全 文 ：鉴别
R P D A技术在中药贝母类研究中的应用
中国药科大学 (南京 21 0 38) 卞云云 李 萍
南京师范大学 (南京 21 0 97 ) 高志千 王义权 周开亚
香港科技大学 K a r 1 W . Ts mi 董婷霞
摘要 目的 : 为了对贝母类药材的正确应用提供分子水平的 资料 。 方法 :采用 R川〕D 技术 对 12 个
贝母样品进行了亲缘关系研究 。 结果 :所有样品总 D NA均为 I ZKb 左右 。 从 20 个随机引物中筛选出 5
个扩增稳定且谱带清晰的引物 ,扩增产物共记录到 27 条谱带 , 多态性片段 25 条 , 扩增产物大小 为 450 b p
一 l侧又 bP 。 结论 : 种内相似性大于种间相似性 , 安徽贝母和蒲析贝母的亲缘关系最远 , 浙 贝母和 蒲忻贝
母的亲缘关系最近 。
关键词 贝母 贝母属分类 R AP D
, 材料与方法
1
.
1 材料 浙贝母 、 蒲沂贝母和安徽贝母的野
生 、栽培居群采 自当地 ,移栽到中国药科大学植
物园 ,样品经中国药科大学李萍教授鉴定 ,凭证
标本存于中国药科大学标本馆 。 具体见表 1。
表 1 实验材料
编号 品种 采集地点 类型
l 蒲沂贝母 湖北蒲沂随阳镇 野生
2 蒲析贝母 湖北蒲析随阳镇 野生
3 蒲沂贝母 湖北蒲忻中伙铺 野生
4 蒲析贝母 湖北蒲析中伙铺 野生
5 蒲沂贝母 湖北蒲析泉口药园 栽培
6 浙贝母 江苏宜兴茗岭 野生
7 浙贝母 宁波郸县樟村 栽培
8 浙贝母 江苏海门德胜乡 栽培
9 浙贝母 湖北蒲折人字岩药场 栽培
10 浙贝母 中国药科大学植物园 栽培
1 浙贝母 南京中山植物园 栽培
12 安徽贝母 安徽霍 山 栽培
,
,
2 总 DNA 的提取及纯度 、 浓度 测 定〔` 一 3 〕
取贝母新鲜叶片 2 9 , 双蒸水洗净后 ,剪碎 ,加人
液氮 ,研磨成粉末 , 转移至 or 耐 离心管中 , 加
人 5 耐 DNA 抽 提 缓 冲液 ( 8 mo F L 尿 素 、
0
.
35mo l/ L N
a C I
、
0
.
0 5 mo l / L l 、15一 HC I 、 0
.
1 mo l/ L
EDTA
、
2% 蔗糖 、 5% 苯酚 ) , 1 . 5 ml 10 % S D S ,混
匀 ,置印℃水浴 20 而 n ,加人等体积苯酚 : 氯仿
(川 )混匀 , 10 ℃ 、 9 20 转离心 10 而 n , 吸取上清
液 ,再加入等体积苯酚 :氯仿 ( 1 : l) 抽提 2 次 (方
中药材第 23 卷第 1期 2仪旧年 l 月
法同上 ) , 然后 吸取上清液 , 加人等体积氯仿混
匀 , 10 ℃ 9 80 转离心 or 而 n , 吸取上清液 , 加人
l/ or 体积 3 mo F L NaA C , 2 倍体积冷无水乙 醇 ,
缠出 DNA , 置超 净台上晾干 , 加人 2 0 川 ET 缓
冲液 , 置 4℃备用 。
所提样品在 90 23 型 DN A 微量荧光计上测
浓度 ,样 品浓度 在 10 一 70 n梦拼L 范 围 , 总 DN A
样 品经 7 21 型分光光度计测定 A珊 、 凡印 , 计算
A z印 / A姗值 , DN A 样 品纯度 在 1 . 4 一 1 . 9 之 间 。
各样品 DNA 电泳照片见图 I A 。
1
.
3 cP R 扩 增〔4 一 5〕 反 应 液总 体积 为 20 川
( 10 mo
l / L irT
s 一H C I
,
p H S
.
3
,
SOm
o l / L K C I
,
0
.
0 1% 明胶 , 2 ~ l/ L M薛 1
2 , dNTP
s 各 20
m o风 , 随 机 引 物 l 拜m o l / L , 模 板 2 0 n g ) 。 置
9 7℃预变性 10 而 n , 离心 10 5 , 加 r r a q 酶 o . s u 、
无菌双蒸水至 20 川 , 加人无菌石蜡 油 20 川 , 混
匀 ,离心 10 5 , DN A 扩增 在 1 10 9 型基 因扩增仪
上进行 。 循环 参数 : 94 ℃ 变性 85 5 , 36 ℃ 退火
10
5 ,
72 ℃ 延伸 160 5 , 41 循环 , 最后 72 ℃ 保温
or s
, 扩增产物于 1 . 5% 琼脂糖凝胶电泳 , EB 染
色并照相 , 照片见图 I B。
,
.
4 数据分析 随机扩增 DN A 片段在电场 中
的迁移率与分子量的对数值成反 比 , 根据分子
量标记 ( y DNA/ E CO IR + H i n d l )的片段大刁、及
泳动距离作标准曲线 , 根据该曲线求 出各扩增
片段的大小 。 某一扩增 片段 的有 无分别 记为
,’l ” 和 “ 0’ , , 对该数据矩阵采用 SSP S / PC 十 软件 中
l 3
DOI : 10. 13863 /j . i ssn1001 -4454. 2000. 01. 002
{图 1中药贝母类电泳图
A
. 贝母属不同样品总 D NA 图 B . 引物 O PF- 05 扩增产物电泳图
M
. 功NA EC O田 / 比n d皿 1一 2 1. 为 贝母属不 同样品 (见表 l )
的组 间平 均连 锁 法 ( Av a e rg ei Lnk ag eB ewt en e
G o ru p )聚类分析 , 建立种系发生树 。 遗传距离
指数 (D )根据 N e i ( 19 7 2 )的相似性估计计算 : D
= l
一
F
,
F = ZN
x y
( N
x + N , )
,
F 为任 意两 个体间
凡冲 D 片段共享度 , N : y为 x 和 y 个体分子量相
同的 凡护D 片段总数 , N : 、 N , 分别为 x 和 y 个体
的 凡廿D 片段总数 。 种群内个体间的遗传距离
指数以种群内所有个体组合间的 D 值平均数
计算 , 种群间个体的遗传距离指数以两种群间
所有个体组合间的 D 值平均数计算 。
2 结果
研究中所有样品 DNA 均为 21 bK 左右 , 从
O PF 系列 20 个随机引物中筛选 出 5 个扩增稳
定且谱带清晰的引物 , 分别是 : O PF 一05 , O PF 一06 ,
O PF
一
0 8
,
O PF
一
12
,
O PF
一巧 ,扩增产物共记录到 27
l ( ) 15 2《1 2 5
一 ~ 仁千 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _一+ ~ 一, _ ,一 一 ·子~ . . 一~ _ _ _十
图 2 贝母属样品遗传距离树系图
l
一 12
. 贝母属不同样品 (见表 l)
条谱带 (见表 2 ) , 多 态性片段 25 条 , 扩增产物
大小为 4 5 9 饰 一 19( 只 b p 。
根据 N ie ( 19 7 2 )公式计算 ,得到贝母样品遗
传距离指数 (见表 3 ) 。
对不同样 品扩增产物进行分析 , 可发现同
一种 内不同个体 间有较小差别 , 种间的差异大
表 2 贝母样品随机扩增的片段
引物 片段大小 (娜 ) 条带有无 ( l 一 12 ) 引物 片段大小 ( bp ) 条带有无 l( 一 12 )
0 P-F 05
0 P-F 05
0 P-F 05
0 P F
.
05
0 P F
.
05
OP F
`
05
OP F ` 05
O P F
.
05
0 P F 05
O P民 05
O P-F 15
O P F
勺
15
O P F
`
15
O P R 15
O P R 15
19( 妈
18X(]
1 1X()
947
1 1X()
83 1
8o
以X)
5麟
5o
137 5
1(又旧
947
7o
65 0
以洲刀叨 10 1X()
0 1X() 11 110 111
1 1 1 1 10 1 10 11 0
1 1 1 1 10 1 1 11 1 0
1 1 1 1 10 1 101 10
1 1 10 1 01 1 1 1 10
《X刀以】拟刀刃 1
11 1 1 1 11 11 1 10
以叉XX洲 ) 1X( X)
以刃以刃1 (X曰X)
仪XXX) 10 10 1X()
仪XX) 11 1 10 110
《XX众 X减X) X( X) 1
仪刃以 ) 1(XX刀刃
以XX洲刀以X 洲) 1
O P-F 15
O P-F 12
O P F
~
1 2
O P F
,
1 2
O P-F 12
OP-F 1 2
OP R 1 2
OP -F 12
OP -F 12
OP -F 12
OP F
`
12
0 P -F 06
OP F
~
08
0 P F
.
08
6以)
1 375
1 1X()
1〕汉)
1 1X()
94 7
83 1
63 O
以幻
5o
45 O
1(瓦X)
] 5 84
日刀
11 1 1 1 1 1 1 11 0 1
以X刀叨 1 10 1 10
0 1 (X X兀旧 10 1
0 1(X) 仪n l 以】1
仪刃以刃仪幻10 1
(减又XX洲拟XI X】1
1 10 10汉X】X)K 1
1 1 1 111 1 1 1 1 1 1
《X) 1(X洲 ) 1(1 ) 10
1 1 1 1 1 1X( )1 1 10
0 1乃刀 1《洲XXX )
1 111 [ 1 1111 11
砚I 斑义X) 1111 111
11 11 1仪XK X刃
中药材第 23 卷第 1期 2X( X) 年 l 月
表 31 2个贝母样品的遗传距离指数矩阵
1 234 5 6 78 9 10 1 1 1 2
1
20
.
6 29 6
0 3记双1 70 , 仅又37
4 0
. 仅又57 0 . 《双17 0 . 7 037
5 0
. 〔又又37 0 . 62 96 0 . 66 7 0
.
7 0 37
6 0
.
8 14 8 0
.
7 7 7 8 0
.
8 14 8 0
.
8 14 8 0
.
7 0 37
7 0
.
7以0 7 0 . 7 0 3 7 0 , 74() 7 0 . 7 7 7 8 0 . 6 6 7 0 . 74 0 7
8 0
.
7钓7 0 , 7 03 7 0 、 7 0 37 0 . 7 7 78 0 仅又17 0 . 7037 0 . 592 6
9 0
.
74D 7 O
.
74D 7 0
.
74() 7 0
.
7 7 7 8 0
.
74 07 0
.
7 7 7 8 O
.
74() 7 0
.
7叨7
1 0 0
.
7 03 7 0
.
629 6 0
.
7 03 7 0
.
7 4( )7 0
.
62 96 0
.肠 67 0 . 5 92 6 0 . 5 185 0 . 7 03 7
11 O
.
74() 7 0
.
7 037 0
.
7037 0 7 7 7 8 0
.肠 67 0 . 74 0 7 0 . 62 9 6 () . 592 6 0 . 74D 7 0 . 5 9 2 6
12 0
.
85 19 0
.
777 8 0
.
8889 0
.
85 19 0
.
85 19 0
.
8 14 8 0
.
8 14 8 0
.
8 14 8 0
.
85 1 9 0
.
7叼7 0 . 85 19
于种内差 异 。 表 2 的数 据经 SPS S/ PC 十 软 件分
析 ,得到结果见图 2o
3 讨论
引物 O PF 一 06 扩增的片段在贝母属各样 品间
无明显差异 ,均在 l (x 旧 b p 左右有 1条清晰谱带 ,
这表明 O PF 一06 扩增的片段在贝母 内具有高度稳
定性 ,可能为贝母属的特征性片段 。 其他 4 个引
物的扩增片段在各样品间则有明显差异 ,尤其是
引物 O PF 一0 5 , 扩增产物在蒲析贝母 、 浙贝母及安
徽贝母间明显不同 , 有可能作为鉴定贝母品种的
标记 。
通过样品遗传距离指数可看出 ,种 内相似性
( D值为 0 . 仅拓7 一 0 . 6 71 6) 大于种间相似性 ( D 值
为 0 . 7 30 9 一 0 . 别 4 5 ) 。 安徽贝母和蒲折 贝母的亲
缘关系最远 ,安徽贝母和浙 贝母亲缘关系较近 ,
浙贝母和蒲忻贝母的亲缘关系最近 。
聚类分析结果表 明 , 样 品被分成了三组 : 浙
贝母样品 、蒲沂贝母样品及安徽 贝母样品 。 蒲析
贝母先和浙贝母聚类 , 然后与安徽贝母聚类 , 说
明蒲析贝母和浙贝母亲缘关 系较之与安徽 贝母
为近 。 在浙贝母 中 , 4 个栽培 品先聚类 , 然后再
与野生品聚类 ,在浙贝母栽培品中 ,南通产浙 贝
母与中山植物园浙贝母先聚类 , 可能是 由于南通
浙贝母种源与中山植物园浙贝母相同 ,这些结论
与经典分类一致 。
自从《中国植物志》 (第 14 卷 )出版 以来 , 贝
母属又增加了 10 个新名称 , 由于该属分布范围
中药材第 23 卷第 l 期 2仪幻年 l 月
)
、一 ,种间变异极为复杂 ,种间性状交叉普遍 , 给形
态分类带来 困难 。 一些分类等级 的处理也有争
议 。 余 国奠将蒲析贝母作为新种 , 而余世春将它
作 为 浙 贝 母 的 变 种 , 命 名 为 F . t加动 e谬 i
var
. 尽叮 ic 。 澎6 一 7〕 , 罗毅波等认为蒲沂贝母应与天
目贝母合并 。 本文研究表 明蒲折 贝母与浙贝母
亲缘关系更近 ,这也与同工酶及花粉形态研究结
果一致〔8 、 9 〕。 然而 ,这种亲缘关 系反映到分类等
级的处理上 ,应作为新种或变种还是与其他种合
并 ,还需作进一步研究 , 我们正在应用 DNA 序列
分析方法研究这 一问题 。 本文仅 报道 F人P D 研
究的结果 。
参 考 文 献
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.
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.
心y 研心八15 B e鲡 ;阮泛从穿认翩了砚。川了 ;凡护 D
瑞香狼毒与黄花瑞香狼毒的生药鉴定
解放军北京军医学院 ( 10( 刃7 1 ) 赵奎君 杨 隽
中国药科大学 ( 21 0( 力9 ) 徐国钧 金蓉驾 徐洛珊
摘要 对瑞香狼毒 oftS le ar c ham明沁 neI 及黄花瑞香狼毒 set 战ar c haZ 刀Q娜山neI f比九小 a 刀刀故 进行 了生药
性状 、 显微 、 薄层色谱方面的 比较鉴别 , 以供扩大药源 、控制质量参考 。
关键词 瑞香狼毒 黄花瑞香狼毒 生药鉴定
瑞香狼毒又称红狼毒 , 为瑞香科植物瑞香
狼毒 etS l花ar c ha 仰ez] 锄me L . 的根 。 是狼毒的一
种 ,具有散结 、 杀虫的功效〔`〕。 药理实验表明 ,
瑞香狼毒具有一定的抗肿瘤作用图 。 经本草考
证 ,瑞香狼毒应为中药狼毒的正 品闭 。 我们在
对中药狼毒进行的资源调查中 ,发现在四川 、 云
南部分地 区用黄 花瑞香 狼毒 s te l e ar 动习n lae -
娜me L . f . 硫。 3 Q n ￡h习 5 . C . H u agn 代瑞香狼毒使用闭 。 有关黄花瑞香狼毒的药用至今未见记
载 ,其药理药效是否与瑞香狼毒相同尚不得知 。
为确保用药的安全 、 准确 , 我们对两者进行了较
为详尽的生药学研究 , 以为两者的鉴别及开 发
利用提供参考 。
16
.
, 实验材料 瑞香狼毒 凡刁肠川 刁滋功碉沁 m e L
采 自 内 蒙 古 宁 城 , 黄 花 瑞 香 狼 毒 st el l e r。
hca 脸姆哪me L
.
f沁几邢。 刀动。 S . C . H u an g 采 自云
南宣威 , 均经过笔者鉴定 。
2 药材性状
2
.
, 瑞香狼毒 根圆柱形或圆锥形 ,表面棕黄
色至棕红色 ,有稍弯曲的纵皱纹及横长皮孔 , 皮
孔长 0 . 1 一 0 . 6 Cm , 并有侧根痕及残 留的细根 。
质韧 , 不易折断。 折断面具 白色绒毛状纤维 。
气微 ,味淡 。
2
.
2 黄花瑞香狠毒 根多呈圆锥形 ,表面黄棕
色 。 上部常极膨大 , 直径可达 8 。 m , 多扭 曲成
麻花状 。 无分枝或偶有分枝 ,具有粗大 的皮孔 ,
中药材第 23 卷第 1期 2X( X) 年 l 月