全 文 ：朱砂七多糖的抗氧化作用研究
王晓梅 1, 2 ,李宗孝 1, 2 ,任莉君1　(1.宝鸡文理学院化学化工系 ,陕西宝鸡 721013;2.陕西省植物化学重点实验室 ,陕西宝鸡 721013)
摘要　[目的 ]考察朱砂七多糖的抗氧化作用。 [方法]分别以 Fenton反应、邻苯三酚自氧化反应为产生羟自由基(·OH)和超氧阴离子
自由基(O2-)模型 ,模拟人体胃液为亚硝化反应的环境 ,用分光光度法测试反应体系中活性氧和亚硝胺类的生成情况。 [结果]朱砂七
多糖浓度为 5mg/ml时 , O2-和·OH清除率最高 ,分别为 63%和 48%,此浓度下其对亚硝酸铵合成的阻断率为 41.27%;当朱砂七多糖浓度为 0.09mg/ml时 ,其对亚硝酸盐的清除率最高 ,为 67.03%。 [结论 ]朱砂七多糖具有较强的抗氧化活性。
关键词　朱砂七多糖;抗氧化;自由基;亚硝胺;亚硝酸盐
中图分类号　S567.2　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2010)34-19346-02
StudyonAntioxidativeActivityofPolysaccharideinPolygonumcilinerve(Nakai)Ohwi
WANGXiao-meietal　 (DepartmentofChemistryandChemicalEngineering, BaojiUniversityofArtsandSciences, Baoji, Shaanxi
721013)
Abstract　[ Objective] ThestudywasdonetoinvestigatetheantioxidativeactivityofpolysaccharideinPolygonumcilinerve(Nakai)ohwi.
[ Methods] Thehydroxylradicals(·OH)andsuperoxideanion(O2 -)wereproducedbyFentonreactionandpyrogalolautoxidationsystemrespectively.Sodiumnitriteandnitrosamineweresynthesizedinsimulatedhumangastricjuice.Reactiveoxygenspeciesandnitrosamineswere
testedbyUVspectrophotometer.[ Results] ThescavengingratetoO2 -and·OHwere63%and48%whenconcentrationofPolygonumcili-nerve(Nakai)ohwipolysaccharidewas5mg/ml, atwhichtheblockingrateofnitrosaminewas41.27%.Thescavengingratetonitritewas
67.03%withPolysaccharideconcentrationof0.09mg/ml.[ Conclusion] Polygonumcilinerve(Nakai)ohwipolysaccharideisendowedwitha
stronganti-oxidation.
Keywords　 Polygonumcillinerve(Nakai)ohwipolysaccharide;Antioxidant;Freeradical;Nitrosamine;Nitrite
基金项目　陕西省教育厅重点实验室基金资助项目(08JZ08);宝鸡文
理学院院级重点项目(ZK0844)。
作者简介　王晓梅(1962-),女 ,陕西宝鸡人 ,博士 ,副教授 , 从事植物
药的基础与应用研究。
收稿日期　 2010-08-23
　　朱砂七为蓼科植物毛脉蓼 [ Plolygonumcilinerve(Nakai)
Ohwi]的块根 ,是 “太白七药 ”之一。其味苦 ,性凉 ,具有清热
解毒 、凉血利咽 、止血止泻 、祛风湿 、强腰膝和抗肿瘤等功效 。
民间主要用于治疗急慢性胃炎 、痢疾 、扁桃体炎 、跌打损伤 、
风湿腰疼 、肝炎 、尿路感染 、外伤出血和肿瘤等 。
自由基是生物体代谢过程中产生的一类具有氧化活性
的带负电的离子 ,其化学性质活跃 ,含量过多会引起机体损
伤 ,从而导致多种疾病的发生。亚硝酸盐普遍存在于人类生
活的环境中 ,亚硝酸根与仲胺在实验室和自然条件下 ,尤其
在胃中均能反应合成 NDMA[ 1] 。NDMA可以将人体血液中
的低铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白 ,降低血液的携氧能
力 [ 2-3] ;还可与 DNA的碱基相互作用 ,导致 DNA的损伤 ,从
而改变 DNA的正常特性和功能 ,进一步使细胞异常生长而
最终形成癌症 。
多糖具有多种生物活性 ,与维持生物机能密切相关 ,其
在抗肿瘤 、抗炎 、抗病毒 、降血糖 、抗衰老和抗氧化等方面发
挥着重要的生物活性 [ 4-5] 。笔者就朱砂七多糖的抗氧化活
性进行了研究与探讨 ,以期为朱砂七药材的开发提供依据。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　研究对象。朱砂七 ,产自秦岭太白山区 ,经陕西中医
学院胡本祥教授鉴定。
1.1.2　主要试剂 。试验所用试剂均为市售分析纯。
1.1.3　主要仪器 。电动离心机 ,由郑州长城科工贸有限公
司生产;UV-2550紫外 -可见分光光度计 ,由日本岛津公司
生产;BS-244-SS电子天平 ,由赛多利斯科学仪器有限公司生
产;DK-98-1型电热恒温水浴锅 ,由天津市泰斯特仪器有限公
司生产 。
1.2　方法
1.2.1　还原力的测定 [ 6-7] 。在 10 ml离心试管中依次加入
1.0ml不同浓度的多糖溶液 、2.5 ml2.5 mol/LPBS缓冲溶
液(pH=6.6)、2.5 ml1% K3Fe(CN)6溶液 , 50 ℃水浴 20
min,用流水快速冷却 ,加入 2.5 ml10%三氯乙酸溶液 ,混匀 ,
于 3 000r/min离心机中离心 10 min。取 2.5 ml上清液 ,依
次加入 2.5ml双蒸水 、0.5ml0.1%FeCl3溶液 ,充分混匀后
静置 10 min,以双蒸水为对照 ,在 700 nm处测定各溶液吸光
度值 ,吸光度值越大 ,还原能力越强。
1.2.2　清除 O2 -的测定 [ 8-9] 。取 3.6 mlpH值为 8.2的 0.1
mol/LTris-HCl缓冲溶液和 4 ml双蒸水 ,混匀 , 25 ℃水浴保
温 20min,立即加入 25℃预热的 3mmol/L的邻苯三酚溶液
0.2ml,迅速摇匀后倒入比色皿 ,在 345 nm处以 Tris-HCl缓
冲溶液和双蒸水为对照 ,每隔 30s测定吸光度值 ,重复 3次 ,
连续测定 5 min,计算线性范围内邻苯三酚自氧化速率。按
上述步骤在加入邻苯三酚前 ,分别加入 1ml不同浓度的多糖
溶液 ,相应减少双蒸水的量 ,同样以 Tris-HCl缓冲溶液和双
蒸水为对照测定各溶液吸光度值 ,根据式(1)计算抑制率。
抑制率(%)=(■A0 /■t-■A/■t)∕(■A0 /■t)×
100 (1)
式中:■A0 /■t为邻苯三酚自氧化反应速率 , ■A/■t为加样
品后邻苯三酚自氧化反应速率。
1.2.3　清除 · OH的测定 [ 10-11] 。在 10 ml试管中依次加入
1.0ml0.75mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液 、2.0 mlPBS缓
冲溶液 (pH=7.4)、1.0 ml双蒸水 、1.0 ml0.75 mmol/L
FeSO4溶液 ,边加边摇匀 ,加入 1.0 ml0.3%的 H2O2 ,于 37 ℃
水浴反应 1h,以缓冲溶液 -双蒸水 (V∶V=1∶2)溶液为对照 ,
在 536 nm处测吸光度值 A损;按上述操作步骤 ,用 1.0 ml双
蒸水代替 H2O2 ,测定吸光度值 A未 ,用不同浓度的多糖代替
责任编辑　刘群燕　责任校对　卢瑶安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2010, 38(34):19346-19347, 19510
1.0 ml双蒸水 ,以样品 -缓冲溶液 -双蒸水(V∶V∶V=1∶2∶3)
溶液为对照 ,测吸光度值 A样 。按式(2)计算清除率。
清除率(%)=[(A样 -A损)/(A未 -A损)] ×100 (2)
式中:A样 、A损和 A未分别为加入样品 、不加样品及不加样品和
H2O2体系的吸光度值。
1.2.4　对亚硝胺阻断率的测定 [ 12-13] 。在 10个 10ml试管中
分别加入 5.0 mlpH值为 3.0的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液 、
0.5ml10-3 mol/L的 NaNO2、1.0ml各浓度朱砂七多糖 ,空白
对照管中加入 0.5ml提取介质和 0.5ml蒸馏水 ,再加入 0.5
ml10-3 mol/L的二甲胺溶液 ,用蒸馏水定容至刻度 , 37 ℃水
浴反应 1 h。
取上述反应液 1.0 ml,置于 7 cm2的玻皿中 ,加入 0.5ml
0.5%的 Na2CO3溶液 ,于暗室中用紫外分析仪照 15 min,紫
外灯离液面 15cm,取出后加入 1.5ml1%的对氨基苯磺酸溶
液 ,再加入 1.5ml0.1%的 α-萘胺溶液 ,加水定容至 5 ml,放
置 15 min,在波长 525 nm下测吸光度值 ,用不加朱砂七多糖
的 0号作空白对照 ,最后根据公式(3)计算阻断率。
阻断率(%)=[(A0 -Ax)/A0 ] ×100 (3)
式中 , A0为不加多糖的 0号的吸光度值;Ax为各组样品的吸
光度值。
1.2.5　对亚硝酸盐的清除率测定 [ 12-13] 。在 10个 10ml试管
中分别加入 1.0 ml各浓度朱砂七多糖 、5.0 mlpH值为 3.0
的柠檬酸钠盐酸缓冲液和 1.0ml5.0μg/ml的 NaNO2溶液 ,
37℃水浴 1h,取出 ,依次加入 2.0 ml0.4%(质量分数)的对
氨基苯磺酸溶液 、1.0 ml0.2%(质量分数)盐酸萘乙二胺溶
液 ,摇匀 ,放置 15min,在 540nm处测吸光度值 ,用不加多糖
的 0号作空白对照 ,按照 “1.2.4”中公式(3)计算清除率。
2　结果与分析
2.1　朱砂七多糖的还原能力　抗氧化物质通过自身的还
原作用给出电子而清除自由基 ,朱砂七多糖具有较强的还原
能力(图 1),且其还原能力随着多糖浓度的增加而增强。
图 1　朱砂七多糖的还原能力
Fig.1　ReducingcapacityofpolysaccharideinPlolygonumcilli-
nerve(Nakai)Ohwi
2.2　朱砂七多糖的抗氧化作用
2.2.1　对 O2-的清除作用。碱性条件下 ,邻苯三酚迅速发
生自氧化 ,生成红色物质 ,同时释放出 O2 -, O2-对自氧化有
催化作用 ,其自氧化速率与 O2 -浓度有关。由表 1可知 ,朱
砂七多糖对 O2 -具有较强的清除作用 ,样品浓度为 5 mg/ml
时 ,清除率最大 ,达 63%,清除率随着样品浓度的增大而
增强。
表 1　朱砂七多糖的抗氧化作用
Table1　AntioxidativeactivityofpolysaccharideinPlolygonumcilli-
nerve(Nakai)Ohwi
朱砂七多糖浓度∥mg/mlConcentrationofpolysaccharide
O2-清除率∥%ScavengingrateofO2-
· OH清除率∥%Scavengingrateof· OH
亚硝胺阻断率∥%Blockingrateofnitrosamine
1 38 27 15.72
2 48 30 32.11
3 56 32 36.24
4 62 45 37.5
5 63 48 41.27
2.2.2　对·OH的清除作用。由表 1还可知 ,朱砂七粗多糖
对邻二氮菲 -金属铁离子 -H2O2体系产生的· OH有一定
的清除作用 ,且随着其浓度的增加清除率也上升。当浓度在
5mg/ml时清除率最高 ,达 48%。
2.2.3　对亚硝酸盐的清除作用。亚硝酸盐在弱酸性条件
下 ,与对氨基苯磺酸重氮化后 ,再与盐酸萘乙二胺偶合生成
红色化合物。由图 2可知 ,朱砂七多糖对亚硝酸的清除率总
体趋势是随朱砂七多糖的浓度增大而升高。当朱砂七多糖
浓度为 0.09 mg/ml时 ,清除率最大 ,为 67.03%。
图 2　朱砂七多糖对亚硝酸盐的清除能力
Fig.2　ScavengingcapacityofpolysaccharideinPlolygonumcil-
linerve(Nakai)Ohwitonitrite
2.2.4　朱砂七多糖对亚硝胺合成的阻断作用。在模拟人体
胃液条件下 ,二甲胺与亚硝酸钠在 37 ℃生成二甲基亚硝胺 ,
反应式如下:
(CH3 )2 NH+NaNO2 +HCl※(CH3 )2N-N=O+NaCl
+H2O
当在朱砂七多糖中依次加入亚硝酸钠与二甲胺时 ,多糖
优先同亚硝酸钠作用 ,使二甲胺不能与亚硝酸钠反应 ,达到
阻止亚硝胺生成的目的。在紫外光照射下 ,二甲基亚硝胺可
分解成二甲基仲胺和亚硝酸根 ,反应式如下:
H2O+(CH3)2N-N=O紫外光 (CH3)2NH2+ +NO2 -
亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后 ,再与 α-萘胺偶合生
成紫色化合物。由表 1可知 ,朱砂七多糖对亚硝胺合成的阻
断率总体趋势是随朱砂七多糖的浓度增大而升高。当朱砂
七多糖浓度为 5 mg/ml时 ,阻断率最大 ,为 41.27%。
3　结论与讨论
朱砂七多糖具有较强的抗氧化活性 ,对 O2 -、·OH和亚
硝酸盐均具有较强的清除作用 ,能有效地阻断亚硝胺的合
(下转第 19510页)
1934738卷 34期　　　　　　　　　　　　　　　　王晓梅等　朱砂七多糖的抗氧化作用研究
图 1　分离菌株 H1的菌落形态
Fig.1　MorphologyofisolatesH1
注:1, 2为分离菌株 H1;M为 DL2000DNAMarker。
Note:1and2refertoisolatesH1;MisDL2000DNAMarker.
图 2　致病性嗜水气单胞菌 H1的 PCR扩增产物
Fig.2　PCRproductsofpathogenicAeromonashydrophilaH1
PCR检测方法成功建立。
3　讨论
嗜水气单胞菌的基因型具有多样性 ,其毒力因子的基因
差异也很大 ,所产生的毒素因子有差别 [ 8-10] 。嗜水气单胞菌
的致病性与其产外毒素(肠毒素 、溶血素 、细胞毒素等)的能
力有很大关系 ,这些毒力因子虽名称各异 ,但在基因结构上
具有较高的同源性 ,可以认为是同一类毒素 [ 5 , 11] 。气溶素是
嗜水气单胞菌重要的致病性因素 ,具有种属特异性 ,目前国
际已逐渐公认其为嗜水气单胞菌的毒力因子 ,具有菌种特异
性 [ 12-13] 。
在体外培养的条件下 ,细菌可能丢失产毒素的能力 ,所
以用常规方法检测毒素时 ,容易漏检 ,而用 PCR直接检测气
溶素基因 ,可增加检测的可靠性。PCR反应的关键在于选择
特异性强又能代表所检验种属的靶基因。研究发现 ,气溶素
基因与其他细菌毒素基因无同源性 ,是一种特异性的基因 ,
广泛分布于不同宿主的嗜水气单胞菌中。PCR法敏感 、特异
性强 、操作简单 ,可用于嗜水气单胞菌毒素基因的检测。
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(上接第 19347页)
成 ,从而保护生物体免遭上述有害物质的损伤 ,在防治肿瘤
方面有重要意义 ,同时也通过自身所具有的较强的还原能力
对细胞 、核酸 、蛋白质及酶类起到保护作用。
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19510 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2010年