全 文 ：土人参愈伤组织诱导及细胞悬浮培养研究
赵 俊 ,吴虹丽 ,马林＊　(西南科技大学生命科学与工程学院 ,四川绵阳 621010)
摘要　[目的 ]建立土人参愈伤组织的诱导、增殖继代培养及其细胞悬浮培养的技术体系。 [方法]研究不同植物激素组合对叶片 、茎段
愈伤组织诱导的影响;采用液体振荡培养法测定叶片愈伤组织细胞悬浮生长曲线。 [结果]叶片最易诱导产生愈伤组织 ,最佳诱导 、增殖
培养基为 MS+2, 4-D1.0mg/L+NAA0.5mg/L+6-BA0.5mg/L(pH 5.8)。由叶片愈伤组织建立的细胞系生长呈“S”型曲线 ,最适继
代周期为 15d。 [结论]以叶片为外植体经愈伤诱导 、增殖培养可建立良好的细胞悬浮系。
关键词　土人参;愈伤组织;组织培养;细胞悬浮培养
中图分类号　Q813.1+1　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2010)18-09435-03
ResearchonCalusInductionandCelSuspensionCultureofT.paniculatum
ZHAOJunetal　(ColegeofLifescienceandEngineering, SouthwestUniversityofScienceandTechnology, Mianyang, Sichuan621010)
Abstract　[ Objective] Theaimwastoestablishthetechnicalsystemsofcallusinduction, multiplicationsubcultureandthecelsuspension
cultureofT.paniculatum.[ Method] Efectsofdiferentplantgrowthregulatorsoncalusinductionfromleafandstemsegmentwerestudied
Thecelsuspensionculturewasestablishedfromleafcalusesandthegrowthcurvewastestedbyliquidshakeculturemethed.[ Result] Leaf
wastheoptimalexplantforcallusinduction.Theoptimalmediumofmultiplicationsubcultureforleafcalluseswas2, 4-D1.0mg/L+NAA
0.5mg/L+6-BA0.5mg/L(pH5.8).ThecelgrowthofT.paniculatumwith“S” typecurvewasobservedandoptimalsubculturecycleof
suspensioncellwas15days.[ Conclusion] ThecalusinducedfromleafexplantwasexcelentforestablishingcelsuspensionofT.panicula-
tum.
Keywords　 T.paniculatum;Calus;Tissueculture;Celsuspensionculture
作者简介　赵 俊(1985-),男 ,四川巴中人 ,在读硕士 ,研究方向:药用
植物生物技术及天然产物。＊通讯作者。
收稿日期　 2010-03-15
　　土人参 [ Talinumpaniculatum(Jaeq)Gaertn]为马齿苋科
土人参属植物 ,我国南方各地均有栽培或野生。以根入药 ,
具有健脾润肺 、止咳 、调经等功效 [ 1] 。土人参水提取物可诱
导 PC12细胞的分化 ,冉靓等 [ 2]分离纯化得到活性多糖;沈笑
媛等 [ 3]从根中分离出胡萝卜苷 、齐墩果酸 、β-谷甾醇等活性
成分。土人参的组织培养已有原生质体培养再生植株 [ 4] 、单
细胞培养再生植株 [ 5] 、快速繁殖 [ 6-7]等报道 ,但对以种子为
起始材料 ,进而建立细胞悬浮培养系尚未见报道。笔者以土
人参种子材料 ,无菌萌发后进行愈伤组织诱导 、继代增殖培
养及细胞悬浮培养 ,为研究土人参细胞悬浮培养次生代谢产
物奠定了基础 。
1　材料与方法
1.1　材料　野生土人参采自四川省甘孜州康定县 ,由绵阳
师范学院罗明华教授鉴定为 T.paniculatum。材料移栽于花
盆并按常规进行水肥管理 。采集成熟种子作为外植体接种 。
1.2　方法
1.2.1　愈伤组织的诱导。将土人参种子装于 10ml无菌离
心管中 ,用 70%乙醇浸泡 1 min,无菌水冲洗 2次后加入
0.1% HgCl2处理 10 min,无菌水冲洗 5 ～ 6次 ,无菌接种至
MS基本培养基中。待土人参苗培养 1个月后 ,进行愈伤组
织诱导试验 ,将实生苗的叶片剪成 0.5cm见方的小块 ,茎段
剪成 0.5 ～0.8 cm的小段接种至相应单因素及组合试验培
养基中 ,观察愈伤组织诱导及生长情况。
1.2.2　细胞悬浮系的建立。选取继代培养后质地松散 、生
长良好的愈伤组织约 10g,转接于 MS液体培养基中 , 500 ml
三角瓶装量 150 ml。 15 d继代培养 1次 ,继代时用 100目尼
龙网过滤除去大块愈伤组织 ,培养液按照与新鲜培养液 1∶3
的比例进行混合再培养。筛选分散度好 、较均匀 、生长快的
细胞作为种子 ,传代 5 ～6次后得到性能良好的悬浮细胞系 。
生长曲线的测定参照江曙等 [ 8]稍作修改 ,测定细胞鲜重 ,用
250ml三角瓶培养 ,培养液体积为 100 ml。
1.2.3　培养条件。 MS为基本培养基 ,附加不同浓度的 6-
BA、NAA和 2, 4-D,加入 0.8%琼脂和 3%的蔗糖 ,调 pH值为
5.8, 121 ℃、1.05×105 Pa灭菌 20 min。培养温度(25 ± 2)
℃,光照强度:种子萌发及细胞悬浮培养为暗培养 ,种子萌发
后 、愈伤诱导与增殖过程 1 000 ～ 1 500lx,光照时间:12 h/d。
2　结果与分析
2.1　土人参实生苗无菌生长情况　土人参种子无菌接种
至 MS无激素培养基中 ,暗培养 3 d可见种子开始萌发 ,首先
种子膨大 ,后种皮逐渐破裂 ,露出白色胚根。种子萌发后转
到光照强度 1 000 ～ 1 500 lx进行培养 , 7 d可见真叶出现 ,叶
片呈鲜绿色。培养 1个月左右可见小苗长高至 5 ～ 8 cm,叶
片呈绿色 、且肥厚 ,茎段粗壮。剪取叶片和茎段用于愈伤组
织的诱导试验。
2.2　不同激素对外植体愈伤组织诱导的影响
2.2.1　 2, 4-D的诱导效应。由表 1、2可知 , 2, 4-D对土人参叶
片 、茎段愈伤组织诱导效果显著 ,随着激素浓度的增加愈伤组
织诱导率上升。当 2, 4-D浓度为 1.5 ～2 mg/L时 ,茎段愈伤组
织诱导率可达 100%;随着培养时间的延长 ,茎段愈伤组织出现
褐化 、生长势差。2, 4-D诱导产生的叶片愈伤组织为黄白色 、
生长势好 ,随着培养时间延长 ,愈伤组织量不断增大。
2.2.2　 6-BA的诱导效应。由表 1、2可知 , 6-BA对土人参叶
片及茎段愈伤组织诱导效果均不明显 ,当 6-BA浓度为 2.0
mg/L时 ,诱导率最高 ,分别为 50%、54.2%。叶片愈伤组织
为白色 、茎段愈伤组织为浅黄色 ,随着培养时间的延长 ,茎段
愈伤组织轻微褐化。
2.2.3　NAA的诱导效应。由表 1、2可知 , NAA对土人参叶
片及茎段愈伤组织诱导效果较好。叶片愈伤组织为浅黄绿
色 、茎段愈伤组织为浅黄色。当 NAA浓度为 1.5 mg/L时 ,
其对叶片及茎段诱导效果均佳 ,诱导率可达 87.5%、74.1%。
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2010, 38(18):9435-9437 责任编辑　马树梅　责任校对　卢瑶
表 1　 2, 4-D、6-BA、NAA对土人参叶片愈伤组织诱导的影响
Table1　Theefectsof2, 4-D, 6-BA, NAAonthecalusinductionofT.paniculatum
浓度∥mg/LConcentration
2, 4-D
诱导率∥%Inductionrate 生长势Growthvigor
6-BA
诱导率∥%Inductionrate 生长势Growthvigor
NAA
诱导率∥%Inductionrate 生长势Growthvigor
0.5 71.9 +++ 31.3 + 65.6 + +
1.0 93.8 ++++ 43.7 ++ 84.4 +++
1.5 93.8 ++++ 46.9 ++ 87.5 +++
2.0 96.9 ++ 50.0 ++ 75.0 ++
　注:-死亡 , +差, ++一般, +++较好 , ++++旺盛。下表同。
　Note:-standsfordeath;+standsforbadgrowth;++standsforcommongrowth;+++standsforbetergrowth;++++standsforvigorousgrowth.
Thesameasbelow.
表 2　 2, 4-D、6-BA、NAA对土人参茎段愈伤组织诱导的影响
Table2　Theefectsof2, 4-D, 6-BA, NAAonthecalusinductionofT.paniculatumstem
浓度∥mg/LConcentration
2, 4-D
诱导率∥%Inductionrate 生长势Growthvigor
6-BA
诱导率∥%Inductionrate 生长势Growthvigor
NAA
诱导率∥%Inductionrate 生长势Growthvigor
0.5 70.4 ++ 40.7 ++ 63.0 ++
1.0 85.2 ++ 44.4 ++ 70.4 +++
1.5 100.0 ++ 54.2 ++ 74.1 +++
2.0 100.0 + 54.2 + 74.1 ++
2.3　不同激素组合对土人参叶片愈伤组织的诱导效应　茎
段愈伤组织在单因素试验过程中 ,均表现出不同程度的褐化
现象。以单因素为基础 、土人参叶片为材料 ,研究了 NAA+
6-BA、2, 4-D+6-BA及 NAA+2, 4-D+6-BA3种激素组合对
愈伤组织诱导及生长的影响 。由表 3可知 , 3种激素组合均
可诱导出愈伤组织 ,且愈伤诱导率较高。 NAA1.0 mg/L+
6-BA1.0 mg/L、 2, 4-D1.0 mg/L+6-BA0.5 mg/L及 NAA
0.5 mg/L+2, 4-D1.0 mg/L+6-BA0.5 mg/L对土人参叶片
愈伤组织诱导率最高 ,均达到 100%,但产生的愈伤组织颜
色 、质地有差异。NAA+6-BA组合中 ,愈伤组织的颜色为浅
黄绿色 ,结构较为紧密 ,培养后期愈伤组织出现绿色瘤状凸
起 ,并出现芽的分化 ,此愈伤组织适合于植株再生及快速繁
殖 。2, 4-D+6-BA组合中 ,愈伤组织为乳白色 ,疏松 、生长势
好 ,但含水量大。 NAA0.5 mg/L+2, 4-D1.0 mg/L+6-BA
0.5 mg/L组合产生的愈伤组织诱导为浅黄色 ,部分为浅黄绿
色 ,比较其他组合较疏松 、易碎 ,且生长势较好 ,可大量增殖。
此愈伤组织可增殖继代培养后用于细胞悬浮培养。
表 3　不同激素组合对土人参叶片愈伤组织诱导效应
Table3　Theefectsofdiferentcombinationsofhormoneonthecalus
inductionofT.paniculatumleaves
组合∥mg/LCombinations
诱导率 Inductionrate∥%
6-BA
0.5mg/L 6-BA1.0mg/L 6-BA2.0mg/L
NAA0.5 87.5 93.8 62.5NAA1.0 90.6 100.0 65.6
NAA2.0 93.8 90.6 62.5
2, 4-D0.5 90.6 90.6 87.5
2, 4-D1.0 100.0 87.5 96.9
2, 4-D2.0 96.9 93.8 93.8
NAA0.5+2, 4-D0.5 93.8 93.8 87.5
NAA0.5+2, 4-D1.0 100.0 93.8 87.5
NAA1.0+2, 4-D0.5 96.9 87.5 93.8
2.4　愈伤组织继代培养过程中的生长变化　采用 NAA0.5
mg/L+2, 4-D1.0 mg/L+6-BA0.5 mg/L培养基进行愈伤
组织继代培养。继代接种 5 d后发现新的愈伤组织开始生
长 ,新长出的愈伤组织为浅黄色 、较疏松 ,体积增大明显;培
养至 18d左右 ,生长达到最旺盛时期 ,颜色多变为浅黄绿色 ,
有少量白色;培养至 25 d有少部分愈伤组织转变为不同程度
的黄色或褐色。
愈伤组织颜色出现差异的原因可能与愈伤组织的初始
培养基有关 。初始诱导产生的愈伤组织来源于不同外植体 、
培养基激素种类和激素水平 ,愈伤组织在初始培养基中的生
长状态也不相同 ,有可能在继代时得到不同的结果 。
2.5　土人参悬浮细胞培养体系的建立　根据愈伤组织诱导
及继代培养过程的试验结果 ,选择叶片愈伤组织进行细胞悬
浮培养。培养基为 MS+NAA0.5 mg/L+2, 4-D1.0 mg/L+
6-BA0.5mg/L(pH5.8)。继代时过滤除去大的愈伤组织及
细胞团 , 15d继代 1次 ,经过 5代液体摇瓶振荡暗培养 ,筛选
得到均一性好 、生长性能优良的土人参悬浮细胞系 。
2.6　光照和暗培养对土人参悬浮细胞的影响　土人参悬浮
细胞在光照及暗培养条件下的情况如图 1所示。土人参悬
浮细胞在光照及暗培养状态下均生长良好 ,呈 “S”型曲线生
长 , 0 ～ 10 d为延迟生长期 , 10～ 16 d为指数生长期 , 16 ～ 20 d
为稳定生长期(图 1)。悬浮细胞培养继代时宜选择培养 15d
处于指数生长期的悬浮细胞 ,此阶段的细胞生长旺盛 、适应
能力强。光照与暗培养比较来看 ,悬浮细胞在延迟生长期鲜
重差异不大;暗培养下悬浮细胞迅速达到对数生长期后稳定
生长 ,而光照下细胞缓慢进入指数生长期。由此可见 ,土人
参悬浮细胞在黑暗条件下培养 ,生长周期短 ,生长量大 ,暗培
养有利于土人参悬浮细胞的生长 。
3　结论与讨论
利用土人参种子培养无菌苗 ,切取叶片和茎段为外植体
接种在不同的培养基上进行培养。结果表明 ,以叶片为外植
体 , MS+NAA0.5 mg/L+2, 4-D1.0 mg/L+6-BA0.5 mg/L
9436 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2010年
图 1　土人参细胞悬浮培养的生长曲线
Fig.1　GrowthcurveofsuspensionculturecelofT.paniculatum
为诱导培养基可产生浅黄色 、疏松愈伤组织 ,且愈伤诱导率
可高达 100%;经多次继代增殖培养 ,可建立稳定的土人参细
胞悬浮系。光照及暗培养研究表明 ,暗培养有利于土人参悬
浮细胞的生长 。茎段诱导产生的愈伤组织多易褐化 ,具体原
因有待进一步研究。
暗培养条件下 ,土人参悬浮细胞生长较光照好 ,胡海英
等 [ 9]对老瓜头悬浮细胞的研究也表明黑暗条件有利于悬浮
细胞的生长;刘树楠等 [ 10]对长春花 、张泽宏等 [ 11]对丹参悬浮
细胞研究则表明 ,光照有利于悬浮细胞的生长。对于光照对
悬浮细胞的生长是否有利尚无定论 ,这可能与不同材料 、不
同培养状态有关 。而武芸等 [ 12]对五鹤续断 、郭胜娟等 [ 13]对
长春花愈伤组织增殖进行研究 ,结果表明光照促进愈伤组织
的生长 ,这可能由于愈伤组织生长过程中尚存有光合作用的
过程有关。
此外 ,土人参细胞有效药物成分的含量 ,不同培养条件
对悬浮细胞次生代谢产物合成的影响 ,悬浮细胞生物转化天
然产物等研究有待进一步的探讨 。
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(上接第 9405页)
50ml的条件下 ,菌体产量达到最大值。
3　结论
解淀粉芽孢杆菌是一株从土壤中分离的生防细菌 ,其初
步设计的发酵基础培养基成分为水溶性淀粉 、葡萄糖 、棉籽
粉 、酵母浸膏和碳酸钙;初步优化的发酵条件为温度 31 ℃、
转速 180r/min、发酵时间 26h、初始 pH值 6.0、接菌量 1%、
装液量 50 ml/250 ml。其发酵后菌体产量为 46.0×109 /ml,
基本达到了工业规模化生产的要求 。
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