳浩 陈景治 施教耐 吴敏贤
(中国科学院上海植物生理研究所 , 上海 2 0 0 0 3 2)
关健词 : 露花 , 磷酸烯醇式丙酮酸玫化酶 ,千旱 ,
C A M诱导 , 重新合成
环境因素对植物的影响一直是植物生
理学研究的重要内容 。 一般认为 , 与具有
运动能力的动物相 比 , 植物对环境的适应
显得被动 , 但实际 上这种适应具多种多样
的形式与内容 。 露花对干早环境的适应就
有 , 一定的独特性 。 露花是一种兼性C A M植
物 ,在正常水分条件下 , 呈 C: 植物光合特
征 ; 在干旱条件下呈现 C A M特征 (张维经
等 19 8 7 ) 。 P E P浚化酶是 C A M途径的关键
酶 ( O s m o dn 19 7 5 ) , 我们 ( 1 9 9 1 ) 曾在露花
C A M 途径诱导过程中观察到 P E P梭化酶
活性水平与其蛋 白量的同步提高 。 本文报
告利用 L一 〔舫 S } 蛋氨酸掺 入 法 研究干早
对露花叶片 P E P 梭化酶蛋白合成的影响 。
材 料 与 方 法
露花 (弄儿“ m b少an ht em u m co 诫 fo ilu m ) 种子经
5%漂白粉浸洗消毒后 , 播于蛙石 、 石英砂 混 合
物中 , 置温室中萌发 , 待幼苗长出 4 片新叶后 ,
移栽至塑料花盆中 ,一般每盆 2~ 4 株 。 供试验用
的成熟植株在试验前一周移至人工气候室中 (光
强 3 0 月mo l m 一“ s一 1 , 相对湿 度 70 % , 光 /暗
为 12 h八 Zh , 温度 2 o5 C ) . 干旱处理采用自然干
旱 , 即不浇水 , 对照植株每天浇水足量 。
蛋白质含且测定 按 B ar d f or d ( 1 9 76) 的方法 .
s D S 聚丙烯添胺凝胶电泳 依 L K B 产品使用说
明书。 采用 10 %聚丙烯酞胺凝胶。
电泳胶染色 银染 (M e r r i、等 1 9 8 1 ) 。
蛋白免班印演法 (we st er ” 五m ~ n 。从ot ) 参照 T o w b i n 等 ( 1 9 7 9 )和 Y a g a w a 等 ( 1 95’ 7 ) 的方
法 , 略作修改 .
L
一严 s 〕一蛋盆吸推入法 从对照和干旱处理的露
花植株上各采数片中部成熟叶片 , 在相应部位制
备叶圆片 , 将此浸 于 含 50 料 iO / m l 的 L 一 〔a ` s 〕-
蛋氨酸 (国产 , 10 7 0 C i / m m o l ) 的溶液 ( T r ; s -
H C I 5 0m mo l / L
,
P H 7
.
5 ) 中 。 真空 渗 入 s m i n
后 , 加 N a H C O : 至最终 浓 度 2 5 m m o l / L 。 叶
圆片与 L 一户5 5〕一蛋氨酸于 2 5 O C , 光 照 ( 2 00 W 7
m
Z , 距离约 4 0 c m )下保温 1 . s h 。 保 温 后 , 用
重蒸水冲洗叶圃片 , 吸干后 各 取 1 9 样 品 , 加
1
.
5 m l提取缓冲 液 ( T r i卜 H c l 1 00 m n。 一/ L , .
p H 8
.
0
,
E D T A Im mo l/ L
, 琉基乙醇 15 m mo ]/
L
,
1 0 % ( v /
v )甘油 , 1% ( w / v ) P V P ( s o l u b l e ) ,
P M s F 0
.
5 m m
o
l / L
,
L 一蛋氨酸 10 m m o l / L )畏卜
匀浆器中匀浆 , 10 0 00 r / im i 、 离心 2 m i n ,取上
清液供分析 。 提取过程在O~ 40 0 下进行 。 上清液
的一部分与 s D S 样品溶解液混和 , 经煮沸 5 而 n
后供 S D S电泳分析 ;另取少量按 M a n s 和 N o v e l li
( 19 6 1 )的方法在滤纸小圆片上点样 , 用于同位素
液闪计数 , 其余部分供免疫沉淀分析 .
P E P 按化醉的免疫 沉 淀 称 取 若 干 lP · ot ie n
A
一
s
e p h
a r o s e C I
一
4 B 半干胶 , 于缓 冲 液 〔B u -
f f e
r A : T r i s一 H C I 50 m mo l 了L
,
P H 7
.
5
,
N a C I 0
.
1 5 m
o
l / L
,
L
一蛋 氨 酸 1 0 m m o l / L ,
0
.
2% ( v /
v ) T w
e e n 20〕 中溶胀。 取 2 5 解 l 溶
胀的胶加至 6 0 川 提取上清 浓 中 , 室 温保 温
3 Oim
n , 然后离心 10 5 , 取上清液 。 在上清液中
加入露花叶片 P E P 梭化酶抗体 , 置 25 OC保 温 。
l h 后加 2 5 召 l 溶胀 的 P r o t e i n A 一 S e p h a r o s e
C I一 4 B 置 2 5 · C保温 ,偶尔轻摇 ; 30 m i n 后 , 1 0 0 0 (]
r / m in 离心 1 0 5 , 去上清液 , 用 B u f f e r A 洗沉
1 9 9 1一 0 5一 27收到 , 19 9 1一 10一 17接受 。
2 1 4植 物 生 理 学 报 1 8卷
淀 5次 ,再用 T r i s一 H C I 1 0 m m o l / L ( P H 7 . 5 )洗
沉淀 3 次 , 最后加 S D S 样品溶解液至沉淀中 , 经
煮沸 5 m i n 后供 SD s 电泳分析 .
放射自显影 电泳胶经固定液 (30 % 乙醇一 10 %醋
酸 )固定后按 B o n n e r 和 L a s k e y ( 2 9 74 ) 的方法用
P P O 处理 。具体步骤 : 电泳胶先用二甲亚枫脱水 ,
3 x 3 o m in
, 每次用 20 倍体积的二甲亚矾 ; 接着
在 4 倍体积的 20 % ( w / v ) P P O (二甲亚讽配成 )中
保温 ; 3 h 后 , 用无离子水浸洗 , 直至胶质变成
乳白不透明 ; 以后 , 经 15 %甘油处理 3 0 m in 后
于 70 ℃真空抽干 。 抽干的胶与 X 光片用增感屏夹
住置暗盒中一 7 o0 C放射自显影二周 .
结 果 与 讨 论
用 S D S 电泳分析露花叶片提 取 液 ,
发现干旱处理后 n s k D 的蛋白带明 显 增
多 , 此分子量值与我们 ( 1 9 9 0) 纯化后测得
的露花叶片主导性 P E P 狡化酶同功 酶 的
分子量值相同 ( 图 1 ) . 将 S D S 电 泳 胶中
的蛋白电泳转移到硝酸纤维素膜 上 进 行
蛋自免疫 印 渍 ( w e s七e r n i m m u n o b l o t ) ,
看到 1 15 k D蛋白带被专一性地着色 , 并发
现干早样品的着色程度明显高于对照样品
的 ( 图 1) , 这表明干早处理之后 , P E P 狡
化酶蛋白量有明显增多 。 这个结果与我们
( 1 9 9 1) 在分析干早过程中露花叶片 P E P狡
化酶活性水平与其蛋白量变化规律时所得
到的结果一致 , 也与前人在研究盐胁迫对
冰也日中花 ( Me se m b yr a n ht e m u m c理 s ta l i -。 m) c A M 途径诱导时所得到 的 结 果 相
似 ( F o s t e r 等 1 0 52 , H o fn e r 等 1 9 8 7 ,
H
o lut m 和 W i nt e r 1 9 5 2 ) 。 在干早处理后
这些增加的 P E P 梭化酶蛋白究竟是 不 是
重新合成的 ? 我们 ( 19 9 1) 的火 箭 免 疫 电
泳和图 i 显示的s D s 电泳 及 w e s t e r n i m -
m u n
o b 1Ot 结果排除了干旱后增加 的 P E P
梭化酶蛋白来自无活性前体的可能性 。 我
们进一步用同位素标记技术分析了活体内
露花叶片P E P狡化酶的合成情况 , 将露花
叶片小圆片与含 L 一〔“怕 } 蛋氨酸 的 溶 液
在光照下短时间保温 , 经提取 、免疫沉淀 、
S D S 电泳和放射自显影 , 观察到 X 光片中
千早处理样品的 F E P 拨化酶蛋 白带 ( 1 15
k D ) 曝光量比对照的明显增大 , P E P 狡化
酶的 ”唱 标记强度在干早后有明显提高 (图
2 )
。 此结果说明干早诱导露花叶片 P E P狡
化酶蛋 白量的增加是由于它促进了酶蛋白
的重新合成。 由于免疫沉淀 时 , 被 ”唱 标
记的 P E P梭化酶蛋白与原来存在的未被标
记的 P E P 淡化酶蛋 白竞争与 r E P 梭化酶
抗体的结合 , 所以实际上免疫沉淀测得的
P E P梭化酶标记强度可能低于实际被标记
的强度 , 这种情况对干早样品可能比对照
的更严重 。
环境因素引起植物基 因表达模式的变
图 1 露花叶片蛋白的电泳分析
iF g
.
1 E l e e t r o p h o r e s is o f p or t e i n s fr o m th e Ie a ve s
。 f 」工 co 嘴晌111沼m
L a n e l
,
M W m
a r k e sr ; la n es 2 an d 4
,
ex t
r a e t de
fr o m t h e Ie a ve
s o f we ll w
a t e r e d P la n t s : Ia n e s
3 a n d s
, e x t ar e t e d for m th
e Ie a ve s o f P la n t s
u
wn
a t e r e d fo
r 1 8 d
.
L a n e s 1 t o 3
, s il ve
r s t a i n
-
e d ; l幼e s 4 a n d s , P E R e a r b o x y la s e d e t e e t e d
by wes
t e r n im m u n o b lo t
.
M id d l
e m a t u er le a ve
s
we
r e s a m P l e d
.
E q u a l q u an
t i t ies ( 1 0 0拜g ) o f p r o -
t e i n s we
r e a P p l ie d t o la n e s 2 a n d 3 ; 18 0” 9 p r o t e in s
we er
a PP l ied
t o la n e s 4 a n d s
, r e s
eP
c t iv e丘y .
干旱影响露花叶片 P P E梭化酶蛋白合成的同位素证据2 1弓
, . . . . 月 . . . , . , ~一一一 ~一 - -一- . . . . . , , , . . 尸, , . . . . . . . . , . , . . 曰 . . , , ~一~ ~~ , ~~ 一一 . ~ ~ . .今 考 文 献
— P E P C a s e
L 一〔” S〕一蛋氨酸渗入法分析干旱对艰花叶
沙 、
片 P E P 狡化酶蛋白合成的影响
目9 . Z T 五e i n if u e n e e o f d r o u g h t o n th e s y n t h e s is
o
f P E -P
e a r b o x y l o e P r o t e i n i n t h e l e a v e s o f 人么
c0 喊户2扭勿 by in e o印 o r a t io n o f -L [3 5 S J一me t h io n i n e
L
a n e s 1 a n d Z
,
n u
o r o g r a m s h o w in g t h e d is t r i b u t i o n
o f la be l in th
e P o l ya
e r y l a m id e g e l
.
Vo l
t l
m
e s o f
e r u d e e x t r a e t a p li
e d o n th e g e l we
r e e q u iva l
e n t t o
4 4 0 0 0 cP m
.
L a n e s 3 a n d 4
,
P E -P e a r b o x y l a s e d e
·
t e e t e d i n t缺 e x t ar e t s b y i 口 u刀 u n o P er e iP i t a t io n .
S
a 几甲l es a P li e d o n we r e . ` . d e fr o m t h e e r u d e
e x t r a e t co r
e s
OP
n d in g t o 4 4 0 0 0 e P m
.
T 】l e l o e a ·
t fo n o f P E -P e a r bo xyl
a s e 15 i n d ie a t e d
.
1
,
3
: 竹 e le a v e s o f we l l wa t e r P la n t s ; 2 , 4 : T h e
l e a v e s o f P lan t
s u n w a t e r e d fo r 1 8 d
.
化已有不少报告 ( S a e h s等 1 9 5 6 ) 。 在C 。
植物黄化苗转绿过程中 , 伴随光合器官的
形态建成 , 一些与光合作用有关的 酶 (包
括 P E P狡化酶 )与蛋白同时被诱导合成 (吴
敏贤等 19 82) 。 现在已清楚这些酶 和 蛋
白的合成都与光诱导的基因表达相关 (oT -
b i n和 S ivle r tho r en 1 0 5 5 ) 。 盐胁迫诱导 M
·
` 。心 at iln um 叶片 P E P梭化酶蛋白的重新合
成也涉及此酶基因表达的调节 ( O st e mr 等
10 5 7 , S比垃 it 等 1 0 5 5 , Ve r n o n 等 1 0 5 5 ) 。
干早诱导露花叶片 P E P赦化酶蛋白的重新
合成是否涉及此酶基因转录水平的调节有
待进一步研究。
王岳浩 、 陈景治 、 施教耐 。 露花叶 片 P E P 狡 化酶
的纯化及某些 分 子 特 性 。 植 物生 理 学 报
1 9 9 0
,
16 : 3 8 0一 3 8 6
王岳浩 、 陈景治 、 施教耐 。 千旱过程中露花叶 片
P E P C Z se 酶蛋白量的变化 。 植物生理学报 19 91 ,
1 7
: 2 0 2一 2 1 3
昊敏贤 、 查静娟 、 汤小仪 、 施教耐 。 植物磷酸烯醇
式丙酮酸梭化酶的研 究压 . C ` 植 物 P E P 狡 化
酶的光诱导形成。 植物生 理 学 报 19 82 , :8
1 0 1一 1 10
张维经 、 尉亚辉 、 毛票渊 。 水分胁迫下露花光 合型
的转变 。 植物生理学报 z , 5 7 , 13 : 2 17一2 0
B o n n e r WM, L
a s k e y R A
.
A if l m d e t e e t i o n me
th o d
fo
r t r i t i u m l a b e l l e d P r o t e i n s a n d n u e l e i e a e i d s
i n P o l ay
e砰 l a m id e g e l s . uE r 了 B 1’ 0司铸m 1 9 7 4 -
弓6: 8 3一 8 8
B r a d fo dr MM
.
A r a P id a n d
s e n s i t i ve m
e th o d fo r
the q
u a n t i t a t i o n o f m i e r o g r a m q au
n ti t i t e s o f
Por t e i n u t i li z i n g th e p r i n o i p le o f P r o t e i n d y e
b i dn i
n g
.
A n a l B动。 h e仇 19 7 6, 7 2 : 2 4 8 we 2 5 4
OF
s t e r J G
,
E d aw
r d s G E
,
W i
n t e r K
.
C h a n g e s i n
l
e
ve l
s o f p h o印 11 o e n o lp y r vau t
o c a r b o抑 l a se
w i t h in d u e t io n o f e r a s s u la e e a n a e id m e t a b lis m
i n 几介` em石妙 a n th e拼 ,尤m `少 s t a l l汇” “仇 L . P坛” 公 eC ll
尸通, 5 10 1 19 8 2, 2 3 : 5 8 5一 5 9 4
H o fo e r R
.
L u z V M
,
iW
n t e r K
.
B o l i n e r t HJ
S e h m i t t J M
.
I n d u e t io n o f e r a s s u la e e a n a e id
net
t a b li sm i n Me
se 二6砂a n th e。 。二 c砂 s t a l五n 。 。 by
址 g h s a li n i t y : am s s i n e r e as e a n d de n 0 0 0 s y n th e
·
515 o f P E P
· e a r
b
o x
yl
a s e
. 尸勿 , t hjP s io l 19 8 7
,
8 3 :
9 15一 9 1 9
H o l tU区n JA M
,
W i
n t e r K
.
cA t i
v i ty o f e n z y m e s o f
e a r
b
o n
me
t a b o li s m d u r i n g th e i n d u e t i o n o f
e r a s s u l a c e a n a e id
me
t a b o l认m i n 入` “ m吞卿n ·
以比功 u加 勺 J勿 iln um . 月如自 198 2 , 15 : 8一16
M
a讹 幻 , NO ve l l i G O · M e a s u r e砒 n t o f t h e in co r -
op
r a t io n o f r a d io a e t i v e a m in o a e id s i n t o P r o
·
t e i n b y a if l t
e r P a P e r d i
s k m
e th o d
.
A hcr B io
-
c
he m B 1’oP 妙` 19 6 1 ,男 : 牛8一 53
M七r r i 贬C R , G o l g m a n D , S e d atn
n S A
,
E b e r t M H
.
U l t r a s e n s i t ive
s t a i n fo r p r o t e i n s in 训 lya e r yl a -
m id e g e ls s h o ws
r e g io n a l v a r ia t i o n i n c e r e
·
b or s P i n a l fr u id P r o t e in s
.
& 介n “ 1 9 8 1, 2 1 1 :
14 3 7一 14 3 8
o
s m o n d C B
.
Cr as
su la e e a n a e i d m e t a b o l i s m : A
e u r i o s i t y i n e o n t e x t
.
A n n eR
。 尸抽刀 t p勺5 10 1
19 7 8
,
2 9 : 3 7 9 es 4 I 4
Os t
r e m J A
,
o l se n SW, S
e
h m i t t JM
,
B o h n e r H J
.
S欲 t s t此5 i n e er a s e s th e le ve l o f t r a n s l a t a b le
功 R N A fo r p hO SP ho e n o l Pv r u va t e c a r b o x y la掀
21 6 植 物 生 理 学 报 1 8卷
in e M
s己。 :占争a , , lh o n , u m c塑 at l l动。 m p la n t p句5 10 1
19 8 7
,
8 4 : 1 2 70一 12 7 5
S a e h s M M
,
D a v i d T H
.
A IL e r a t io n o f g e n e e xP
r e s ·
s i o n d u r in g e n v i r o n m e n t a l s t r e s s in P la n t s
.
A n n eR
o P la n r P花, J动 1 1 9 8 6 , 3 7 : 3 6 3一 3 7 6
S e h m i t t J M
,
M i
e h . l
o
o k i C B
,
OB b
n e r t l勺 . G e n e
e x P r e s s io n u n d e r s a l t s t r e s s i n 月公 se m b卿 n lh e m -
以m : e D N A l i b r a r y a n d in e r e a义 d Ie ve l s o f
m R N A or r p加 s p h e e n o l p v r u v a t e e a r b o x y la s e
a n d yP
r
vu
a t e o r t
ho P l
l o s
hP
a t e d i k in Z s e
.
P h。 -
ot 岁 n ht R 心5 19 8 8 , 1 7 : 1 5 9一 17 1
oT b i
n E M
,
S i lv e r th o r n e J
.
L ig h t r e g u l a t io n o f
g e n e e x p r e s s i o n in h ig h e r p l a n t s
.
A n n eR
刀
P la n t 咫 , J io l 19 8 5 , 3 6 : 5 6 9一5 9 3
oT w b i
n H
,
S t ae he li
i ` T , G o t do
n
J
.
E l e c t r o Pho er t i
c
t r a n s fe r o f p r o t e i n s fr o m P o ly a o r y l a m i d e
g e l s t o n i t r o c e l l u lo s e s l
l e e t s : P r o e e d u r e a n d
s o
m
e a
P l i
e a t io n s
. 乃刁` Na t l A ca d sc i L叹A
19 7 9
,
7 6 : 4 3 5 0一4 3 5 4
Ve
r n o n D M
,
O s t r e m J A
,
S e h m i t t J M
,
B o h n e r t
HJ
.
P E PC a s e t r a n s e r iP t l
e v e l s i n 几介 s巴m石价
a 刀 ht e m u m c少 J ta l 认u m d e e l in e r a p id ly u p o n
r e li e f fr o m s a l t s t r e s s
. 尸Zd n t P 勺`初1 19 8 8 , 86 :
1 0CZ一 10 0 4
aY g
a
aw Y
,
M
t l t o S
,
M iv
a e h i 5
.
C a r b o n ie a n h y
-
d r a s e o f a u n ice l l u l a r er d a l g a oP 动勺r id u m
c r “ e n t u m R一 1 . 1 . D i s t r i b u t io n a n d r o l e in
p h o t o s y n t h e s i s
. 尸 a n t eC l p勺: 勿 1 19 8 7 , 2 8 :
1 5 0 9一 15 16
A cat P勿 了妒勿 s ,’o心’ca S动叙
1 9 9 2
,
1 8 ( 2 )
:
2 13一 2 16
玩且u e n c e o f D r o u沙 t 0 0 t h e S y毗 h e 滋5 o f P E R e a r b o x yl a s e
P r ot e i 。 恤 t址 L e a v e s o f 入度e se m byr a o t h , 。 m co dr 如吞云脚
W AN G Y
u e
一
H a o
,
C H EN J i。
一
Z h i
,
S H I J i
a o 一N a i a n d W U M i
n 一
X i
a n
(hS
a n动 a i nI s t i l u te of P la n t P勺J io l` 幻 , A c a de m ia S介之i o a , Sh a n g h a i 2 0 0 03 2 )
A l’t e r d r o u g h t t r e a tm e n t , m a r -
k e d i
n ￡ r e a s e i n q u a n t i t y o f P E P -
c a r b o Xy l
a s e P r o t e i n i n t h e l e va
e s o f
M
.
co r成fo il u m , a n i n d u e i b l e C A M
P l a n ` , w a s s h o w n b y SD S 一 PA G E a n d
w e s t e r n im m
u l , o b l o t (F ig
.
l )
.
F u r
·
t h e r i n v e s t i g a t i o n
.
w i t h i n e o r P o r a t i o n
o f L
一
sL
石S J二 e t h i o n i n e i n t o l e a f d i s c s
a n d i m m u n o P r e c iP i t a t i o n r e v e a l e d
t h a t de n 0 00 s y n t h e s i s o f P E P
一 e a r b o xy
-
l a s e P r o t e i n w a s r e s Po n s i b l e fo r t h i s
i n c r e a s e ( F ig
.
2 )
.
K e y w o r d s : 3公“ m b卿 n ht e m u m c o犷峨fo il u从 , P h o s ·
P I, o e n o l p y r u v a t e c a r bo xy l
a s e , d or u g h t
,
in d u e i b le
C八M , 公 n o即 s y n t h e s远