全 文 ：３１卷０７期
Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．０７
草　业　科　学
ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ
１２８３－１２８９
０７／２０１４
ＤＯＩ：１０．１１８２９＼ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－０６２９．２０１３－０６８４
甘菊ＣＢＬ基因的克隆与表达分析
董凤丽１，２，刘 杰１，黄 河３，张 蜜３，周蕴薇１，戴思兰３
（１．东北林业大学园林学院，黑龙江 哈尔滨１５００４０；２．黑龙江生态工程职业学院，黑龙江 哈尔滨１５００２５；
３．北京林业大学园林学院，北京１０００８３）
摘要：基于已建立的甘菊ＥＳＴｓ文库，检索到了ＣＢＬ基因４个不同的ＥＳＴ序列；采用ＲＡＣＥ技术获得了它们的全
长序列，并命名为ＣｌＣＢＬ１－４。将甘菊（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ　ｌａｖａｎｄｕｌｉｆｏｌｉｕｍ）ＣｌＣＢＬ与拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉ－
ａｎａ）的ＣＢＬ进行多重序列比对发现，它们都含有４个结合钙离子的ＥＦ－ｈａｎｄ结构域，且ＣｌＣＢＬ１在 Ｎ端有一个
豆蔻酰化序列（ＭＧＣＸＸＳＫ／Ｔ）。采用ＲＴ－ＰＣＲ技术，分析了甘菊中ＣＢＬ基因的表达与不同逆境胁迫的关系，表
明甘菊ＣＢＬ基因的表达在冷、干旱、热、盐及 ＡＢＡ胁迫中可被不同程度地诱导，而在非逆境胁迫条件下，甘菊
ＣＢＬ基因在根、茎、叶及花等不同器官中均有表达，且表达量相对一致。这些结果说明该家族基因参与了植物非
生物逆境胁迫的抵御。
关键词：甘菊；ＣＢＬ基因；基因克隆；表达分析
中图分类号：Ｓ５６７．９０３；Ｑ９４３．２　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１００１－０６２９（２０１４）０７－１２８３－０７＊
Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＣＢＬｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍＣｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ　ｌａｖａｎｄｕｌｉｆｏｌｉｕｍ
ＤＯＮＧ　Ｆｅｎｇ－ｌｉ　１，２，ＬＩＵ　Ｊｉｅ１，ＨＵＡＮＧ　Ｈｅ３，ＺＨＡＮＧ　Ｍｉ　３，ＺＨＯＵ　Ｙｕｎ－ｗｅｉ　１，ＤＡＩ　Ｓｉ－ｌａｎ３
（１．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌａｎｄｓｃａｐｅ　Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ　１５００４０，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ　Ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｔｒａｉｎｉｎｇ　Ｃｏｌｅｇｅ，Ｈａｒｂｉｎ　１５００２５，Ｃｈｉｎａ；
３．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌａｎｄｓｃａｐｅ　Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００８３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｆｏｕｒ　ＥＳＴｓ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ＣＢＬｆｒｏｍＣｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ　ｌａｖａｎｄｕｌｉｆｏｌｉｕｍ ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｉｎ　ｏｕｒ　ｐｒｅｖｉｏｕｓ
ｓｔｕｄｙ．Ｆｏｕｒ　ＣＢＬｇｅｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍＣ．ｌａｖａｎｄｕｌｉｆｏｌｉｕｍａｎｄ　ｎａｍｅｄ　ａｆｔｅｒ　ＣｌＣＢＬ１－４　ｕｓｉｎｇ　ＲＡＣＥ
ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ａｎｄ　Ｃ．ｌａｖａｎｄｕｌｉｆｏｌｉｕｍＣＢＬ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ　ｔｈａｔ　ａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＣｌＣＢＬ１－４　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｃｏｄｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｃｏｎｔａｉｎｅｄ　ｆｏｕｒ　ＥＦ－ｈａｎｄ　ｍｏｔｉｆｓ
ａｎｄ　ｔｈｅ　ＣｌＣＢＬ１　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｄｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｈａｄ　Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｉｏｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｏｆ
ＣｌＣＢＬｓ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｕｎｄｅｒ　ｓａｌｔ，ｄｒｏｕｇｈｔ，ｃｏｌｄ，ｈｅａｔ　ａｎｄ　ＡＢＡ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ　ａｓ　ｗｅｌ　ａｓ　ｕｎｄｅｒ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｄｉｆ－
ｆｅｒｅｎｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｓｔａｇｅｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ　ｔｈａｔ　ＣｌＣＢＬｓ　ｍｉｇｈｔ　ｐｌａｙ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅｓ　ｉｎ　Ｃ．ｌａｖａｎｄｕｌｉｆｏｌｉ－
ｕｍ’ｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｔｏ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ　ｂｅｃａｕｓｅ　ＣｌＣＢＬｓ　ｃａｎ　ｂｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｕｎｄｅｒ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ　ｌａｖａｎｄｕｌｉｆｏｌｉｕｍ；ＣＢＬｇｅｎｅｓ；ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：ＺＨＯＵ　Ｙｕｎ－ｗｅｉ　Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｌｚｈｙｗ＠１２６．ｃｏｍ
ＤＡＩ　Ｓｉ－ｌａｎ　Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｉｌａｎｄａｉ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
　　植物在生长发育过程中经常受到低温、干旱、
盐碱等各种非生物胁迫，因此在长期进化过程中
植物形成了一套复杂的逆境信号应答网络。研究
表明，Ｃａ２＋作为第二信使，在逆境胁迫应答信号转
＊ 收稿日期：２０１３－１２－１１　　接受日期：２０１４－０４－１８
基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金（ＤＬ１３ＣＡ１４）
第一作者：董凤丽（１９７８－），女，黑龙江泰来人，副教授，博士，主要从事园林植物种质资源研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｋｕｅｒ－ｌｉ＠１２６．ｃｏｍ
通信作者：周蕴薇（１９７０－），女，吉林九台人，教授，博导，博士，主要从事园林植物种质资源研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｌｚｈｙｗ＠１２６．ｃｏｍ
戴思兰（１９６２－），女，北京人，教授，博导，博士，主要从事花卉分子生物学研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｉｌａｎｄａｉ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ（Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．０７） ０７／２０１４
导过程中起到重要的作用［１］。不同逆境胁迫诱发
的钙信号具有特异性，可被其下游相应的钙结合
或传感蛋白感知和转导，从而在细胞内引起一系
列的生理生化和分子反应，使植物能够适应或抵
抗不良环境［２］。
类钙调磷酸酶Ｂ蛋白（Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ　Ｂ－ｌｉｋｅ　Ｐｒｏ－
ｔｅｉｎｓ，ＣＢＬｓ）是植物中重要的钙信号感受蛋白。它
们的结构相对保守，具有４个可结合Ｃａ２＋的ＥＦ－
ｈａｎｄ结构域，其中部分成员的 Ｎ端还含有一个与
膜结 合 及 蛋 白 互 作 有 关 的 豆 蔻 酰 化 序 列
（ＭＧＣＸＸＳＫ／Ｔ）［３－４］。Ｃａ２＋ 可与 ＣＢＬ中 ＥＦ－ｈａｎｄ
结构域结合，引发ＣＢＬ蛋白质构象的变化，来激活
该蛋白，从而与下游的靶蛋白ＣＩＰＫ（ＣＢＬ－ｉｎｔｅｒａｃ－
ｔｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｋｉｎａｓｅｓ）相互作用。ＣＢＬ感受蛋白与
其相互作用的蛋白激酶ＣＩＰＫ构成ＣＢＬ－ＣＩＰＫ信
号系统将信号向下游传递［５］。一个ＣＢＬ可以和几
个ＣＩＰＫ发生互作，而一个ＣＩＰＫ也可以和一个或
几个ＣＢＬ发生互作，从而组成多条信号传递的通
路。不同逆境或逆境的不同程度可以通过不同信
号支路途径向下游传递，引起与逆境因子相应的
转录因子和功能基因表达，从而调节细胞来适应
和抵抗外来逆境［４］。现已经在拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｔｈａｌｉａｎａ）、水稻（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ）和杨树（Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｔｒｉ－
ｃｈｏｃａｒｐａ）中各发现１０个ＣＢＬ基因［４］，另外在高
粱（Ｓｏｒｇｈｕｍ　ｂｉｃｏｌｏｒ）（６个ＣＢＬ）、葡萄（Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆ－
ｅｒａ）（８个ＣＢＬ）、苔鲜（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ　ｐａｔｅｎｓ）（４
个ＣＢＬ）、蕨类（Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ　ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉ）（４个
ＣＢＬ）等植物体内都有关于ＣＢＬ成员的报道［６］。
植物中ＣＢＬ 基因可响应不同的胁迫刺激，有研
究［７］表明，拟南芥中ＡｔＣＢＬ１ 基因在干旱、盐、冷、
ＡＢＡ 及伤害胁迫下被诱导表达，而 ＡｔＣＢＬ２ 和
ＡｔＣＢＬ３受光照诱导表达［８］。拟南芥ＡｔＣＢＬ９ 基
因的功能缺失突变体对 ＡＢＡ胁迫表现出超敏感
性，说明该基因参与了 ＡＢＡ的应答途径［９］。最近
研究发现，ＣＢＬ１／ＣＢＬ９－ＣＩＰＫ２３调控质膜上的 Ｋ＋
运输器ＡＫＴ１活性，在拟南芥耐低Ｋ＋胁迫中起重
要作用［１０］。
甘菊（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ　ｌａｖａｎｄｕｌｉｆｏｌｉｕｍ）是菊
科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）菊属的二倍体植物，是栽培菊花近
缘种［１１－１２］，具有分布广泛、抗逆性强等特点，是近年
来园林盐碱地上新引入的绿化观赏植物之一［１３］。
本研究以已获得的甘菊ＣＢＬ基因的ＥＳＴ为模板，
利用ＲＡＣＥ技术克隆得到４个甘菊ＣＢＬ基因，并
分析它们在多种逆境胁迫下的表达方式，以期为深
入研究其功能提供基础，也为菊花抗逆性分子育种
提供参考基因资源。
１　材料与方法
１．１　甘菊培养和处理
将甘菊播种到草炭∶蛭石为１∶１的基质中，于
１４ｈ／１０ｈ（长日照／黑暗）、光照度２　５００ｌｘ人工气候
室内培养［培养温度（２３±２）℃，湿度６０％～８０％］。
待甘菊生长至８～１０片真叶时，进行胁迫处理：将甘
菊植株从容器中取出，用蒸馏水洗去根部基质，放置
在润湿的脱脂棉中２、１２、２４ｈ模拟干旱胁迫；使用
２００ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＮａＣｌ溶液浇灌甘菊１２、２４ｈ模拟
盐胁迫；将植株置于４℃培养箱中处理２、１２、２４ｈ
模拟冷胁迫；将植株置于４０℃培养箱中处理１２、２４
ｈ模拟热胁迫；用２００μｍｏｌ·Ｌ
－１　ＡＢＡ溶液喷施甘
菊叶片处理１２、２４ｈ，进行 ＡＢＡ诱导；以未进行任
何胁迫处理的甘菊植株作为对照。取非胁迫处理的
甘菊植株中部叶片、茎段、根系及开放的花序，用于
测定ＣｌＣＢＬ基因在不同器官中的表达；取对照和各
种胁迫植株的叶片用于测定ＣｌＣＢＬ基因在各种胁
迫条件下的表达情况。将上述材料迅速在液氮中速
冻，保存于－８０℃冰箱中备用。
１．２　总ＲＮＡ的提取及第一链ｃＤＮＡ合成
利用 改 良 Ｔｒｉｚｏｌ 法 提 取 各 处 理 材 料 总
ＲＮＡ［１４］，ＲＮＡ经琼脂糖凝胶电泳检测质量及分光
光度计测定浓度后，取２μｇ总 ＲＮＡ为模板，参照
Ｍ－ＭＬＶ反转录酶（Ｐｒｏｍｅｇａ，美国）说明书合成ｃＤ－
ＮＡ第一链。
１．３　甘菊ＣＢＬ同源基因的克隆
以课题组获得的甘菊ＣＢＬ基因的ＥＳＴ信息设
计３′端特异引物（表１）进行３′ＲＡＣＥ扩增［１５］，扩增
产物经１．２％琼脂糖凝胶检测，将目的片段回收后
与ｐＧＥＭ－Ｔ载体（Ｐｒｏｍｅｇａ）连接，转化到大肠杆菌
ＤＨ５α菌株，然后进行蓝白斑筛选，选取阳性克隆送
至北京奥科公司测序。
１．４　数据库搜索和序列分析
使用ＤＮＡＭＡＮ将３′ＲＡＣＥ扩增得到的４个
ＣｌＣＢＬ基因片段与其ＥＳＴ序列进行拼接，将拼接
序列 提 交 至 ＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／
ＢＬＡＳＴｘ）网站上，利用ＢＬＡＳＴｘ进行搜索。下载
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所有拟南芥、水稻的 ＣＢＬ 基因的蛋白序列，用
ＭＥＧＡ　５．０程序进行多序列比对，并用 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－
Ｊｏｉｎｉｎｇ法生成系统进化树。
１．５　基因的表达分析
根据ＣｌＣＢＬ基因的ｃＤＮＡ序列设计特异性引
物（表１），用半定量ＲＴ－ＰＣＲ分析ＣｌＣＢＬ基因在各
种逆境、激素处理及甘菊各器官组织特异性的表达
情况。以甘菊а－ｔｕｂｕｌｉｎ（ＣｌＴＵＡ）为内参基因［１６］，
引物序列见表１。用 Ｑｕａｎｔｉｔｙ　Ｏｎｅ软件（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）
进行电泳条带量化，目的基因与а－ｔｕｂｕｌｉｎ的条带密
度比值作为目的基因的相对表达水平。３次重复试
验。
表１　ＣｌＣＢＬ基因克隆和表达分析用ＰＣＲ引物
Ｔａｂｌｅ　１　ＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｆｏｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＣｌＣＢＬ
引物名称
Ｐｒｉｍｅｒ　ｎａｍｅ
引物序列
Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（５′－３′）
引物用途
Ｐｒｉｍｅｒ　ｕｓａｇｅ
ＡＰ　 ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣ（Ｔ）１６ 反转录Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
ＡＵＡＰ　 ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣ 锚定引物Ａｎｃｈｏｒ　ｐｒｉｍｅｒ
ＴＵＡｓ　 ＴＴＴＣＧＴＣＡＴＡＣＧＣＴＣＣＴＧＴＡ
ＴＵＡｘ　 ＴＧＧＡＴＧＧＴＴＣＴＣＴＴＧＧＴＣＴＴ
ＣｌＴＵＡ内参基因
а－ｔｕｂｕｌｉｎ（ＣｌＴＵＡ）
ＣＳ－ＣＢＬ１－１ ＡＴＴＴＧＴＴＣＣＡＣＴＴＣＣＡＣＴＧＧＣＡＴＴ
ＣＳ－ＣＢＬ１－２ ＣＴＣＴＴＣＴＧＧＣＡＡＡＧＧＡＡＡＣＣＣ
ＣＳ－ＣＢＬ２－２ ＣＴＣＧＡＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＡＴＴＣＴＣ
ＣＳ－ＣＢＬ２－１ ＴＧＴＣＴＣＡＧＴＧＣＴＴＡＧＡＡＧＧＧＡＴＣ
ＣＳ－ＣＢＬ３－１ ＧＡＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＴＴＧＧＣＧＴＴＧＴ
ＣＳ－ＣＢＬ３－２ ＡＴＣＧＧＧＴＧＴＴＴＧＡＣＣＴＡＴＴＴＧ
ＣＳ－ＣＢＬ４－１ ＴＴＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＧＣＴＣＣＴＣＡＡ
ＣＳ－ＣＢＬ４－２ ＣＧＧＡＡＣＡＧＧＡＴＴＣＡＴＡＧＡＧＣＧ
３′ＲＡＣＥ特异引物
３′ＲＡＣＥ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｉｍｅｒ
ＣＢＬ１ｓ ＧＴＴＧＣＡＴＴＴＧＴＴＣＣＡＣＴＴＣＣＡＣＴ
ＣＢＬ１ｘ ＴＴＧＣＴＴＣＣＡＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＡ
ＣＢＬ２ｓ ＧＣＡＣＴＴＣＣＣＴＡＣＴＴＴＣＴＴＧＴＴＧＴ
ＣＢＬ２ｘ ＣＡＴＴＴＧＣＴＴＣＡＣＣＴＣＴＴＧＣＣＴＣＴ
ＣＢＬ３ｓ ＴＣＡＧＧＣＡＴＴＴＡＣＴＴＧＣＴＴＣＣＡＴＡ
ＣＢＬ３ｘ ＧＴＣＧＣＡＡＴＡＣＡＡＧＡＣＴＣＣＴＣＣＡＴ
ＣＢＬ４ｓ ＣＣＧＡＣＴＴＴＡＣＴＴＧＣＴＴＣＴＣ
ＣＢＬ４ｘ ＴＴＧＴＧＣＣＡＴＴＣＴＧＡＴＴＴＧＴ
表达分析
ＲＴ－ＰＣＲ
２　结果与分析
２．１　甘菊ＣｌＣＢＬ基因ｃＤＮＡ克隆
通过对已有的ＥＳＴ序列在ＢＬＡＳＴｘ比对，发
现转录组数据库中的部分序列已具５′端，所以只需
获得 ３′端 全 长。根 据 已 有 的 ＥＳＴ 序 列 设 计
３′ＲＡＣＥ引物，通过３′ＲＡＣＥ技术分别获得９４２、
８７０、７１５和６６５ｂｐ的片段，分别命名为ＣｌＣＢＬ１、
ＣｌＣＢＬ２、ＣｌＣＢＬ３、ＣｌＣＢＬ４（图１），将ＥＳＴ序列与
３′ＲＡＣＥ测序结果经 ＤＮＡＭＡＮ 软件拼装，获得
ＣｌＣＢＬ１、ＣｌＣＢＬ２的基因全长分别为１　０３５和１　０６５
ｂｐ，具有完整开放阅读框分别为６７５和６９６ｂｐ，编
码２２４、２３１个氨基酸残基。但ＣｌＣＢＬ３与ＣｌＣＢＬ４
缺失５′端，仅获得６７１和６１５ｂｐ部分开放阅读框，
分别编码２２２、２０４个氨基酸残基。
２．２　甘菊ＣｌＣＢＬ基因的多序列比对及系统进化树
分析
将ＣｌＣＢＬ１－４与部分拟南芥ＡｔＣＢＬ 进行序列
比对发现（图２），ＣｌＣＢＬ都含有４个可结合钙离子
的ＥＦ－ｈａｎｄ结构域（ＥＦ１－４），这些ＥＦ－ｈａｎｄ不仅结
构保守，而且ＥＦ－ｈａｎｄ结构域之间的相对位置也很
保守，在ＥＦ１与ＥＦ２、ＥＦ２与ＥＦ３和ＥＦ３与ＥＦ４之
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图１　ＣｌＣＢＬ的３′ＲＡＣＥ扩增产物
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ＲＡＣＥ－ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　３′ｅｎｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＣｌＣＢＬ
注：Ｍ，ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　５０００；Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ泳道分别为ＣｌＣＢＬ１－４ 的３′
ＲＡＣＥ扩增产物。
Ｎｏｔｅ：Ｌａｎｅ　Ｍ，ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　５０００；ＬａｎｅＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ，ＲＡＣＥ－ＰＣＲ　ａｍ－
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　３′ｅｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＣｌＣＢＬ１－４，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
间分别间隔２３、２５和３２个氨基酸残基。这种大小
和结构上的保守性预示其在作用机制上可能也是相
当保守的。另外，ＣｌＣＢＬ１ 与拟南芥中的ＡｔＣＢＬ４、
ＡｔＣＢＬ９的蛋白产物属于同类，在 Ｎ端含有一个与
膜结合或蛋白互作有关的豆蔻酰化序列（ＭＧＣＸＸ－
ＳＫ／Ｔ）（图２方框所示），而ＣｌＣＢＬ２、ＣｌＣＢＬ３ 及
ＣｌＣＢＬ４与拟南芥ＡｔＣＢＬ２、ＡｔＣＢＬ３ 属于一类，在
Ｎ端不存在此保守序列。
　　为了分析甘菊ＣｌＣＢＬ与拟南芥和水稻ＣＢＬ 之
间的进化关系，构建拟南芥、水稻及甘菊ＣＢＬ序列
的进化树（图３）。该进化树表明，所有ＣＢＬ基因被
分为４组。甘菊的４个ＣＢＬ基因分布在３个不同
的类群中，其中ＣｌＣＢＬ１ 包含于组Ｉ；ＣｌＣＢＬ４ 包含
于组ＩＩ；ＣｌＣＢＬ２ 和ＣｌＣＢＬ３ 包含于组ＩＶ。此外，
该系统进化还表明ＣｌＣＢＬ１与拟南芥ＡｔＣＢＬ４同源
性较高，属于垂直同源基因；ＣｌＣＢＬ２、ＣｌＣＢＬ３与拟
南芥ＡｔＣＢＬ２、ＡｔＣＢＬ３ 同源性较高；ＣｌＣＢＬ４ 与拟
南芥ＡｔＣＢＬ１和ＡｔＣＢＬ９同源性较高。
图２　甘菊ＣｌＣＢＬ与部分拟南芥ＣＢＬ蛋白的序列比较
Ｆｉｇ．２　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＣＢＬｓ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｆｒｏｍＣ．ｌａｖａｎｄｕｌｉｆｏｌｉｕｍａｎｄ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ
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图３　ＣｌＣＢＬ１－４基因的系统进化关系
Ｆｉｇ．３　Ａ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＣｌＣＢＬ１－４　ｇｅｎｅ
注：ＣＢＬ蛋白的来源及其在ＧｅｎＢａｎｋ中的登录号Ｓｏｕｒｃｅｓ　ｏｆ　ＣＢＬ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ａｒｅ　ａｓ　ｆｏｌｏｗｓ：拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｔｈａｌｉａｎａ）ＡｔＣＢＬ１（Ｏ８１４４５．３），ＡｔＣＢＬ２（ＮＰ＿２００４１０．１），ＡｔＣＢＬ３（Ｑ８ＬＥＭ７．２），ＡｔＣＢＬ４（Ｏ８１２２３．３），ＡｔＣＢＬ５（Ｑ７ＦＺＦ１．３），ＡｔＣＢＬ６
（Ｑ９Ｃ５Ｐ６．２），ＡｔＣＢＬ７（Ｑ９ＳＵＡ６．１），ＡｔＣＢＬ８（Ｑ９ＦＵＱ７．１），ＡｔＣＢＬ９（ＢＡＢ６９８９５．１），ＡｔＣＢＬ１０（Ｑ７ＦＲＳ８．１），水稻（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ）ＯｓＣＢＬ１
（Ｑ７ＸＣ２７．２），ＯｓＣＢＬ２（ＡＢＡ５４１７７．１），ＯｓＣＢＬ３（Ｑ７５ＬＵ８．１），ＯｓＣＢＬ４（Ｑ７５ＫＵ４．１），ＯｓＣＢＬ５（Ｑ３ＨＲＰ２．１），ＯｓＣＢＬ６（ＡＢＡ５４１８１．１），ＯｓＣＢＬ７
（Ｑ３ＨＲＰ０．１），ＯｓＣＢＬ８（ＡＢＡ５４１８３．１），ＯｓＣＢＬ９（Ｑ３ＨＲＮ８．２），ＯｓＣＢＬ１０（ＡＢＡ５４１８５．１）。
２．３　表达分析
以甘菊中的ＣｌＴＵＡ 为内参基因，通过对非胁
迫条件下根、茎、叶、花的 ＲＴ－ＰＣＲ分析发现：甘菊
中的ＣｌＣＢＬ 基因在不同器官中均有表达，其中
ＣｌＣＢＬ１在花和根中表达量相对较低，在茎和叶中
的表达量相对较高；ＣｌＣＢＬ２在根中的表达量较低，
而在茎、叶和花中的表达量较高；ＣｌＣＢＬ３在根和茎
中的表达量相对较低，而在叶和花中表达量相对较
高；ＣｌＣＢＬ４ 在不同器官中表达差异不十分明显
（图４）。
对甘菊进行冷、干旱、热、盐及 ＡＢＡ的胁迫处
理 ，通过ＲＴ－ＰＣＲ分析发现，ＣｌＣＢＬ１不受干旱和
图４　甘菊ＣＢＬ１－４基因在甘菊不同器官中的表达模式
Ｆｉｇ．４　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｏｆ　ＣＢＬ１－４　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｏｒｇａｎｓ　ｏｆ　Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ　ｌａｖａｎｄｕｌｉｆｏｌｉｕｍ
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ＡＢＡ的诱导，受冷胁迫诱导但不是很强烈，同时受
ＮａＣｌ胁迫的抑制，但受热强烈诱导，表明ＣｌＣＢＬ１
可能参与甘菊的热胁迫响应；ＣｌＣＢＬ２ 在干旱胁迫
和热胁迫下表达量都明显增加，但在 ＮａＣｌ胁迫下
表达量呈先升高后降低的表达模式，受冷及 ＡＢＡ
诱导不明显；ＣｌＣＢＬ３ 在干旱胁迫下，表达量在２ｈ
明显增加，当达到１２ｈ时表达量下降，但在２４ｈ表
达量又逐渐增加，且高于２ｈ，表明ＣｌＣＢＬ３在干旱
胁迫下有表达量出现震荡变化，ＣｌＣＢＬ３ 也受冷诱
导，变化不明显，但不受热、ＮａＣｌ和 ＡＢＡ 诱导；
ＣｌＣＢＬ４仅受干旱与ＮａＣｌ胁迫诱导，表达量明显增
加（图５）。
图５　甘菊ＣＢＬ１－４基因在甘菊不同胁迫下的表达模式
Ｆｉｇ．５　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｏｆ　ＣＢＬ１－４　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｏｆ　Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ　ｌａｖａｎｄｕｌｉｆｏｌｉｕｍ
３　讨论与结论
本研究从甘菊中克隆到 ＣｌＣＢＬ１、ＣｌＣＢＬ２、
ＣｌＣＢＬ３、ＣｌＣＢＬ４ 基 因 的 编 码 区 ｃＤＮＡ，其 中
ＣｌＣＢＬ３和ＣｌＣＢＬ４缺少部分５′端。由序列分析得
知，这４个基因编码的蛋白分别为２２４、２３１、２２２和
２０４个氨基酸残基组成，结构上都含有４个 ＥＦ－
ｈａｎｄ结构域，与拟南芥的ＣＢＬ基因结构相似。但
ＣｌＣＢＬ２ 在 ＥＦ－ｈａｎｄ１ 与 ＥＦ－ｈａｎｄ２ 之间比其他
ＣｌＣＢＬ相应结构多出一段氨基酸序列（ＶＡＲＩＱ），
通过多序列比对发现，拟南芥ＡｔＣＢＬ３在此区域也
多出一段序列（ＹＱＳＱ），而其他３个ＣｌＣＢＬ基因每
个ＥＦ－ｈａｎｄ之间的距离与其他已知ＣＢＬ蛋白完全
一致。多出几个碱基是否影响ＣｌＣＢＬ２的功能有待
于进一步研究。在ＣｌＣＢＬ１的 Ｎ端含有 Ｎ－豆蔻酰
化结构域 （ＭＧＣＸＸＳＫ／Ｔ），与拟南芥 ＡｔＣＢＬ１、
ＡｔＣＢＬ４、ＡｔＣＢＬ５和ＡｔＣＢＬ９的Ｎ－端结构相同，该
序列是与膜结合或蛋白互作相关的位点［５］，因此推
测ＣｌＣＢＬ１也具有相关的功能。ＣｌＣＢＬ４由于获得
序列不完整，没有发现该保守系列，但在系统进化分
析中，ＣｌＣＢＬ４ 与含有豆蔻酰化序列的ＡｔＣＢＬ１、
ＡｔＣＢＬ９、ＯｓＣＢＬ１在同一组中，所以预测其也有该
保守序列，有待进一步获得ＣｌＣＢＬ４完整序列来验
证。
　　分析基因的表达模式可获知其功能方面的潜在
信息。在拟南芥中己经证明 ＡｔＣＢＬ１、ＡｔＣＢＬ４、
ＡｔＣＢＬ９与渗透胁迫的信号转导密切相关［５，９，１７］，它
们在盐、干旱、冷害等非生物胁迫条件下，ｍＲＮＡ水
平上受诱导表达上升。４个甘菊ＣＢＬ基因中３个
（ＣｌＣＢＬ２、ＣｌＣＢＬ３ 和ＣｌＣＢＬ４）明显受干旱诱导，
ＣｌＣＢＬ基因在干旱胁迫处理中不同基因的具体表
达模式不尽相同，可能是ＣｌＣＢＬ基因参与干旱逆境
应答调控的信号途径不同所致，ＣｌＣＢＬ３ 在干旱胁
迫条件下，表达量在２ｈ上升，１２ｈ下降，２４ｈ达到
最大，其表达量是正常植株的数倍。在干旱胁迫条
件下ＣｌＣＢＬ３出现震荡变化，胡杨（Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｅｕｐｈ－
ｒａｔｉｃａ）ＰｅＣＢＬ６在干旱胁迫条件下也呈现忽高忽低
的震荡变化的情况［１８］。而ＣｌＣＢＬ２ 与ＣｌＣＢＬ４ 在
干旱胁迫条件下持续高表达，是否表明它们在甘菊
抗旱作用中的重要性，值得更深入和详细的研究。
拟南芥ＡｔＣＢＬ１和ＡｔＣＢＬ９在ＮａＣｌ和干旱处理时
其表达量明显被诱导，本研究初步结果也表明
ＣｌＣＢＬ４也受ＮａＣｌ和干旱胁迫强烈诱导，因此推测
甘菊中一些ＣｌＣＢＬ基因可能参与甘菊对盐、干旱等
逆境胁迫的应答。同时研究表明ＣｌＣＢＬ１可能参与
热胁迫响应过程，Ｃｈｅｎ等［１９］报道冬青（Ａｍｍｏｐｉｐ－
ｔａｎｔｈｕｓ　ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｓ）ＡｍＣＢＬ１可以被干旱、高盐、热
和ＣａＣｌ２ 诱导。以上表达结果说明，ＣＢＬ基因在不
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０７／２０１４ 草　业　科　学 （第３１卷０７期）
同物种中的表达模式可能不同。
通过本研究发现，ＣｌＣＢＬｓ具备植物ＣＢＬｓ基因
家族的固有特征，同时ＲＴ－ＰＣＲ分析表明其能够响
应干旱、盐、热等非生物胁迫，说明它可能在响应非
生物胁迫过程中起重要作用，要揭示ＣｌＣＢＬｓ基因
在非生物逆境胁迫中的确切功能尚需要借助转基因
植物等手段开展大量深入细致的研究，目前有关工
作正在进行中。
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（责任编辑　王芳）
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