全 文 ：　　　
doi:10.3969 /j.issn.1005-0264.2010.03.013
皂荚提取物对肝癌细胞小鼠 Smad4及 Smad7基因调控的影响＊
杜进军 1　张赤志 2■　许汉林 2　王宏伟 2　费新应 1　李世林 1
1.湖北中医药大学 2007级博士研究生班 (湖北 武汉 , 430061)　2.湖北中医药大学
　　摘　要　目的:研究皂荚提取物对小鼠肝癌细胞 Smad4、 Smad7基因调控的影响。方法:造模采用小鼠右腋皮下
接种肝癌 H22细胞悬液的方法。实验分为阴性对照组 、 皂荚提取物 3个浓度组 (26.0mg/d、 13.0mg/d、 7.8mg/d)和
阳性对照组。每组 10只小鼠。通过实时荧光定量 PCR的方法检测肝组织 Smad4、 Mmad7基因的表达。结果:Smad4、
Smad7基因表达:阳性对照组和皂荚提取物高剂量组与阴性对照组比较 、 皂荚提取物中剂量组和皂荚提取物低剂量组
与阳性对照组比较差异有统计学意义。结论:皂荚提取物能增强 Smad4基因的表达和下调 Smad7基因的表达。
关键词　皂荚;小鼠;肝癌细胞;TGF-β /Smads;信号系统
GleditsiaextractinmicehepatomacelsTGF-β /Smadsregulationofsigna-
lingsystem
DUJIN-JUN1 , ZHANGCHI-ZHI2■ , XUHAN-LIN2 , etal.HubeiUniversityofTraditionalChineseMedicine, DoctoralCoctoral
CandidateGrade2007 (WuhanHubei, 430061)China
Abstract　Objective:TostudytheefectofgleditsiaectractonlivercancercellSmad4, Smad7 geneexpression.Meth-
ods:Modelingusingtherightmouseinoculatedsubcutaneouslywithtumorcelsuspensionmethod.Fiftymiceweredividedinto
firegroups:negativecontrolgroup;gleditsiaextract3concentrations(26.0mg/d, 13.0mg/d, 7.8mg/d)group;positivecon-
trolgroup, 10miceineachgroup.Smad4andSmad7weredetectedgeneexpressionbyRT-PCR.Results:Smad4andSmad7
expression:positivecontrolgroupandgleditsiaextracthigh-dosegroupandnegativecontrolgroup;gleditsiaextractsdose
groupandgleditsiaextractlow-dosegroupandpositivecontrolgrouphadstatisticallsignificant.Conclusion:Thegleditsiaex-
tractcanenhanceSmad4 geneexpressionandreduceSmad7 geneexpression.
KeyWords　gleditsia;mice;liverneoplasmscel;TGF-β /Smads;signalingsystem
　　肝癌是目前世界上第五大常见的实体肿瘤 , 我国每年约
11万人死于肝癌 , 位于恶性肿瘤病死率的第 2位。近年来研
究发现转化生长因子-β (TGF-β)是一种多功能的细胞因子 ,
能够参与调节细胞生长 、 分化和多种细胞凋亡 [ 1] 。研究进一
步提示 TGF-β 信号通路的异常是肝癌发生发展及浸润和转移
的重要因素 [ 2] 。 Smads蛋白是 TGF-β 惟一的作用底物 , 能把
TGF-β 信号从细胞外传递到细胞核的中介分子 , TGF-β /Smads
信号转导通路发生障碍 , TGF-β 介导的抗增殖信号不能正常
下传 , 使细胞生长周期发生紊乱 , 导致细胞持续分裂增殖 ,
肝细胞发生癌变 [ 3] 。
皂荚 (GLelitsiasinensisLam)又名皂角 , 味咸 , 性温 ,
具有 “祛顽痰 , 通窍开闭 , 祛风杀虫” [ 4]的作用。 2005年美
国国立癌症研究所和香港理工大学研究发现 , 皂荚的浓缩液
具有一定的抗癌特性 , 可以有效抑制包括肝癌 、 乳腺癌和前
列腺癌等癌细胞生长 [ 5] 。我们的前期研究工作已经对皂荚进
行了提取 , 已经证实了皂荚提取物对人肝癌细胞 beL-7402
的增殖有显著抑制作用 [ 6] 。本实验通过研究皂荚提取物 (乙
酸乙酯提取)对小鼠肝癌细胞 TGF-β /Smads信号系统调控的
作用机制 , 进一步研究其抗癌作用机制。
1　资料与方法
1.1　材料　
1.1.1　实验动物　昆明种小鼠 50只 , 体重为 (20 ±2)g,
雄性 , 清洁级。华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。
许可证号:SCXK(鄂)2004-0007;质量检测单位:湖北省
·164· 中西医结合肝病杂志 2010年第 20卷第 3期
＊ 基金项目:武汉市科学技术局课题 (200951499481);■通讯作者
实验动物质量检测站 。
1.1.2　药物提取　皂荚提取物由湖北中医药大学药学院制作
并提供。
1.1.3　小鼠肝癌 H22细胞　由华中科技大学同济医学院基础
医学院雷章博士友情提供。
1.1.4　阳性对照药物　金龙胶囊 (北京建生药业有限公司)
购于湖北省中医院药房。
1.1.5　主要试剂及仪器　dNTP、 TaqDNA聚合酶 、 cDNA、 上
下游引物 、 ddH2O等主要试剂均购自上海生工生物工程技术
服务有限公司 , ReverTraAce-α-逆转录试剂盒 、 SYBRGreen
realtimePCRmastermix(TOYOBO公司), TRIzoLReagent、
Reai-timePCRDetectionSystem(SLAN, HONGSHI)。
1.2　方法
1.2.1　H22肝癌细胞的提取与造模方法　收集含有 H22肝癌
细胞的荷瘤小鼠的腹水约 15ml, 经过离心 3次 , 加入生理盐
水调整细胞悬液中的细胞浓度至 4×109 /L[ 7] 。于每只小鼠右
腋下注射 0.2ml肿瘤细胞悬液。
1.2.2　实验分组　24小时后 , 随机 (使用随机数字表)将
小鼠分为 5组:阴性对照组 (溶剂对照组), 皂荚提取物 3个
浓度组 (26.0mg/d、 13.0mg/d、 7.8mg/d), 阳性对照组 (金
龙胶囊组)。每组 10只小鼠 (每组最后取存活的只数为准)。
实验各组每只小鼠灌胃量为 0.4ml/d(按浓度配好)。连续给
药 15天后 , 第 16天颈椎脱臼法处死小鼠 , 进行相关指标的
检测。
1.2.3　设计并合成小鼠肝脏组织 Smad4和 Smad7基因的引物
　引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 , Smad4
上游引物序列为:ACAAGTAACGATGCCTGTCTGAG, 下游引
物序列为:GAGCAAATCCTTTCCGACCAG, 片段长度为 (bp)
244;Smad7上游引物列为:CTCGGTGAAACCCGTCCAT,
下游引物序列为:GAGCAAATCCTTTCCGACCAG;M-ac-
tin下游引物序列为:TAGCCACGCTCGGTCAGG, 片段长度为
(bp)294。
1.2.4　肝脏组织中 RNA的提取　将 100mg肝脏组织加入研
磨器 , 加入 1ml的 TRLzoLRengent研磨 20-30分钟 , 将液体
倒入灭菌后的 EP管内 , 加三氯甲烷 250μl, 上下颠倒充分混
匀 , 静置 5分钟 , 4℃离心 , 13 000rpm, 10分钟;取上清液
500μl于另一灭菌 EP管内 , 加入等量的异丙醇 , 混匀后放入
4℃的冰箱 15分钟后取出 , 4℃离心 , 13 000rpm, 10分钟;
倾倒出上面的液体 , 留在管底的白色沉淀即为 RNA;加入
75%的乙醇 1ml, 4℃离心 , 7 500rpm, 10分钟;将上面的液
体倒出 , 只剩白色沉淀;再瞬时离心 , 尽量吸干管内的液体 ,
晾干 , 再加入适量的去离子水加以溶解。
1.2.5　样品 RNA逆转录为 cDNA　使用逆转录试剂盒
(TOYOBO, 日本), 将样品 RNA逆转录为 cDNA。 逆转录体
系如下:RNA:1μl;5 ×RTBuffer:4μl;dNTP:2μl;OLiga
(dT) 20:1μl;RNasefreeH20: (11-χ);Rnaseinhibitor:
1μl;ReverTraAce:1μl;总体系:20μl。反应条件:42℃,
20分钟※ 95℃, 5分钟※4℃。 -20℃保存。
1.2.6　Real-timePCR扩增　反应体系如下:SYBRGreen
mix:12.5μl;Phssolution: 2.5μl;引物 (5pmol/μl): 2μl;
ddH2O:5.5μl;cDNA(10倍稀释);2.5μl;总体系:25μl。
反应条件:50℃, 2分钟※ 95℃, 2分钟 (95℃, 15秒※退
火 , 15秒※ 72℃, 45秒 ×40个循环)※ 72℃、 10分钟。按
公式:扩增倍数 =2-■■CT, 计算其扩增倍数。
1.2.7　统计学方法　计量资料以均数 ±标准差表示 , 方差齐
性的多组样本间比较用方差分析 , 方差分析两两差异比较用
SNK检验 , 方差不齐和非正态分布的数据采用非参数秩和检
验。统计使用 SPSS11.5软件进行统计学分析。
2　结果
2.1　各组药效对荷瘤小鼠肝脏组织中 Smad4 mRNA表达的影
响　结果见表 1。
表 1　皂荚提取物对荷瘤小鼠肝脏
组织中 Smad4mRNA表达的影响比较 ( x±s)
组别 n(只) 扩增倍数
阴性对照组 7 0.320±0.099##
阳性对照组 10 0.566±0.092＊＊
皂荚提取物高剂量组 6 0.471±0.069＊＊
皂荚提取物中剂量组 8 0.363±0.058##
皂荚提取物低剂量组 9 0.280±0.067##
与阴性对照组比较 , ＊＊P<0.01;与阳性对照组比较 , ##P<0.01
2.2　各组药液对荷瘤小鼠肝脏组织中 Smad7　mRNA表达的
影响　见表 2。
表 2　各组药液对荷瘤小鼠肝脏组织中
Smad7mRNA表达的影响比较 ( x±s)
组别 n(只) 扩增倍数
阴性对照组 7 3.537±0.401##
阳性对照组 10 2.007±0.499＊＊
皂荚提取物高剂量组 6 2.230±0.491＊＊
皂荚提取物中剂量组 8 3.106±0.410##
皂荚提取物低剂量组 9 3.613±0.416##
与阴性对照组比较 , ＊＊P<0.01;与阳性对照组比较 , ##P<0.01
3　讨论
肝癌的发生是一个由多个基因和多种途径相互作用的过
程。 PilsD等 [ 9]人认为 TGF-β信号通过 Smad蛋白在肿瘤发生
中起着核心作用。 Smad4和 Smad7是 Smads蛋白家族的主要
成员 , 它们作为 TGF-β /Smads信号系统转导途径的下游分子 ,
与肝癌的发生和发展的关系非常密切。
Smad4是一种肿瘤抑制基因 [ 9] , Smad4基因突变和表达
下降在人多种肿瘤中得到证实 , 在胰腺癌 、 肝癌 、 结直肠癌 、
胆管癌 Smads基因发生突变和表达异常的频率比较高 [ 10] 。
LengA[ 11]等人认为在肿瘤当中 (下转第 177页)
·165·中西医结合肝病杂志 2010年第 20卷第 3期
因型间差异无显著性意义 , 但 HBVDNA定量及 HBeAg阳性
率 C型均显著高于 B型。提示 C型病毒株致病性 、 复制性可
能增强 , 进一步证实了感染 C型病毒株后更易出现较严重的
肝脏病变。关于 B、 C基因型 HBVDNA水平报道不一致的原
因可能与病例选择 、 药物治疗 、 地区差异有关 , 有待进一步
观察。
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(收稿日期:2010-03-27　编辑:胡肃平)
(上接第 165 页)Smad4 和 Smad7 存在着一种平衡关系。
Smad7基因是 TGF-β 信号转导通路的抑制元件。其表达的增
强 , 影响细胞对 TGF-β 的应答 , 从而促进细胞的恶性进
展 [ 12] 。因此 , 采用有效的方法对肝癌细胞 TGF-β /Smads信号
系统进行有效的调节可能是治疗肝癌的有效的手段。
本课题应用皂荚提取物 , 通过研究其对小鼠肝癌细胞
TGF-β /Smads信号系统中 Smad4和 Smad7基因表达的影响 ,
发现皂荚提取物能增强 Smad4基因的表达和下调 Smad7基因
的表达 , 从而达到抗肿瘤的作用。
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(收稿日期:2010-04-02　编辑:程良斌)
·177·中西医结合肝病杂志 2010年第 20卷第 3期