全 文 ：［收稿日期］ 20130524(016)
［第一作者］ 高森，硕士，主管药师，从事临床药学和中药质量控制研究，Tel:13920249696，E-mail:gaosenyjk@ 163． com
［通讯作者］ * 房志仲，教授，硕士生导师，从事药物制剂与质量控制研究，Tel:022-23542805，E-mail:fangzhizhongtj@ 163． com
HPLC-ELSD测定猴枣牛黄散中乔松素、
小豆寇明、西贝母碱和西贝母碱苷
高森1，李正翔1，王志涛1，房志仲2*
(1. 天津医科大学总医院，天津 300052;2. 天津医科大学，天津 300070)
［摘要］ 目的:采用高效液相色谱-蒸发光散射法测定猴枣牛黄散(HZNHS)中乔松素、小豆寇明、西贝母碱和西贝母碱苷
的含量。方法:Hypersil C18色谱柱(4. 6 mm × 150 mm，5 μm) ，流速 0. 9 mL·min
－1，流动相(乔松素和小豆寇明)A为甲醇，B为
0. 5%磷酸溶液，检测波长 300 nm;流动相(西贝母碱和西贝母碱苷)乙腈-水-二乙胺(65∶ 35∶ 0. 5) ，ELSD漂移管温度 80 ℃，载
气(N2)流速 2. 3 SLPM·min
－1。结果:乔松素和小豆寇明分别在0. 052 7 ～ 1. 054 μg(r = 0. 999 4) ，0. 036 2 ～ 0. 724 0 μg(r =
0. 999 8)进样量与峰面积呈良好的线性关系，平均加样回收率分别为 97. 14%，97. 64%，ＲSD分别为 1. 10%，1. 39%;西贝母碱
和西贝母碱苷分别在0. 057 1 ～ 1. 142 μg(r = 0. 999 1) ，0. 081 3 ～ 1. 626 μg(r = 0. 999 5)进样量的自然对数值与峰面积的自然
对数值呈良好的线性关系，平均加样回收率分别为 97. 55%，98. 09%，ＲSD分别为 1. 75%，1. 80%。结论:方法测定结果准确、
灵敏、重复性好，可用于猴枣牛黄散中乔松素、小豆寇明、西贝母碱和西贝母碱苷的测定。
［关键词］ 猴枣牛黄散;乔松素;小豆寇明;西贝母碱;西贝母碱苷;高效液相-蒸发光散射
［中图分类号］ Ｒ284. 1 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2013)21-0145-05
［doi］ 10． 11653 /syfj2013210145
Determination of Pinocembrin，Cardamonin，Sipeimine and
Sipeimine-3β-D-glucoside in Houzao Niuhuangsan by HPLC-ELSD
GAO Sen1，LI Zheng-xiang1，WANG Zhi-tao1，FANG Zhi-zhong2*
(1. General Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin 300052，China;
2. Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China)
［Abstract］ Objective: To develop an HPLC-ELSD method for determination of the content of
pinocembrin，cardamonin，sipeimine and sipeimine-3β-D-glucoside in Houzao Ninhuangsan (HZNHS)． Method:
An Hypersil C18 column was used as the chromatographic column，the flow rate was 0. 9 mL·min
－1 ． The mobile
phase for pinocembrin and cardamonin consisted of methanol (A)and 0. 5% phosphoric acid solution (B) ;the
UV detection wavelength was at 300 nm． The mobile phase for sipeimine and sipeimine-3β-D-glucoside consisted
of acetonitrile-water-diethylamine (65∶ 35∶ 0. 5)． The temperature of drift tube was set at 80 ℃，and the gas flow
(N2)was set at 2. 3 SLPM·min
－1 ． Ｒesult:There was a good linear relationship between the concentration of
pinocembrin，cardamonin and peak area value when the concentrations of pinocembrin and cardamonin were within
the range of 0. 052 7-1. 054 μg (r = 0. 999 4) ，0. 036 2-0. 724 0 μg (r = 0. 999 8)． The average recovery were
97. 14% (ＲSD 1. 10%) and 97. 64% (ＲSD 1. 39%)． There was a good linear relationship when the
concentrations of sipeimine and sipeimine-3β-D-glucoside were within the range of 0. 057 1-1. 142 μg (r = 0. 999
1) ，0. 081 3-1. 626 μg (r = 0. 999 5)． The average recovery was 97. 55% (ＲSD 1. 75%)and 98. 09% (ＲSD
1. 80%)． Conclusion:The method was accurate，sensitive，reproducible and may be used in the determination of
pinocembrin，cardamonin，sipeimine and sipeimine-3β-D-glucoside in HZNHS．
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Vol． 19，No． 21
Nov．，2013
［Key words］ Houzao Niuhuangsan;pinocembrin;cardamonin;sipeimine;sipeimine-3β-D-glucoside;
HPLC-ELSD
猴枣牛黄散为中药复方制剂，由草豆蔻、川贝母
(蛇胆汁制)、猴枣、猪牙皂、牛黄、细辛、珍珠(水
飞)、琥珀(水飞)、石菖蒲、朱砂(水飞)、人工麝香、
硝石、冰片、白矾(煅)、甘草、全蝎(制)等 16 味药物
组成。具有除痰镇惊、通窍之功效，可用于小儿惊
风、痰涎壅盛等症状的治疗［1-2］。猴枣牛黄散辅助
治疗支气管肺炎疗效显著，有利于缩短病程，且无明
显不良反应，同时有效地排除气道内的黏稠分泌物，
从而保持气道通畅，改善通气。另外该药还具有清
热化痰、安神、清心定惊之效，有利于减少患儿烦躁，
减少机体的耗氧量，对病情转归有助［3-4］。原质量
标准仅对方中一味药材进行了定性鉴别，未对方中
的任何药味进行含量测定。为保证产品质量，确保
临床疗效，本文采用高效液相色谱法对草豆蔻中乔
松素、小豆寇明和川贝母中西贝母碱、西贝母碱苷进
行含量测定方法研究，为完善该制剂质量标准提供
依据。
1 材料
日本岛津 LC-10ATVP型高效液相色谱仪(岛津
自动进样器 SIL-10ADVP) ，ANASTAＲ 色谱数据工
作站，Alltech 2000ES 型蒸发光散射器，SPD-1OAVP
型紫外-可见检测器，乔松素对照品(批号 111829-
201001)、小豆寇明对照品(批号 110763-200403)、
西贝母碱对照品(批号 110767-201005)和西贝母碱
苷对照品(批号 111917-201001)均购于中国食品药
品检定研究院;猴枣牛黄散(规格 0. 36 g /瓶，批号
130410，130417，130420)购于佛山冯了性药业有限公
司;甲醇、乙腈(色谱纯，安徽时联特种溶剂股份有限
公司) ，磷酸、二乙胺(分析纯，广州化学试剂二厂)。
2 方法与结果
2. 1 乔松素和小豆寇明的含量测定［5-10］
2. 1. 1 色谱条件及系统适应性 Hypersil C18色谱
柱(4. 6 mm × 150 mm，5 μm) ，流动相 A 甲醇，B
0. 5%磷酸溶液，梯度洗脱(0 ～ 10 min，55% A;10 ～
35 min，55% ～ 70% A;35 ～ 50 min，70% A) ，检测波
长 300 nm，流速 0. 9 mL·min －1。在此条件下乔松素
和小豆寇明与其他组分分离效果良好，以乔松素计
理论塔板数不低于 4 000。
2. 1. 2 检测波长的选择 分别取乔松素对照品和
小豆寇明对照品适量，加甲醇溶解制成每 1 mL 含
0. 03 mg的溶液，在 200 ～ 400 nm 进行紫外扫描，结
果乔松素对照品在 300 nm处有最大吸收，小豆寇明
对照品在 301 nm处有最大吸收，参考 2010 年版《中
国药典》草豆蔻药材含量测定项下检测波长 300
nm，故将检测波长定用 300 nm。
2. 1. 3 对照品混合溶液的制备 精密称取乔松素
对照品和小豆寇明对照品各适量，加甲醇制成对照
品混合溶液(乔松素为 0. 052 7 g·L －1，小豆寇明为
0. 036 2 g·L －1)。
2. 1. 4 供试品溶液的配制 取本品内容物约 2 g，
精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 25 mL，
称定质量，超声处理(200 W，频率 30 kHz)20 min，
放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤
过，取续滤液作为供试品溶液。
2. 1. 5 阴性对照溶液的配制 按猴枣牛黄散处方
比例称取适量除草豆蔻的其余药味，按猴枣牛黄散
的前处理和制剂生产工艺制成缺草豆蔻的阴性样
品，按照 2. 1. 4 方法制成缺草豆蔻的阴性对照溶液。
2. 1. 6 线性关系考察 精密吸取对照品混合溶液
1，5，10，15，20 μL，按 2. 1. 1 色谱条件进行测定，以
峰面积积分值为纵坐标，乔松素、小豆寇明量为横坐
标分别绘制标准曲线，得回归方程 Y乔松素 =
3. 198 3 × 106X + 946. 4(r = 0. 999 4) ，Y小豆寇明 =
2. 999 2 × 106X － 621. 2(r = 0. 999 8)。表明乔松素
在0. 052 7 ～ 1. 054 μg 进样量与峰面积线性关系良
好，小豆寇明在 0. 036 2 ～ 0. 724 0 μg进样量与峰面
积线性关系良好。
2. 1. 7 阴性对照试验 分别精密吸取 10 μL 的供
试品溶液、对照品溶液及阴性对照溶液，按 2. 1. 1 项
的色谱条件进行色谱分析，供试品溶液色谱中，在与
乔松素对照品和小豆寇明对照品相同保留时间处有
吸收峰，而阴性对照溶液在相同保留时间处未显吸
收峰，见图 1。
2. 1. 8 精密度试验 取对照品混合溶液重复进样
6 次，按 2. 1. 1 项的色谱条件测定乔松素和小豆寇
明的峰面积，结果表明仪器具有良好的精密度，乔松
素和小豆寇明的 ＲSD分别为 0. 97%，0. 64%。
2. 1. 9 重复性试验 取同一批样品，按上述方法制
备 6 份供试品溶液，分别测定其含量，乔松素和小豆
寇明的 ＲSD分别为 0. 46%，0. 69%，表明本方法具
有良好的重复性。
2. 1. 10 稳定性试验 取同一供试品溶液，在放置
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Nov．，2013
A．对照品;B．样品;C．阴性对照品;1. 乔松素;2. 小豆寇明
图 1 猴枣牛黄散中乔松素和小豆寇明的 HPLC
0，1，2，4，6，8 h后精密吸取 10 μL进样，测定其峰面
积值，乔松素和小豆寇明的 ＲSD 分别为 0. 81%，
0. 72%，供试品溶液 8 h内基本稳定。
2. 1. 11 加样回收率试验 取已知含量(乔松素含
量 0. 54 mg·g －1、小豆寇明含量 0. 38 mg·g －1)的同
一批样品适量，取 1. 0 g，精密称定，置 25 mL具塞锥
形中，分别精密加入对照品混合溶液 10 mL，按供试
品溶液制备方法制成加样供试液。精密吸取加样供
试液 10 μL，按上述含量测定方法测定其峰面积，计
算回收率，表明本方法回收率良好，见表 1。
表 1 猴枣牛黄散中乔松素和小豆寇明回收率试验
成分
取样量
/ g
样品含量
mg·g － 1
测得量
/mg
回收率
/%
平均值
/%
ＲSD
/%
乔松素 1. 039 7 0. 561 4 1. 064 7 95. 50 97. 14 1. 10
1. 132 4 0. 611 5 1. 123 9 97. 23
1. 025 9 0. 554 0 1. 062 1 96. 42
0. 981 5 0. 530 0 1. 042 4 97. 23
1. 012 9 0. 547 0 1. 065 1 98. 32
0. 991 1 0. 535 2 1. 052 6 98. 18
小豆寇明 1. 039 7 0. 395 1 0. 742 5 95. 97 97. 64 1. 39
1. 132 4 0. 430 3 0. 780 6 96. 76
1. 025 9 0. 389 8 0. 741 9 97. 25
0. 981 5 0. 373 0 0. 730 4 98. 74
1. 012 9 0. 384 9 0. 745 8 99. 70
0. 991 1 0. 376 6 0. 729 3 97. 43
注:对照品混合溶液加入量为 10 mL，即乔松素为 0. 527 mg，小
豆寇明为 0. 362 mg。
2. 2 西贝母碱和西贝母碱苷的含量测定［7-10］
2. 2. 1 色谱条件及系统适应性 Hypersil C18色谱
柱(4. 6 mm ×150 mm，5 μm) ，乙腈-水-二乙胺(65∶
35∶ 0. 5)为流动相，ELSD 漂移管温度 80 ℃，载气
(N2)流速 2. 3 SLPM·min
－1，流速 0. 9 mL·min －1。在
此条件下西贝母碱和西贝母碱苷与其他组分基线分
离良好，以西贝母碱计理论塔板数不低于 3 000。
2. 2. 2 对照品混合溶液的制备 精密称取西贝母
碱和西贝母碱苷对照品适量，置 25 mL量瓶中，加三
氯甲烷-甲醇(3∶ 2)溶解后稀释至刻度，摇匀，即得对
照品混合溶液(西贝母碱 0. 057 1 g·L －1和西贝母碱
苷 0. 081 3 g·L －1)。
2. 2. 3 供试品溶液的制备 取本品适量，研成细
粉，称取 10. 0 g，精密称定至烧瓶中，加浓氨溶液
10 mL浸渍 1 h，精密加入三氯甲烷-甲醇(3∶ 2)混合
溶液 100 mL，称定质量，超声处理(功率 300 W，频
率 40 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用三氯甲烷-
甲醇(3∶ 2)混合溶液补足减失质量，摇匀，滤过，精
密量取续滤液 50 mL，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶
解并定容至 10 mL 量瓶中，摇匀，用微孔滤膜滤过，
取续滤液，即得。
2. 2. 4 阴性对照溶液的制备 按猴枣牛黄散处方
比例称取适量除川贝母的其余药味，按猴枣牛黄散
的前处理和制剂生产工艺制成缺川贝母的阴性样
品，按照方法制成缺川贝母的阴性对照溶液。
2. 2. 5 线性关系考察 分别精密吸取对照品混合
溶液 1，5，10，15，20 μL，按 2. 2. 1 项下的色谱条件进
行测定，以峰面积的自然对数值为纵坐标，西贝母碱、
西贝母碱苷的自然对数值为横坐标分别绘制标准曲
线，回归方程 Y西贝母碱 = 0. 99X + 5. 07(r = 0. 999 1) ，
Y西贝母碱苷 = 1. 07X + 4. 95(r = 0. 999 5) ，表明西贝母
碱在 0. 057 1 ～ 1. 142 μg 进样量的自然对数值与峰
面积的自然对数值线性关系良好，西贝母碱苷在
0. 081 3 ～ 1. 626 μg 进样量的自然对数值与峰面积
的自然对数值线性关系良好。
2. 2. 6 阴性对照试验 分别精密吸取 10 μL 的供
试品溶液、对照品溶液及阴性对照溶液，按 2. 2. 1 项
的色谱条件进行色谱分析，结果阴性无干扰，表明含
量测定方法具有良好的专属性，见图 2。
2. 2. 7 稳定性试验 取同一批样品，按 2. 2. 3 制备
供试品溶液，在放置 0，1，2，4，6，8 h 后精密吸取
10 μL进样，测定其峰面积值，西贝母碱和西贝母碱
苷 ＲSD分别为 0. 81%，0. 75%，表明供试品溶液 8 h
内基本稳定。
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高森，等:HPLC-ELSD测定猴枣牛黄散中乔松素、小豆寇明、西贝母碱和西贝母碱苷
A．对照品;B．样品;C．阴性对照品;1. 西贝母碱;2. 西贝母碱苷
图 2 猴枣牛黄散中西贝母碱和西贝母碱苷的 ELSD
2. 2. 8 重复性试验 取同一批样品，按上述方法制
备 6 份供试品溶液，分别测定其含量，西贝母碱和西
贝母碱苷的 ＲSD 分别为 0. 73%，0. 54%，表明本方
法具有良好的重复性。
2. 2. 9 精密度试验 取对照品混合溶液进样 6 次，
按 2. 2. 1 项的色谱条件测定西贝母碱和西贝母碱苷
的峰面积，结果表明，仪器具有良好的精密度，西贝
母碱 ＲSD 0. 45%，西贝母碱苷 ＲSD 0. 91%。
2. 2. 10 加样回收率试验 取已知含量(西贝母碱
0. 11 mg·g －1、西贝母碱苷 0. 16 mg·g －1)的的同一
批样品适量，研成细粉，称取 5. 0 g，精密称定至烧瓶
中，分别精密加入对照品混合溶液 10 mL，再加浓氨
溶液 10 mL浸渍 1 h，精密加入三氯甲烷-甲醇(3∶ 2)
混合溶液 90 mL，称定质量，超声处理(功率 300 W，
频率 40 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用三氯甲
烷-甲醇(3∶ 2)混合溶液补足减失质量，摇匀，滤过，
精密量取续滤液 50 mL，置水浴上蒸干，残渣加甲醇
溶解并定容至 10 mL 量瓶中，摇匀，用微孔滤膜滤
过，取续滤液作为加样供试液。精密吸取加样供试
液 10 μL，按上述含量测定方法测定其峰面积，计算
回收率，表明本方法回收率良好，见表 2。
表 2 猴枣牛黄散中西贝母碱和西贝母碱苷回收率试验
成分
取样量
/ g
样品含量
mg·g － 1
测得量
/mg
回收率
/%
平均值
/%
ＲSD
/%
西贝母碱 5. 021 6 0. 552 4 1. 120 4 99. 48 97. 55 1. 75
4. 982 5 0. 548 1 1. 092 7 95. 38
4. 995 7 0. 549 5 1. 101 3 96. 63
5. 019 4 0. 552 1 1. 112 5 98. 14
5. 010 8 0. 551 2 1. 118 6 99. 37
4. 989 1 0. 548 8 1. 098 5 96. 27
西贝母碱苷 5. 021 6 0. 803 5 1. 607 98. 84 98. 09 1. 80
4. 982 5 0. 797 2 1. 590 97. 52
4. 995 7 0. 799 3 1. 619 100. 82
5. 019 4 0. 803 1 1. 601 98. 14
5. 010 8 0. 801 7 1. 597 97. 82
4. 989 1 0. 798 3 1. 574 95. 42
注:对照品混合溶液加入量为 10 mL，即西贝母碱为 0. 571 mg，
西贝母碱苷为 0. 813 mg。
2. 3 样品测定 取 3 批样品按 2. 1 项下乔松素和
小豆寇明测定方法，分别精密吸取对照品混合溶液
和供试品溶液各 10 μL，注入液相色谱仪，测定乔松
素和小豆寇明的含量，结果见表 3。
取 3 批样品按 2. 2 项下西贝母碱和西贝母碱苷
测定方法，分别精密吸取对照品混合溶液 5，10 μL
和供试品溶液 10 μL，注入液相色谱仪，测定，用外
标两点法对数方程分别测定本品中西贝母碱和西贝
母碱苷的含量，结果见表 3。
表 3 猴枣牛黄散中 4 种成分含量测定
批号
乔松素 /mg·g － 1 小豆寇明 /mg·g － 1 西贝母碱 /mg·g － 1 西贝母碱苷 /mg·g － 1
含量 平均含量 ＲSD /% 含量 平均含量 ＲSD /% 含量 平均含量 ＲSD /% 含量 平均含量 ＲSD /%
130410 0. 538 0. 54 0. 28 0. 378 0. 38 0. 53 0. 109 0. 11 0. 91 0. 159 0. 16 0. 95
0. 541 0. 382 0. 111 0. 161
0. 540 0. 380 0. 110 0. 162
130417 0. 576 0. 58 0. 96 0. 375 0. 38 0. 85 0. 120 0. 12 0. 83 0. 171 0. 17 0. 90
0. 572 0. 381 0. 121 0. 172
0. 583 0. 376 0. 119 0. 169
130420 0. 564 0. 56 0. 45 0. 391 0. 39 0. 68 0. 108 0. 11 0. 53 0. 181 0. 18 0. 85
0. 559 0. 387 0. 109 0. 179
0. 562 0. 386 0. 108 0. 178
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3 讨论
西贝母碱和西贝母碱苷测定时分别以甲醇-水
(65∶ 35)、乙腈-水-二乙胺 (75∶ 25 ∶ 0. 5)和乙腈-水-
二乙胺(65 ∶ 35 ∶ 0. 5)为流动相，结果甲醇-水
(65∶ 35)分离效果不好，未达到基线分离，乙腈-水-
二乙胺(75∶ 25 ∶ 0. 5)西贝母碱峰形良好，但西贝母
碱苷达不到基线分离，乙腈-水-二乙胺(65∶ 35∶ 0. 5)
均能达到基线分离，峰形较好。故选用乙腈-水-二
乙胺(65∶ 35∶ 0. 5)为流动相。
草豆蔻和川贝母为方中主要药物，草豆蔻具有
燥湿行气，温中止呕的功效，可用于寒湿内阻、脘腹
胀满冷痛、嗳气呕逆、不思饮食等症的治疗。川贝母
具有清热润肺、化痰止咳、散结消痈的功效，可用于
肺热燥咳、干咳少痰、阴虚劳嗽、痰中带血、瘰疬、乳
痈、肺痈等症的治疗。同时乔松素和小豆寇明为草
豆蔻主要成分，西贝母碱和西贝母碱苷为川贝母主
要成分，本文采用高效液相色谱法对草豆蔻中乔松
素、小豆寇明和川贝母中西贝母碱、西贝母碱苷进行
含量测定方法研究，对完善本品的质量标准具有十
分重要的作用，能有效控制产品的内在质量。
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［责任编辑 顾雪竹］
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高森，等:HPLC-ELSD测定猴枣牛黄散中乔松素、小豆寇明、西贝母碱和西贝母碱苷