全 文 ： Marine Sciences / Vol. 37, No. 7 / 2013 13
缺氮条件对栅藻油脂积累与光合作用的影响
刘金丽1, 2, 王俊峰2, 刘天中2, 高莉丽2
(1. 中国海洋大学 食品科学与工程学院, 山东 青岛 266003; 2. 中国科学院 青岛生物能源与过程研究所,
中国科学院 生物燃料重点实验室, 山东 青岛 266101)
摘要: 栅通过油脂分析、光合放氧、叶绿素荧光等手段, 研究了缺氮处理对栅藻(Scenedesmus dimorphus)
油脂含量、油脂组分以及光合作用影响。结果显示, 总脂含量由 22.4%±0.6% 提高到 36.3%±0.7%, 其
中甘油三酯含量由 4.6%±1.2% 提高到 68.3%±2.5% 而磷脂含量由 92.8%±1.6% 降低到 26.8%±2.0%。
缺氮处理 1 d 后, 叶绿素含量明显下降, 呼吸速率明显升高。缺氮处理初始阶段, 栅藻光系统Ⅱ最大光能
转化效率(Fv/Fm)和非光化学猝灭系数(NPQ)维持稳定, 4 d 后 Fv/Fm 显著降低而 NPQ 显著升高。上述变化
可能是光能过剩引起的防御反应, 也可能是自身代谢模式发生转变的结果而与光能耗散无关。
关键词: 栅藻(Scenedesmus dimorphus); 缺氮; 油脂积累; 光合作用
中图分类号: Q945.1 文献标识码: A 文章编号: 1000-3096(2013)07-0013-07
近年来, 可再生能源的研发在全球范围形成持
续热潮。利用微藻生产生物柴油具有不与人争粮、
不与粮争地、不与粮争水、副产物价值高等优势, 是
重要的液体燃料替代形式[1-2]。在适宜条件下, 产油
微藻通常处于营养生长状态, 细胞内脂质含量较低,
且多为极性脂(polar lipid), 如磷脂(phospholipid); 而
在胁迫条件下, 细胞内很快积累大量中性脂(neutral
lipid), 如甘油三脂(triacylglycerol, TAG)。这期间细
胞所经历的生理生化变化是近年来研究的热点。如
Li 等 [3-4] 发 现 抑 制 莱 茵 衣 藻 (Chlamydomonas
reinhardtii)的淀粉合成途径会提高油脂含量 , 表明
在衣藻中脂肪代谢与糖代谢密切相关。Chen 等[5]发
现微拟球藻 (Nannochloropsis)的脂肪酸组成与初始
细胞接种量密切相关, 接种细胞浓度较低时中性脂
含量高 , 而接种浓度较高时极性脂含量较高 , 表明
微藻脂肪酸组分可能与细胞所处光环境有关。
Cakmak等[6]发现缺氮或缺硫都可以提高衣藻的 TAG
含量。 Recht 等 [7]发现缺氮条件下雨生红球藻
(Haematococcus pluvialis)和微拟球藻均会大量积累
油脂, 但它们的糖-脂比例存在不同的变化模式。
栅 藻 (Scenedesmus dimorphus) 属 绿 藻 门
(Chlorophyta)、绿球藻目(Chlorococcales), 是一种常
见的淡水微藻, 广泛分布于湖泊、池塘、沼泽等静水
生境。栅藻是研究水体环境、水体污染、光合作用
的常用材料。同时, 由于其生长快速、能大量合成油
脂, 是典型的产油微藻 [8]。栅藻对环境的适应性强,
耐污染能力强[9], 甚至能在污水、城市生活废水中生
长 [10], 这一特性使其在规模化培养方面较其他微藻
更具优势。有学者研究了栅藻合成虾青素过程的色
素组成和光合作用的变化 [11-13], 但关于其油脂积累
过程的报道还较少。深入了解栅藻的产油过程将有
助于推进利用栅藻生产微藻柴油的研究和应用。本
研究利用栅藻(Scenedesmus dimorphus)为实验材料,
考察了缺氮条件下栅藻的油脂含量和组分变化以及
光合作用的改变。
1 材料与方法
1.1 藻种与培养基
本实验所用栅藻 (Scenedesmus dimorphus)来自
中国科学院青岛生物能源与过程研究所, 所用培养
基为 BG11[14]。栅藻油脂诱导过程采用不含硝酸钠
(NaNO3)的缺氮 BG11 培养基, 其他组分及含量均不
变, 对照组为完全 BG11培养基培养。
1.2 反应器与培养方法
本实验所用反应器为玻璃柱式反应器, 内直径
0.05 m, 柱高 0.55 m, 工作体积 0.9 L。柱式反应器内

收稿日期: 2012-08-30; 修回日期: 2013-01-09
基金项目: 科技部国家科技支撑计划(2011BAD14B01); 中国科学院太
阳能行动计划(KGCX2-EW-309)
作者简介: 刘金丽(1987-), 女, 河北衡水人, 硕士研究生, 主要从事能源
藻类生理学研究, 电话: 0532-80662737, E-mail: liu_jinli_ok@126.com;
王俊峰, 通信作者, E-mail: wangjf@qibebt.ac.cn
14 海洋科学 / 2013年 / 第 37卷 / 第 7期
部有一直径 5 mm 的玻璃通气管。混合有 1.5%
CO2(V/V)的压缩空气(0.1 MPa)以 0.1 vvm的速率通过
通气管从反应器底部鼓泡, 从而将藻液搅动并补充碳源。
培养过程中连续照光, 培养柱表面光强 100 μmol/(m2·s)。
培养温度 25ºC, 培养过程中 pH维持在 7.0~8.0。对照组
(完全 BG11)和实验组(缺氮 BG11)各培养 5支柱子, 测定
其中的 3支, 记为 3个重复。
1.3 生长测定
用质量分析方法测定藻液生物量浓度。将孔径
0.45 µm, 直径 50 mm 的混合纤维素滤膜(上海兴亚
净化材料厂, 上海)煮沸 3次, 并于 105℃热风干燥 24
h 后称重。将一定体积的藻液过滤于滤膜上, 并用 3
倍体积的去离子水冲洗 3 次, 以去掉附着在细胞表
面的盐分, 105 ºC热风干燥 24 h后再次称重。根据两
次质量之差计算出藻液生物量浓度。
叶绿素及类胡萝卜素含量参照甲醇提取叶绿素[15]
的方法。测定甲醇提取液在 666 nm, 653 nm, 470 nm下
的 OD值。根据以下公式分别计算叶绿素 a(Chla), 叶
绿素 b(Chlb), 类胡萝卜素(Car)的含量:
c(Chla) = 15.65 × A666 － 7.34 × A653 (1)
c(Chlb )= 27.05 × A653 － 11.21 × A666 (2)
c(Car )= (1000 × A470 － 2.86 × Chla － 129.2×
Chlb) / 221 (3)
1.4 电镜观察
1.4.1 扫描电镜 (Scanning electron microscopy,
SEM)
取少量藻液于 1.5 mLEP管中离心(5 000 g, 30 s),
去上清, 双蒸水清洗藻渣 3次。加入 1 mL的 2.5%戊
二醛固定 2 h, 然后加 1.5 mL磷酸缓冲液(pH 7.0)清
洗 3次, 每次 10 min。加 1%锇酸固定 1 h。固定完后,
依次用 10%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%(V/V)乙醇脱
水, 每个梯度 15 min。再浸入 100%乙醇脱水 2次, 每
次 10 min, 然后浸入 1:1(V/V)的乙醇-叔丁醇混合液
中 15 min, 再浸入 100%叔丁醇中 2次, 每次 15 min,
最后冷冻干燥。用导电胶带粘于样品台, 喷金后观察
SEM图像。
1.4.2 透射电镜(Transmission electron microscopy,
TEM)
取样固定步骤同 1.4.1。固定后样品用磷酸缓冲
液(pH 7.0)清洗 2 h, 然后依次用 10%, 30%, 50%,
70%, 80%, 90%丙酮脱水, 每个梯度 15 min。之后浸
入 100%丙酮中 3次, 每次 10 min。然后浸入丙酮与
Epon812树脂混合液(V:V = 7:3)中 5 h, 再浸入丙酮与
Epon812 树脂混合液 (V:V = 3:7)中过夜。最后纯
Epon812树脂中浸没 5 h并聚合硬化成包埋块, 超薄
切片机切片, 2%醋酸双氧铀染色 20 min后观察 TEM
图像。
1.5 油脂含量及组分分析
将藻液离心收集后(5 000 g, 30 s), 藻细胞真空
冷冻干燥后研磨成干粉, 依据有机溶剂氯仿-甲醇提
取方法[16]提取藻细胞中的总脂并称重定量。
分析油脂组分及含量用棒状薄层色谱法
(TLC/FID) 来测定。将提取的油脂用氯仿溶解, 取 1 µL
分 4～5 次点样在棒状薄层色谱柱上, 先后在两种展
开剂中展开。展开剂 :Ⅰ苯:氯仿:乙酸 = 50:20:0.75 (V/V),
展开剂 :Ⅱ 苯:己烷 = 1:1 (V/V)。将分离开来的脂质成
分出峰时间与标准样品相对比, 确定其组成及相对
含量。分析过程中的条件控制: 空气流 2 L/min , 氢
气流 0.16 L/min。
1.6 光合放氧速率的测定
使用 Chlorolab-2 液相氧电极(Hansatech, 英国)
测定栅藻细胞在不同光强(PFD)下的放氧速率。将藻
液离心后(5 000 g, 30 s)沉淀用含有 50 mmol/L NaHCO3
的含氮或无氮 BG11重新悬浮, 调整悬浮液叶绿素浓
度至 10 mg/L。将 1 mL悬浮液加入反应杯中, 通入
纯氮气 1 min赶走溶解氧, 打开光源记录放氧速率。
通过加减遮光片数量改变入射光强, 设置的光强梯
度为: 400, 200, 100, 80, 60, 40, 20, 0 μmol/(m2·s)。每
个光强测定 3次, 每次测定前更换新藻液。根据叶子
飘和李进省[17]和 Ye[18]的方法拟合 PFD-放氧速率曲
线, 并计算暗呼吸速率(Rd)、最大放氧速率 (Pmax)、
光补偿点 (LCP) 和光饱和点 (LSP)。
1.7 叶绿素荧光的测定
使用 Imaging-PAM (Walz, 德国) 测定栅藻的最
大光化学效率 ( Fv/Fm ) 和非光化淬灭系数
(Non-photochemical quenching co-efficiency, NPQ)。
将藻液过滤与孔径 0.45 µm的混合纤维素滤膜上, 然
后置于用含 50 mmol/L NaHCO3的含氮或无氮 BG11
培养基润湿的滤纸上。将滤纸连同滤膜一起置于荧光
仪 CCD摄像头下暗适应 15 min。打开测量光, 测定初始
荧光 (F0), 然后加饱和脉冲光 (10 000 μmol/(m2·s)),
测定最大荧光 (Fm), 之后打开活化光 (100 μmol/(m2·s))。
待荧光值稳定后再加一次饱和闪光, 测定实际最大
荧光 (Fm’)。按照如下公式计算相关参数[19]:
Fv/Fm = (Fm−F0)/Fm (4)
Marine Sciences / Vol. 37, No. 7 / 2013 15
NPQ = (Fm−Fm′)/Fm′ (5)
1.8 统计分析
使用 spss10.0 对实验组与对照组做 t 检验, 当
P<0.05 时认为两者存在显著差异。图中数据为 3 次
重复的平均值±标准差。
2 结果
2.1 缺氮处理对栅藻生长的影响
电镜结果如图 1所示, 其中(a)~(c)是扫描电镜结
果, 标尺=3 μm; (d)~(f)是透射电镜结果, 标尺=1 μm;
(a)和(d)是接种初始时结果; (b)和(e)是对照组(高氮)
培养 10 d的结果; (c)和(f)是缺氮培养 10 d的结果; (g)
是(d)图框定区域的放大, 标尺=0.5 μm。SG表示淀粉
粒; TL表示类囊体; LB表示脂肪体。实验开始时栅
藻细胞呈梭形, 并以四连体形式存在(图 1a), 细胞内
可见淀粉粒被类囊体膜包裹, 无脂肪体(图 1d, g)。缺
氮处理 10 d 后, 栅藻细胞四连体解体, 直径明显增
大(图 1c), 细胞壁明显加厚, 细胞内部大量空间被脂
肪滴和淀粉粒填充(图 1f)。高氮条件下(对照组)生长
10 d后细胞形态与初始时变化不大(图 1b), 但细胞壁
明显加厚, 淀粉粒明显增多(图 1e)。

图 1 缺氮处理对栅藻(Scenedesmus dimorphus)细胞形态
和结构的影响
Fig.1 The effect of nitrogen starvation on the morphology
and structure of the Scenedesmus dimorphus
缺氮处理的生物量积累与对照组在前 4 d 差别
不大(P>0.05), 4 d后缺氮处理生物量积累速率减慢并
显著低于对照组(P<0.05)。对照组 10 d 内生物量增加到
(5.8 ± 0.03) g/L, 而缺氮处理组为(4.1 ± 0.04) g/L(图 2)。

图 2 缺氮处理对栅藻(Scenedesmus dimorphus)生长的影响
Fig.2 The effect of nitrogen starvation on the biomass ac-
cumulation of the Scenedesmus dimorphus

随着培养时间延长, 对照组和处理组的单位干
重叶绿素和类胡萝卜素含量都降低, 但缺氮处理降
低的更快(图 3a, 图 3b)。与对照组相比, 缺氮处理组
的类胡萝卜素/叶绿素含量比值在培养过程中逐渐升
高并一直显著高于对照组(P<0.05; 图 3c)。对照组与
处理组的叶绿素 a/叶绿素 b 含量比值差别不大并一
直维持在 2.2~3.1之间(图 3d)。

图 3 缺氮处理对栅藻(Scenedesmus dimorphus)叶绿素和
类胡萝卜素积累的影响
Fig.3 The effect of nitrogen starvation on the accumulation
of chlorophyll and carotenoid in the Scenedesmus
dimorphus
16 海洋科学 / 2013年 / 第 37卷 / 第 7期
2.2 缺氮处理对栅藻油脂积累和油脂组分的
影响
未经缺氮处理的栅藻细胞总脂含量占干重的
(22.4 ± 0.6)%, 其中总脂的(92.8 ± 1.6)%为磷脂(PL),
中性脂(TAG)只占(4.6 ± 1.2)%(图 4)。缺氮处理后栅
藻总脂含量逐渐升高 , 13 d 后总脂含量升高到
(36.3 ± 0.7)%(图 4), 显著高于(P<0.05)对照组的
(30.1 ± 0.7)%; 其中 TAG含量升高到(68.3 ± 2.5)%(图
4), 显著高于(P<0.05)对照组的(37.0 ± 0.1)%; PL含量
降低到(26.8 ± 2.0)%(图 4), 显著低于(P<0.05)对照组
的(55.7 ± 2.4)%。

图 4 缺氮处理对栅藻(Scenedesmus dimorphus)总脂含量
和总脂组分的影响
Fig.4 The effect of nitrogen starvation on the total lipid
content and lipid components of the Scenedesmus
dimorphus
2.3 缺氮处理对栅藻光合作用的影响
缺氮处理使栅藻的暗呼吸速率(Rd)和光补偿点
(LCP)迅速升高, 而对照组在实验过程中维持稳定
(图 5a, d)。随着培养时间的延长, 缺氮处理组和对照
组的最大放氧速率(Pmax)都逐渐降低, 至实验结束时分
别为(37.6 ± 3.6) μmol O2/ mgchl·h 和(75.4 ± 6.4)
μmolO2/ (mgchl·h) (图 5b)。实验开始时, 栅藻的光
饱和点(LSP)为(198.2 ± 6.8) μmol/(m2·s), 之后实验组
和对照组均降低, 到第 13 天时, 缺氮处理组降低到
(94.4 ± 2.1)μmol/(m2·s), 而对照组降低到 (119.7 ±
1.6)μmol/(m2·s)(图 5c)。
培养过程中, 对照组的最大光化学效率(Fv/Fm)
和非光化学猝灭系数(NPQ)基本维持稳定。缺氮处理
1 d 后栅藻 Fv/Fm 即明显低于对照组, 但前 4 d 内
Fv/Fm 一直维持在较高水平(>0.6), 之后开始逐渐下
降, 到第 10 天时已降至 0.4 ± 0.01; 而 NPQ在前 3 d
内较低且维持稳定, 从第 4 天开始逐步升高, 到第
10 天时以升高到 1.5 ± 0.01, 是初始时的 1.8倍(图 6)。

图 5 缺氮处理对栅藻(Scenedesmus dimorphus)光合放氧
参数的影响
Fig.5 The effect of nitrogen starvation on the photosynthetic
oxygen evolution of the Scenedesmus dimorphus


图 6 缺氮处理对栅藻(Scenedesmus dimorphus)最大光化
学效率(Fv/Fm)和非光化学猝灭系数(NPQ)的影响
Fig.6 The effect of nitrogen starvation on the maximum
photo-chemical efficiency (Fv/Fm) and non-photoc-
hemical quenching co-efficiency (NPQ) of Scenede-
smus dimorphus
Marine Sciences / Vol. 37, No. 7 / 2013 17
3 讨论
三脂酰甘油(TAG)是优质的生物能源原料。经过
酯化反应, TAG 中的脂肪酸链可以转化成能完全替
代普通柴油的高热值、低污染的生物柴油, 而剩余的
甘油骨架既是重要的工业原料, 也可以通过进一步
加氢转化成生物乙醇[20]。本研究发现培养 13 d后, 栅
藻的总脂含量达到干重的 36%, 显著高于油料作物
大豆的平 均水平 [21]。这一值 与雨生红 球藻
(Haematococcus)的含油量接近 [7]而低于微拟球藻
(Nannochloropsis)[5]。高含油量, 特别是高中性脂含
量是微藻作为生物柴油原料来源的重要优势。目前,
关于微藻脂肪代谢, 特别是胁迫条件下 TAG 的积累
过程的研究尚不充分[21]。本研究发现缺氮条件下, 随
着TAG含量的升高, 磷脂含量出现相应的下降(图4),
同时细胞内部的膜结构也逐渐减少(图 1f)。据此推测栅
藻细胞内部可能存在将磷脂转化成 TAG的机制。例
如 , 通过磷脂二脂酰甘油酰基转移酶 (Phospholipid
diacylglycerol acyltransferase, PDAT)的磷脂代谢途
径。在高等植物中 PDAT途径广泛存在, 而在微藻中
只存在于少数种类[22-23], 而栅藻中尚未见报道。此外,
胁迫条件下微藻细胞碳源的分配问题一直不太清
楚。Li等[3-4]发现抑制衣藻的淀粉代谢会导致油脂积
累的增加, 说明淀粉合成和油脂合成会竞争碳源。
Recht等[7]发现对于雨生红球藻来说在氮缺乏条件下
存在由淀粉向 TAG 转化的代谢途径 , 而在
Nannochloropsis 中则不存在这样的途径。在本实验
中, 缺氮培养 13 d 后的栅藻细胞中, 除了大量的脂
肪体外, 还存在较多的淀粉粒和较厚的细胞壁(图 1f),
这说明栅藻的大量合成 TAG的过程对糖代谢的影响
较小, 胞外碳源直接流向了能量密度较高的脂肪酸
合成途径。
营养缺乏(特别是氮源缺乏)结合高光强是诱导
微藻合成次生代谢物的常用方法[6-7,24-25]。本研究中,
培养用光强为 100 μmol/(m2·s)左右, 这一光强在实
验初期远低于 200 μmol/(m2·s)的光饱和点(LSP), 即
使在培养后期也仅达到与 LSP 接近的水平(图 5c),
所以栅藻细胞所处的环境只有缺氮胁迫而没有强光
胁迫。与对照组相比, 缺氮处理的栅藻细胞最明显的改
变是叶绿素含量降低而呼吸速率升高, 而且这些变化十
分迅速, 在处理第 1 天即表现出来(图 3a, 图 5a)。
胁迫条件下叶绿素含量快速降低、呼吸速率升高的
现象已经被广泛报道 [ 7 , 1 1 , 2 6 ] , 但多是在强光下
(>300 μmol/(m2·s))或室外(光强>2 000 μmol/(m2·s)的
研究结果。另外, 许多研究表明在胁迫条件下微藻细
胞内的类胡萝卜素含量升高 [6,11-13], 但是本研究中 ,
缺氮胁迫下栅藻细胞内类胡萝卜素含量实在培养过
程中一直在降低(图 3b)。这表明类胡萝卜素(虾青素)
的合成可能需要强光环境。叶绿素荧光参数 Fv/Fm是
反映光系统 II完整性的重要指标[27]。通常情况下, 经
充分暗适应的未受胁迫的绿藻 Fv/Fm 值在 0.7 左右,
受到胁迫后该值降低。Parkhill等[28]发现营养盐的缺
乏对微藻的 Fv/Fm值的影响不明显, 这与本文的结果
不同, 我们发现缺氮处理 1d 后栅藻 Fv/Fm即明显低
于对照组。但同时我们也注意到, 在缺氮处理前期栅
藻光系统Ⅱ并没有受到严重损伤, 4 d之后光系统Ⅱ
的损伤逐步加剧, 类似的情况也表现在最大光合放
氧速率(图 5b)和 NPQ 上(图 6b)。如果说强光条件下
减少叶绿素含量、增大呼吸速率、提高光系统Ⅱ失
活反应中心的比例、提高 NPQ等改变有助于光合系
统减少光能吸收、加快能量耗散, 从而减少过剩激发
能产生的伤害 [18], 那么非饱和光下的类似变化如何
解释？我们给出两种假设: 1)碳同化和氮同化过程是
光合作用产生的能量通汇(ATP)和还原力(NADPH)
的主要流向[29]。氮源缺乏的时候, ATP和 NADPH会
相对过剩, 进而导致光合电子传递链激发能的过度
积累 , 可能会进一步造成光合作用的损伤 , 从而需
要启动上述机制以保护细胞。2)上述生理学变化与光
破坏的防御机制无关, 而是栅藻细胞为了适应缺氮
环境, 将自身代谢模式由先前的营养生长主动转换
到次生代谢物积累的结果, 可能反映了细胞将暂时
无用物质(如氮代谢酶系统)转化为能量储存物质(如
TAG)的过程。
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The effects of nitrogen starvation on lipid accumulation and
photosynthesis of Scenedesmus dimorphus
LIU Jin-li1, 2, WANG Jun-feng2, LIU Tian-zhong2, GAO Li-li2,
(1. College of Food Science and Engineering Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. CAS Key
Laboratory of Biofuels, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of
Sciences, Qingdao 266101, China)
Received: Aug.,30,2012
Key words: Scenedesmus dimorphus; nitrogen starvation; lipid accumulation; photosynthesis

Abstract: The microalga Scenedesmus dimorphus could be potentially used as feedstock for biodiesel production.
However, the changes in photosynthesis during lipid accumulation are still unclear for this organism. Herein, the
effects of nitrogen starvation on the lipid content, lipid component and photosynthesis of Scenedesmus dimorphus
were studied using lipid analyzing, photosynthetic oxygen evolution and chlorophyll fluorescence methods,. The
results showed that the total lipid content was increased from (22.4 ± 0.6)% to (36.3 ± 0.7)% during the nitrogen
starvation, companied by the increase of triacylglycerol from (4.6 ± 1.2)% to (68.3 ± 2.5)% and decrease of phos-
pholipid from (92.8 ± 1.6)% to (26.8 ± 2.0)%. The chlorophyll content was decreased steeply while the respiration
rate was increased after 1 day nitrogen starvation treatment. The maximum photo-chemical efficiency of photosys-
tem (Ⅱ Fv/Fm) and non-photochemical quenching co-efficiency (NPQ) were kept in a stable level during the first
several days of nitrogen starvation, and then Fv/Fm decreased while NPQ increased significantly after 4 days treat-
ment. All these changes in photosynthesis might be due to 1) the defensive reaction against the excess light energy,
or 2) non-related with the energy dissipation but due to the shift from vegetative growth to secondary metabolism.

(本文编辑: 康亦兼)