全 文 ：5 1 9 9年
第5 2卷
西北大学学报 (自然科学版 )
O J
u r na loN f o rth we s tU n ie v
rs ity (N a tu ra i Se e ine cEd itf o n)
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.
6
伊贝母细胞悬浮培养的研究 ’
樊 君 ` , 朱四易 2 , 李宝璋 ”
( l) 西北大学化工系 , 2) 西北大学生物系 , 71 0 069 ,西安太白北路 1 号 ,第一作者 36 岁 ,男 ,讲师 )
摘 要 研究了伊贝母细胞悬浮培养过程 中接种量 、 培养方式和激素浓度对细胞生长的影响 ;
浏得细胞生长周期为 19 一 24 d ; 分析 了培养液的 p H 、蔗糖浓度 、 电导率和 D 。 变化的原 因 。 鉴
定 了愚浮培养细胞中含有生物碱 , 其总生物碱和西贝素含量均高于栽培鳞茎 。
关键词 伊贝母 ;细胞悬浮培养 ; 生物碱
分类号 0 9 4 . 3 3 4
植物细胞大量培养技术迅速发展 ,植物细胞培养已成为一门新兴的科技产业门类 l3[ 。 植物细胞大量
培养生产次生代谢产物 , 不仅克服了化学合成药物的缺点 ,而且也克服了人工栽培的不足 。 伊贝母
( F
r t`l`l l a 尹落a , a l l`d坛f l o尹a S c h r e n k )为百合科贝母属多年生草本植物 ,是珍稀中药材 , 由于过度采挖 , 自
然蕴藏量显著减少 ,市场供需矛盾突出 。 因此 ,采用植物细胞大规模培养的方法 ,提取伊贝母有效成分 ,
具有重要的经济价值和社会效益 。 伊贝母愈伤组织培养曾有研究图 ,但对细胞悬浮培养似未报道 。 本文
报道培养条件对细胞生长的影响和生物碱含量的初步结果 。
1 材料与方法
1
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1 材 料
伊贝母材料是西北大学生物系试验基地栽培 5 年生植株的鳞茎 ,将其诱导产生愈伤组织 , 经 5次继
代培养后 ,选取生长旺盛 、质地松散且增殖率高的愈伤组织用作悬浮培养的种子 。
L Z 培养方法
细胞悬浮培养为暗培养 ,培养基为附加 K T (激动素 ) , 2 . 4一 D ( 2 , 4一二氯苯氧乙酸 )的 M s 培养基 ,培
养温度 26 士 1 O c ,灭菌前将培养基的 p H 值调至 5 . 8 。悬浮培养用 3 0 m L 的三角瓶 , 内装 50 m L 培养液 ,
接种后分别置于往复式摇瓶机 s( H z 一 82 型水浴恒温振荡器 ,江苏太仓医疗器械厂生产 )和旋转式摇床
( w D P 型微生物多用培养箱 , 山东大学金工厂生产 ) ,转速 10 0 ; / m in 。
1
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3 细胞生长量 、理化指标及生物碱的分析测定
1
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3
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1 细胞生长量 以细胞鲜重的增长倍数表示 ,即接种时细胞鲜重与取样时细胞鲜重之比 。 所列实
验结果均为 3 次重复平均值 。
1
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3
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2 糖的浏定 取不同培养时期的培养液 ,用蕙酮法测定其蔗糖含量 3j[ ,计算出蔗糖利用率
蔗糖利用率一 1一样品液蔗糖含量原液蔗糖含量
1
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3
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3 p H 的测定 取不同培养时期的培养液 , 用 p H s 一 2 型酸度计 (上海第二分析仪器厂生产 )测
收稿日期 : 199 5一 04一 1 8
一 6 6 5一 西北大学学报 (自然科学版 )第 5 2卷
定 。
1
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3
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4电导率的测定 取不同培养时期的培养液 ,用 D D s 一 1 1A 型电导仪 (上海第二分析仪器厂生
产 )测其电导率 。
1
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3
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5 D o( 溶氧 )的浏定 用 Y sI 50 型溶氧仪 (美国 Y sl 公司生产 )测量不同培养时期培养液的 D 。
值 。
1
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3
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6 总生物碱的测定 [’1 将悬浮培养细胞于 60 ℃ 的烘箱内烘干至恒重 、 粉碎 、过 40 目筛 。 精密称取
2 9 细胞干粉 ,置于 50 m L 具塞三角瓶中 ,以 2 m L 氨水湿润后 ,加 40 m L 混合溶媒 ( 乙醚 一氯仿一乙醇 ~
25
: 8 : 2
.
5) 室温浸泡过夜 ,取上清液 0 . 50 m L ,蒸除氨水 ,再加 10 m L 氯仿 , 2 m L p H S . 5 的缓冲溶液 ,
用 0 . 0 1 m 。 1 / L 澳康香草酚蓝溶液滴定 , 以西贝素计算折合总生物碱含量 。
1
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3
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7 西 贝素薄层扫描法浏定 取上述总生物碱提取液 20 m L ,蒸干后定容于 2 m L 容量瓶中 ,然后
取 10 林 L 点样于硅胶 G 一 c M c 薄层板上 ,以乙酸乙醋 一甲醇一氨水 ( 2 0 : 1 : l) 上行展开 ,以改良碘化秘钾
试剂喷雾显色 ,对样品斑点和标准品斑点同时进行双波长扫描旧 本岛津 cs 一 9 30 薄层扫描仪 )测定 ,
波长为 5 05 n m ,参比波长 6 0 0 n m ,线性参数 s 二一 3 , 以外标法计算西贝素含量 。
2 结果与讨论 10 r 惫俘培养
ǎ彭华润平脚留界2 . 1 悬浮培养细胞的生长动态
图 1表明在细胞悬浮培养过程中 ,在一个生长周期内 ,细胞数量
的改变基本是一条 s形曲线 。 在我们的实验条件下 ,生长周期大体分
为 : 延迟期 3~ 4 d ,对数生长期 6一 s d ,直线期约 6 d ,减慢期 4一 6 d 。
生长 19 ~ 24 d 之后进入静止期 ,细胞停止生长 。 因此 ,在静止期到来
之前 , 必须进行继代培养 ,或者将其收获 。 固体培养细胞与悬浮培养
细胞相比较 ,虽然生长曲线都呈 s 形 ,但固体培养细胞的各个生长期
均延长 。 在一个生长周期内液体悬浮培养比固体培养时间缩短 1 Z d
左右 ,增殖速度比固体培养快 (图 1 ) , 是提高细胞生长量的有效培养
方式 。
固体培养
10 20 30 叨
堵葬时间 / d
图 1 伊贝母培养的生长曲线
2
.
2 接种量 、培养方式和激素浓度对悬浮培养细胞生长的影响
2
.
2
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1 接种量的影响 伊贝母愈伤组织接种量对悬浮细胞生长量的影响见表 1 。 表明加大接种量 ,有
利于悬浮培养的进行 。
表 1 接种量对伊贝母悬浮培养细胞生长的影响
接种细胞鲜重 / 9 1 . 1 1 . 7 .2 5 .3 5
2 0 d 细胞鲜重 / 5 4 . 6 7 1 1 . 05 2 1. 7 6 3 6 . 7 4
2 0 d 增殖 /倍 4. 3 6 . 5 8 . 7 1 0 . 5
2
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2
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2 培养方式的影响 对伊贝母细胞悬浮培养来说 , 以旋转式摇床为最好 ,悬浮培养细胞的生长速
度明显高于往复式摇床和慢速转床 (表 2 ) 。
表 2 培养方式比较
培养方式 往复式摇床 旋转式摇床 慢速转床
接种鲜重 / 9 3 . 1 3 . 1 3 . 1
生长速度 / g ( d · L )一 , 6 . 37 9 . 62 4. 7 3
2
.
2
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3 激素浓度 的影响 生长素和细胞分裂素结合使用对培养植物细胞的生长具有协同增效作用 ,但
第 6期 樊 君等 :伊贝母细胞悬浮培养的研究 一 6 57 一
适合于固体培养的浓度不一定适合于液体悬浮培养 。在固体培养中 ,激素通过扩散与植物材料接触起作
用 ,而在液体悬浮培养中是直接接触的 ,故激素浓度要适当降低 。本实验设计了不同激素组合 ,如表 3 所
示 。
表 3 激素 (2 , 4一 D + K T )浓度对悬浮培养细胞生长的影响
激素浓度 / m s ( L )一 , 0 . 1+ 0 . 04 0 . 2+ 0 . 08 0 . 5+ 0 . 1 1 . 0+ 0 . 04
接种量厄 3 3 3 3
2叱增殖 /倍 8 . 4 8 . 6 7 . 2 6 . 6
由表 3 可知 , 2 , 4一 D 浓度为 0 . 1一 0 . s m g / L , K T 浓度为 0 . 04 ~ 0 . 1 m g L/ 时 ,悬浮培养细胞生长良
好 。 伊贝母细胞悬浮培养与固体愈伤组织培养相比 , 2 , 4一D 适宜浓度降低了 10 余倍 , K T 的适宜浓度降
低了 5一 1 0倍 。
2
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3 蔗抽的利用 、 p H 、电导率和 D 。 的变化
2
.
3
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1 蔗糖的利用 蔗糖的利用可以反映细胞的产量 。 随着培养时间的延长 ,细胞数量不断增加 ,培养
液内蔗糖含量不断减少 (图 2 ) 。 特别是当培养细胞进入对数生长期时,蔗糖利用率迅速增加 ,培养液中
蔗糖含量迅速下降 。 培养 3周后 ,蔗糖浓度为痕量 ,几乎全部被利用 ,此时细胞生长量达到最大 ,细胞停
止生长 ,进入静止期 。
10.(目、。乒。一x裕呻钾1`510-e-月。)ǎ报华祠脚事翻弃
滋月仆丫|叶注江
ǎ,)雪、.旦。自
1 0 15 劝 乃
培养时间 / d
图 2 培养时间和细胞生长曲线、 蔗搪浓度 、 p H 、 电导率 、 D 。 的关系
2
.
3
.
2 培养液 中 p H 的变化 在接种 1周左右 ,悬浮培养细胞的生长速度尚无明显增加 , p H 由 5 . 8 下
降到 4 . 9 。 在对数生长期和直线生长期 p H 下降缓慢 ,细胞生长速度减慢进入静止期 , p H 降至 4 . 6 。 p H
变化的原因 ,可能是由于培养过程中细胞释放酸性物质引起的 ,或是因为培养液中阴阳离子不等量吸收
而引起的 。 然而 p H 的改变并未影响伊贝母悬浮培养细胞的生长 (如图 2 所示 ) 。
2
.
3
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3 电导率的变化 在悬浮培养过程中 ,培养液的电导率不断下降 (图 2) , 电导率的下降证明无机
盐被吸收利用 。通过监测培养液中电导率的变化 ,了解培养过程中无机盐消耗情况 ,对于补料成批培养 ,
由此可确定营养物质合适的添加时间 。
2
.
3
.
4 D 。 的变化 植物细胞为了维持其生理和代谢活性 , 需要进行氧呼吸 ,要求有一定的氧传质速
率 , 因此 , D 。 是直接影响细胞生长的环境因素 , D 。 直接参与细胞消耗底物以及细胞生长所必需的代谢
反应 ,必须把 D 。 看做一种营养源 。 植物细胞悬浮培养用的培养基溶液含有多种盐类和糖类 , 由于盐效
应 ,氧在培养基溶液中的溶解度比其在纯水中的溶解度低 ,一般在 10 m g / L 以下 。 在伊贝母细胞悬浮培
养条件下 ,一个细胞生长周期内 , D 。 由开始培养时的 8 . 6 m g / L 降至 7 . 1 m g / L 。 进入静止期后 , D 。 仍
在下降 ,但变化很小 (图 2 ) 。 这表明由开始培养到静止期这段时间内 ,细胞代谢活动旺盛 ,进入静止期
后 ,细胞的代谢活动比较微弱 。
一 6 5 8 一 西北大学学报 (自然科学版 ) 第 25 卷
2
.
4 生物碱的测定结果
伊贝母鳞基 、愈伤组织和悬浮培养细胞的总生物碱和西贝素含量见表 4。
表 4 生物碱测定结果 (写 )
材料类型
栽培鳞基
愈伤组织
悬浮细胞
材料干重 /g 总生物碱含量 西贝素含量
2
.
0 0
。
1 48
2
。
0 0
.
29 6
0
.
01 4
0
.
038
2
.
0 0
.
3 7 0
.
04 5
通过对 3种伊贝母材料生物碱含量的分析测定 ,说明细胞悬浮培养是生产伊贝母成分的有效手段 ,
肯定了液体悬浮培养的可行性 ,并对培养条件和参数的变化规律作了初步探索 ,为进一步大规模培养提
供了理论和实验依据 。
参 考 文 献
2
3
4
郑光植 . 药用植物组织培养在工业生产上应用研究的进展 . 植物生理学通讯 , 19 80 , (2 ) : l 一 9
郝玉蓉 ,李明世 ,吴跃武 . 伊贝母愈伤组织的诱导和植株再生的研究 . 西北植物研究 , 1 9 82 , 2 ( l ) : 38 一 43
上海植物生理学会 . 植物生理实验手册 . 上海 :上海科技出版社 , 1 9 85 . 13 7~ 138
樊君 . 伊贝母细胞悬浮培养生产生物碱初步研究 : 〔学位论文〕. 西安 :西北大学化工系 , 199 0
A st u d y
o n t h e C e l l S u s P e n s i o n C u l t u r e o f F 行 t订l a 行a
f b l l记汀loar S e h r e n k
F a n J u n l ) z h u s iy i Z ) L i B a o z h a n g l )
( 1 )决 p a r t m e n t o f c h e m i e a l E n g i n e e r in s ; 2 ) eD p a r t m e n t o f B io lo s y , N o r t h w e s t LJ n iv e r s it y ; 7 1 006 9 , iX ` a n )
A b s t r a e t T h e i n f l u e n e e o f i n o e u l a t e q u a n t i t y , e u lt u r e m a n n e r a n d h o r m o n e e o n e e n t r a t i o n o n e e l l
g r o w t h d u r i n g t h e F 护。 t扭l la 尹云a P a l l毖d 坛f l o 尸a S e h r e n k e e l l s u s P e n s i o n e u l t u r e 15 s t u d i e d . C e l l g r o w t h
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一
2 4 d a y s a e e o r i n g t o t h e t e s t
.
T h e r e a s o n fo r v a r i a t i o n s o f p H
, s u e r o s e e o n e e n t r a r i o n
,
e l e e t r i e e o n d u e t io n r a t i o a n d D o a r e a n a l y s e d
.
A l k a l o id 15 e o n t a i n e d i n s u s P e n s i o n e u l t u r e e e l l , a n d i t s
t o t a l a里k a l o i d a n d s i P e im i n e a r e h i g h e r t h a n t h o s e i n s e a l e s t a l k o f s y n t h e t ie e u l t u r e .
K e y wo
r d s F 尹落t石l l a 护云a P a l l坛d 汀10 护 a S e h r e n k ; e e l l s u s P e n s i o n e u l t u r e ; a l k a l o i d