全 文 ：第 5 期
收稿日期：2009－01－13
基金项目：国家自然科学基金项目（30871726，30800885）；国家“863”计划项目（2006AA100109）；教育部博士点基金项目（20070022009）
作者简介：丁 焱（1979－），内蒙古巴彦淖尔人，博士研究生，研究方向为植物遗传育种，（电话）13693313344（电子信箱）dd－yan＠163．com；
通讯作者，戴思兰，教授，博士生导师，（电子信箱）silandai＠gmail．com；通讯作者，马月萍，博士，（电子信箱）mypluna＠sina．com。
第 48 卷第 5期
2009 年 5月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 48 No.5
May．，2009
甘菊 （Dendranthema lavandulifolium Fisch． ex
Trautv Ling et Shih var．）又名岩香菊，为菊科菊属
甘菊系多年生草本植物［1］。 其花果期在 5～11 月，黄
色的头状花序潇洒美丽，夏秋间点缀山坡林畔颇有
野趣，可作为地被植物在园林中应用。 由于其生育
期较短，繁殖容易，作为二倍体，遗传背景相对简
单，又是栽培菊花的近缘野生种之一［2］，因而是研究
菊属植物进化的理想材料，具有开发为菊属植物基
因表达研究的模式材料的潜在价值。 对甘菊进行遗
传转化研究，不仅可以为菊花的转基因育种奠定技
术基础，也可以为菊属植物基因表达调控研究提供
参考资料。 成功的遗传转化不仅要有稳定的植物再
生体系，也需要转化的植物材料对选择性的抗生素
敏感。 目前已有对菊科向日葵和一些菊花品种的遗
传转化研究［3－7］，但尚未见甘菊遗传转化的相关报道。
为此，本研究在建立了甘菊再生体系的基础上［8］，进
行了甘菊的抗生素敏感性试验，旨在确定甘菊对抗
生素种类和临界的耐受浓度，以达到有效淘汰非转
化植株的目的，为开展转基因育种研究奠定基础。
1 材料与方法
1．1 试材和药剂
试验所用甘菊由北京林业大学园林学院提供，
选择再生能力较强、性状稳定的甘菊单株系无菌苗
做试验材料。 潮霉素（Hygromycin，Hyg）由 ROCHE
公司生产 ， 购自欣经科生物公司 ， 卡那霉素
抗生素对甘菊愈伤组织诱导和植株再生的影响
丁 焱 1，马月萍 2，戴思兰 1
（1．北京林业大学园林学院，北京 100083；2．东北大学理学院，沈阳 110004）
摘要：以甘菊叶片为外植体，尝试不同浓度羧苄青霉素（Carb）、卡那霉素（Kan）和潮霉素（Hyg）对甘菊愈
伤组织诱导和植株再生的影响。 结果表明，潮霉素和卡那霉素都对愈伤组织诱导有抑制作用；对不定芽
分化而言，以潮霉素和卡那霉素作为抗性筛选标记时，选择压都以 5 mg·L－1为宜。 羧苄青霉素的抑菌效
果较好，质量浓度应在 300～500 mg·L－1范围；潮霉素 3 mg·L－1、卡那霉素 20 mg·L－1为合适的转化植株生
根培养的抗生素临界浓度。
关键词：甘菊；抗生素；愈伤组织诱导；植株再生
中图分类号：S682．1＋1；R978．1；Q943．1 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2009）05－1039-03
Effect of Antibiotics on the Induction and Regeneration of
Dendranthema lavandulifolium Callus
DING Yan1，MA Yue－ping2，DAI Si－lan1
（1． College of Landscape Architecture， Beijing Forestry University，Beijing 100083，China；
2． College of Sciences， Northeastern University， Shenyang 110004，China）
Abstract：Susceptibility of different cultivars on Dendranthema lavandulifolium to antibiotics（Hygromycin，Kanamycin and Car-
benicillin）was studied． The critical concentration for shoot regeneration of Dendranthema lavandulifolium was 5 mg·L－1 Hyg or
5 mg·L－1 Kan． Carb had no apparent influence on callus， but when Carb concentration was over 300 mg·L－1， the inhibiting
effect was observed． Kan 20 mg·L－1 or Hyg 3 mg·L－1 should be selected as ideal screening mass－concentration at the stage of
plantlets＇ root－growth．
Key words：Dendranthema lavandulifolium； antibiotics； callus induction； regeneration
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2009.05.061
湖 北 农 业 科 学 2009 年
（Kanamycin，Kan）、羧苄青霉素（Carbenieillin，Carb）
购自北京拜尔迪生物技术有限责任公司；其他试剂
为国产分析纯，购自北京生化试剂公司。 母液配置
按照 Sambrook［9］的方法进行。
1．2 培养基
植物抗生素筛选试验的基础培养基分别是：①
分化培养基，MS＋6－BA 1 mg·L－1＋NAA 0．2 mg·L－1；
②生根培养基，1 ／ 2 MS＋NAA 0．1 mg·L－1。 所有培养
基均附加 30 g·L－1 蔗糖、6．0 g·L－1 琼脂固化，pH 为
5．8。 再生培养均在暗培养条件下进行；生根培养在
1 500－2 000 Lx、每天 16 h光照下培养。 环境温度为
（25±2）℃［8］。
1．3 抗生素敏感性试验
取生长 20～25 天的甘菊无菌苗中上部充分展
开、生长健壮、均匀一致的幼嫩叶片，切成边长约
0．8 mm 的叶片，接种于含不同浓度抗生素（表 1）的
分化培养基（MS＋6－BA 1mg·L－1＋NAA 0．2 mg·L－1）上，
每处理接种 10块外植体，重复 3次。 20天后观察不
同抗生素对菊花叶片再生的影响， 继代后 20 天观
察对甘菊分化的影响。 确定菊花叶片对不同抗生素
的敏感性，并根据不同浓度抗生素对叶片再生率的
抑制程度，确定甘菊遗传转化的临界耐受浓度。
取生长均匀一致的长 1．5 cm 的甘菊无菌苗茎
段，接种到添加不同浓度的卡那霉素或潮霉素（表
2）的生根培养基中，每处理接种 10 个茎段，3 次重
复。 观察茎段展叶、生根的情况。
2 结果与分析
2．1 抗生素对甘菊叶盘愈伤组织形成和不定芽分
化的影响
从表 3 中看出，未加抗生素的对照（CK）中，甘
菊叶盘的出愈率为 96．67％～100％， 分化率为 70％～
86．67％。 随着潮霉素浓度的升高，叶盘的成活率也
不断下降， 同时叶盘的出愈率和分化率迅速下降，
在 5 mg·L－1潮霉素处理下，没有分化芽产生；在 15
mg·L－1 潮霉素处理下， 叶盘完全无法产生愈伤组
织； 在 20 mg·L－1潮霉素处理下， 叶盘已完全死亡
（图 1）。在 5 mg·L－1卡那霉素处理下，叶盘只产生少
量的愈伤组织，完全不能分化，在 10 mg·L－1卡那霉
素处理的分化培养基中，叶盘已经没有愈伤组织产
生（图 2）。 考虑到叶盘要在含抗生素的培养基中长
期生长，选择 5 mg·L－1潮霉素作为合适的转化抗生
素筛选浓度，合适的卡那霉素筛选浓度为 5 mg·L－1。
另从表 3 中可知，300 mg·L－1以上的羧苄青霉素会
对叶片的成活率有影响，使叶片再生率下降。
2．2 抗生素对甘菊生根的影响
随着潮霉素和卡那霉素浓度的升高，无菌苗的
生根率也不断降低， 在 3 mg·L－1潮霉素处理下，生
根率只有 10％（表 4）。在 5 mg·L－1潮霉素处理下，无
菌苗已不能生根。 表明甘菊生根对潮霉素很敏感，
所以，选择 3 mg·L－1潮霉素浓度作为合适的甘菊转
表 1 分化培养基中不同抗生素质量浓度
抗生素
卡那霉素
潮霉素
羧苄青霉素
0
0
0
1
3
100
3
5
200
5
10
300
10
15
400
20
20
500
质量浓度/mg·L-1
表 2 生根培养基中不同抗生素质量浓度
抗生素
卡那霉素
潮霉素
0
0
5
1.5
10
3
20
5
40
10
60
20
质量浓度/mg·L-1
表 3 抗生素对甘菊叶盘愈伤组织形成和不定芽分化的影响
抗生素
卡那霉素
潮霉素
羧苄青霉素
质量浓度/mg·L-1
0
1
3
5
10
20
0
3
5
10
15
20
0
100
200
300
400
500
成活率/%
100
86.67
46.67
20.00
10.00
0
100
90.00
56.67
20.00
10.00
0
100
100
100
100
93．33
93．33
出愈率/%
100
80.00
43.33
20.00
0
0
100
86.67
50.00
16.67
0
0
96．67
96．67
96．67
90.00
86.67
86.67
分化率/%
80.00
33.33
10.00
0
0
0
70.00
23.33
0
0
0
0
86.67
90.00
86.67
80.00
66.67
63.33
A～F 依次为潮霉素浓度 0、3、5、10、15、20 mg·L－1
图 1 不同潮霉素浓度对甘菊叶盘分化的影响
A B C D E F
1040
第 5 期
化植株生根培养的抗生素筛选浓度。 卡那霉素对甘
菊生根的影响相比潮霉素要较轻一些，在 20 mg·L－1
卡那霉素浓度下， 生根率只有 10％， 而且只有 1～2
条很短的根，基本上丧失了生根和成活的能力。 所
以，转化植株生根培养时，合适的抗生素临界浓度
为潮霉素 3 mg·L－1、卡那霉素 20 mg·L－1。
3 讨论
Teixeira da Silva 等 ［10］检验了多种抗生素对菊
花薄细胞层（TCLs）再生的影响，发现抗生素对菊花
外植体和再生组织（愈伤组织和芽）的遗传稳定性
影响不大，没有发生染色体倍性的改变，对菊花的
营养生长和开花习性的影响也不大；但抗生素对菊
花外植体的分化、不定芽的诱导有抑制作用［6］。有研
究表明，低水平的选择压可以产生更多的转化体，但
同时也使许多非转化体逃脱了选择而分化再生［11］。
卡那霉素是目前植物转化中用得最多的一种
抗生素，其主要通过破坏植物的光合作用系统而达
到选择的目的。 已成功地应用于拟南芥、马铃薯、西
红柿、大豆、向日葵、棉花、烟草、菊花等几十种双子
叶植物以及玉米等少数单子叶植物中［12］。 以往的研
究认为，不同的菊花品种对卡那霉素的抗性差异较
大，大多在 10～50 mg·L－1之间。 Ledger等［4］和 Urban
等 ［13］报道了部分卡那霉素菊花抗性芽在含有卡那
霉素的培养基上不能生根的情况，其假设有 2 种原
因， 一是 NPTⅡ基因的瞬时表达能提供暂时保护，
使部分非转化芽得以再生； 二是 T－DNA 已经整合
到再生芽的细胞中，起初有所表达，后来沉默。 而潮
霉素竞争植物叶绿体和线粒体中的核糖体与因子
EF－2的结合位点，因而使肽链延伸受到了抑制［12］。
本研结果表明，卡那霉素和潮霉素强烈抑制了
甘菊叶片不定芽的分化。 3 mg·L－1的卡那霉素就对
甘菊叶片的分化产生显著的影响。 对不定芽分化来
说， 以潮霉素和卡那霉素作为抗性筛选标记时，选
择压都以 5 mg·L－1为宜。 另外，甘菊不定芽对潮霉
素的反应更加敏感，3 mg·L－1 潮霉素即可实现理想
的筛选效果。 而 20 mg·L－1的卡那霉素才能完全抑
制甘菊的无菌苗生根。 通常羧苄青霉素做抑菌素
时，合适的浓度范围在 100～500 mg·L－1，本研究与之
吻合，试验中，300 mg·L－1以上的羧苄青霉素会使叶
片再生率有所下降。 所以，羧苄青霉素浓度在 300～
500 mg·L－1范围是甘菊转化植株抑菌的合适浓度。
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A～F 依次为卡那霉素浓度 0、1、3、5、10、20 mg·L－1
图 2 不同卡那霉素浓度对甘菊叶盘分化的影响
A B C
D E F
（责任编辑 王 珞）
表 4 抗生素对甘菊生根的影响
抗生素
卡那霉素
质量浓度
mg·L-1
0
5
10
20
40
生根率
%
100
100
53.33
10.00
0
抗生素
潮霉素
质量浓度
mg·L-1
0
1.5
3
5
10
20
生根率
%
100
43.33
10.00
0
0
0
丁 焱等：抗生素对甘菊愈伤组织诱导和植株再生的影响 1041