全 文 ：王 燕，牛瑞明，李志会． 裸燕麦中 β －葡聚糖含量测定方法的比较［J］． 江苏农业科学，2013，41(9) :300 － 302．
裸燕麦中 β －葡聚糖含量测定方法的比较
王 燕，牛瑞明，李志会
(河北北方学院农林科技学院，河北张家口 075000)
摘要:β －葡聚糖对人体具有重要的生理功能，能够降低人体的血清胆固醇和血糖水平。裸燕麦的种子中富含
β －葡聚糖，而 β －葡聚糖含量的准确测定是 β －葡聚糖研究开发的主要难点之一，虽然对其含量测定方法的研究较
多，但目前我国还没有测定 β －葡聚糖的标准方法。常用的 β －葡聚糖含量测定方法有刚果红法、标准酶法、改进酶法
等，为了筛选出最佳测定 β －葡聚糖含量的方法，以中等肥力条件下种植的裸燕麦花早 2 号为研究材料，对刚果红法、
改进酶法的精密度和准确性进行比较分析。在几种常用方法中，改进酶法的准确性较高，成本偏高;刚果红法较准确，
但操作简单，成本低。
关键词:裸燕麦;β －葡聚糖;刚果红法;改进酶法
中图分类号:TS210． 7 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2013)09 － 0300 － 03
收稿日期:2013 － 02 － 28
基金项目:国家公益性行业(农业)科研专项(编号:201003053)。
作者简介:王 燕(1982—) ，女，河北邯郸人，博士，讲师，从事种子萌
发期抗旱及资源品质研究。E － mail:pubaohua@ 126． com。
β －葡聚糖是禾谷类植物胚乳细胞壁中的一种非淀粉多
糖，其基本结构是由 D －葡萄糖以 β1 － 4 和 β1 － 3 糖苷键连
接而成的线性大分子，其含量在燕麦和大麦中较高［1］。近年
来的研究表明，β －葡聚糖对人体具有有益的生理功能，能够
降低人体的血清胆固醇和血糖水平;由于能够活化巨噬细胞、
嗜中性白血球等，因此 β －葡聚糖能够提高白细胞素、细胞分
裂素和特殊抗体的含量，从而全面刺激机体的免疫系统，使得
机体有更多的准备去抵抗微生物引起的疾病;β －葡聚糖还
能使受伤机体的淋巴细胞产生细胞因子的能力迅速恢复正
常，从而有效调节机体的免疫机能;此外，大量试验表明，β －
葡聚糖可以促进体内抗体的产生，从而提高体液的免疫能力。
以上所述的葡聚糖活化细胞会激发宿主的非专一性防御机
制，因此将其应用在肿瘤、感染病和创伤的治疗方面深受瞩
目［2］。经过特殊步骤的萃取，不含内毒素的 β － 1，3 －葡聚糖
已被美国 FDA认定为一种安全的物质，可以添加在一般食品
中。此外，葡聚糖还具有清除游离基、抗辐射、溶解胆固醇、预
防高脂血症的作用，也能够抵抗滤过性病毒、真菌、细菌等引
起的感染，因此被广泛用于医药、食品、化妆品等行业。
β －葡聚糖含量的准确测定是 β －葡聚糖研究开发的主
要难点之一，虽然目前对其含量测定方法的研究较多，但我国
还没有关于测定 β －葡聚糖的标准方法。目前常用的测定方
法有刚果红法［3 － 4］、国际标准酶法［5］、改进酶法［6 － 8］等。近年
来，一种较国际标准酶法更准确的方法，即 GEM 法(glucan
enzymatic method)正在受到国外学者的广泛关注和认可［9］。
综合考虑精确度、成本两方面的因素，本研究采用刚果红法和
改进酶法对裸燕麦(Avena sativa L．)材料进行测定比较，以期
找到理想的 β －葡聚糖测定方法。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
选取花早 2 号裸燕麦的种子，60 ℃烘干 4 h，备用。
1． 2 试验方法
刚果红法:主要参考张娟等的相关操作［3］。在标准曲线
的绘制过程中，先取 6 组试管，除 0 号设 1 支外，其余均设 3
支平行管，按表 1 将浓度为 0． 1 mg /mL 的标准 β －葡聚糖溶
液进行稀释。在稀释后的各管中分别加入 4． 0 mL 刚果红溶
液，摇匀，在 20 ℃条件下作用 10 min，用 1． 0 cm 的比色杯于
550 nm波长下测定各组的吸光度，以 0 号管中的反应液作为
空白对照进行调零。以 β －葡聚糖含量为横坐标、D550 nm为纵
坐标绘制标准曲线。
表 1 标准 β －葡聚糖溶液的稀释
试管号
标准 β －葡聚糖
溶液(mL)
蒸馏水
(mL)
稀释后各管中标准
β －葡聚糖含量(μg /mL)
0 0 2． 0 0
1 0． 2 1． 8 10
2 0． 4 1． 6 20
3 0． 6 1． 4 30
4 0． 8 1． 2 40
5 1． 0 1． 0 50
样品的测定过程:称取 200． 0 mg 烘干的样品，研碎后放
入 25 mL具塞刻度试管内，用 0． 4 mL 50%乙醇润湿，再加入
10． 0 mL水溶液混匀;在 25 ℃下放置 16 h后将上述溶液充分
转移至 50 mL容量瓶中，用水稀释、定容;以 4 000 r /min的速
度离心 20 min并收集上清液;吸取 0． 1 mL β －葡聚糖样品溶
液，依次加入 1． 9 mL蒸馏水、4． 0 mL刚果红溶液，于 20 ℃下
反应 10 min，同时将 2． 0 mL蒸馏水加入 4． 0 mL 刚果红溶液
中，作为空白对照，测定溶液的吸光度，根据标准曲线即可计
算样品中的 β －葡聚糖的含量。相应的公式如下:
样品中 β －葡聚糖含量 = A /2 × 100%，
式中:A为根据标准曲线计算得到的反应液中 β － 葡聚糖
含量。
改进酶法:纤维酶的纯化、葡萄糖氧化酶 /过氧化酶
(GOPOD)试剂的配制主要参考邓万和等的相应操作［6，8］。在
—003— 江苏农业科学 2013 年第 41 卷第 9 期
DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2013.09.089
标准曲线的绘制过程中，先在 5 支空试管中取 1 支试管，加入
0． 4 mL 水作为空白对照，再在其他 4 支试管内分别加入
0． 4 mL 浓度为 100、200、300、400 μg /mL的葡萄糖标准液;分
别向上述各试管内加入 0． 2 mL 乙酸钠缓冲液、0． 4 mL 琥珀
酸钠缓冲液;再向上述各试管内加入 5 mL GOPOD显色液，于
40 ℃水浴保温 40 min，取出并放置于暗处，10 min 后在
510 nm 处测定吸光度。以 β －葡聚糖含量为横坐标、吸光度
D510 nm为纵坐标绘制标准曲线。
样品的测定过程:称取 200． 0 mg 烘干的样品，研碎后放
入 25 mL具塞刻度试管内，用 0． 4 mL 50%乙醇润湿后加入
10． 0 mL水溶液，混匀;在 20 ℃下放置 16 h 后转移至 50 mL
容量瓶中，定容;在离心机上以高于 4 000 r /min的速度离心，
取上清液;取 3 支 10 mL 的具塞刻度试管，在 1 号、2 号试管
内分别加入 0． 4 mL样品液，再在 1 号试管加入 0． 2 mL 纤维
酶液(作样品分析) ，在 2 号试管内加入 0． 2 mL 醋酸钠缓冲
液(作为酶空白对照) ，3 号试管则作为样品的空白对照，在其
中分别加入 0． 4 mL水、0． 2 mL纤维酶液;在所有的试管内加
入 0． 4 mL琥珀酸钠缓冲液(pH值 5． 0) ，盖上塞子、摇匀后置
于 40 ℃水浴保温 3 h;在所有试管内加入 5 mL GOPOD 显色
液，于 40 ℃水浴保温 40 min后取出并放置于暗处，10 min后
于 510 nm 处测定吸光度。样品中 β －葡聚糖含量的测定公
式如下:
样品中 β －葡聚糖含量 = C × 50 × 2． 5 × 100 × 0． 9 /(200 ×
1000)× 100% = C × 9 /160 × 100%。
式中:C为测定的样品吸光度对应的葡聚糖值减去空白对照、
酶空白对照对应的葡聚糖值的差值;200 为样品重量，mg;0． 9
为葡萄糖转化为葡萄糖苷的转换因子(162 /180)。
1． 3 β －葡聚糖定量方法准确性的评价
1． 3． 1 精密度试验 刚果红法:在试管中加入 1． 0 mL β －葡
聚糖标准溶液，用去离子水补足至 2． 0 mL;再加入 4 mL刚果
红溶液，摇匀，使其在一定条件下充分反应后测定吸光度。重
复 5 次，计算其相对标准差 ＲSD。
改进酶法:取 0． 4 mL浓度为 0． 1 mg /mL的 β －葡聚糖溶
液，依次加入 0． 2 mL 纤维素酶液、0． 4 mL 琥珀酸钠缓冲液
(pH值 5． 0) ，盖上塞子并摇匀后置于 40 ℃水浴保温 3 h;然
后加入 5 mL GOPOD 显色液，在 40 ℃水浴保温 40 min;取出
并放置于暗处，10 min 后在 510 nm 处测定吸光度。重复 5
次，计算其相对标准差 ＲSD。
1． 3． 2 准确性试验 刚果红法:分别在 6 个试管中加入
1 mL 样品液，再分别准确加入 0、0． 2、0． 4、0． 6、0． 8、1． 0 mL
β －葡聚糖标准溶液，然后分别用去离子水补足至 2． 0 mL，再
分别加入 4 mL刚果红溶液，摇匀。在一定条件下充分反应后
测定吸光度，计算相对标准差 ＲSD，并按以下公式计算加样回
收率:
加样回收率 = 经测定并计算的标准品加入量β －葡聚糖标准品的实际加入量
× 100%。
改进酶法:取 1 支具塞试管，加入 2 mL样品液，再依次精
确加入 1 mL纤维素酶、2 mL 琥珀酸钠缓冲液(pH 值 5． 0) ，
盖上塞子并摇匀后置于 40 ℃水浴中保温 3 h;在 5 支试管中
分别加入 0． 6 mL上述处理液，再分别精确加入 0． 4 mL 浓度
为 0、100、200、300、400 μg /mL 的葡萄糖标准液，再在所有试
管内分别加入 5 mL GOPOD 显色液;在 40 ℃ 水浴保温
40 min，取出并放置于暗处，10 min 后于 510 nm 处测定吸光
度。计算相对标准差 ＲSD，并按以下公式计算加样回收率:
加样回收率 =经测定并计算的工作标准液加入量
葡萄糖工作标准液的实际加入量
× 100%。
2 结果与分析
2． 1 刚果红法
2． 1． 1 标准曲线的绘制 β －葡聚糖标准溶液的吸光度见表
2。可以计算出此标准曲线的回归方程为:y = 0． 002 2x +
0. 006 3(r2 = 0． 987 50) ，回归效果显著。
表 2 β －葡聚糖标准液的吸光度
β －葡聚糖含量(μg /mL) D550 nm
0 0
10 0． 035
20 0． 052
30 0． 071
40 0． 090
50 0． 115
2． 1． 2 精密度及准确性的评价 刚果红法的精密度试验结
果见表 3。对 1． 0 mL β －葡聚糖标准溶液进行重复性试验，
对该测定方法的精密度进行检测。试验结果表明，刚果红法
的检测重复性好，精密度较高(ＲSD为 5． 291%)。
表 3 刚果红法的精密度试验
重复 D550 nm
β －葡聚糖含量的计算值
(μg /mL)
1 0． 128 110． 636
2 0． 115 98． 818
3 0． 114 97． 909
4 0． 124 107． 000
5 0． 123 106． 091
平均值 0． 121 104． 091
ＲSD(%) 5． 387 5． 291
刚果红法的准确性试验结果见表 4。通过加样回收率试
验检测该测定方法的准确度，结果表明其测定准确度较高
(平均加样回收率为 99． 89%) ，完全能够满足一般测定的
需要。
表 4 刚果红法的准确性试验
标准 β －葡聚糖
含量(μg /mL)
D550 nm
计算得 β －葡
聚糖量(μg /mL)
回收率
(%)
ＲSD
(%)
0 0． 028 19． 727 0
10 0． 051 40． 636 104． 55
20 0． 070 57． 909 95． 45
30 0． 095 80． 636 101． 52
40 0． 115 98． 818 98． 86
50 0． 137 118． 818 99． 09
平均值 99． 89 3． 387
2． 2 改进酶法
2． 2． 1 标准曲线的绘制 根据表 5 数据绘制葡萄糖标准曲
—103—江苏农业科学 2013 年第 41 卷第 9 期
线，此标准曲线的回归方程为:y = 0． 000 6x + 0． 001 8(r2 =
0. 997 0) ，回归效果显著。
表 5 葡萄糖标准液的吸光度
葡萄糖含量(μg /mL) D510 nm
0 0
40 0． 027
80 0． 050
120 0． 069
160 0． 095
2． 2． 2 准确性评价 改进酶法的精密度试验结果见表 6。
通过对同一样品的重复性试验，对改进酶法的精密度进行检
测。试验结果表明，改进酶法的检测重复性好，精密度较刚果
红法低(ＲSD为 5． 045% ＜5． 291%)。
表 6 改进酶法的精密度试验
重复 D510 nm
β －葡聚糖含量的计算值
(μg /mL)
1 0． 024 0 37． 000
2 0． 023 0 35． 333
3 0． 024 0 37． 000
4 0． 026 0 40． 333
5 0． 025 0 38． 667
平均值 0． 024 4 37． 667
ＲSD 4． 672% 5． 045%
改进酶法的准确性试验结果见表 7。通过加样回收率试
验检测该测定方法的准确度，结果表明，改进酶法的测定准确
度较刚果红法高(平均加样回收率为 99． 97%) ，完全能够满
足一般测定的需要。
表 7 改进酶法的准确性试验
标准 β －葡聚糖
含量(μg /mL)
D510 nm
计算得 β －葡
聚糖量(μg /mL)
回收率
(%)
ＲSD
(%)
0 0． 058 94． 222 99． 97
40 0． 082 133． 667 98． 61
80 0． 106 173． 667 99． 31
120 0． 132 217． 000 102． 32
160 0． 154 253． 667 99． 65
平均 99． 97 1． 624
3 结论与讨论
改进酶法的精密度比刚果红法要低(ＲSD 为 5． 045% ＜
5． 291%﹚，改进酶法的准确度(加样回收率)比刚果红法要
高(改进酶法的回收率平均值为 99． 97%，大于刚果红法的
99． 89%)。在本研究中，刚果红法测定的结果偏低，可能是
由于供试样品中 β －葡聚糖分子被其他分子包裹，而使其未
能充分溶解，使得显色不足。但刚果红法所需仪器简单，检测
快速便捷，适用于批量多、批次长期、连续测定的工业生产的
需要，且成本较低，极易操作。虽然与标准酶法相比，改进酶
法缩短了测定的时间、减少了试剂的用量、降低了成本，但是
与刚果红法相比，测定时间、价格成本仍然较高，仅适用于对
少量材料的准确测定，对于工业生产中的测定来说，成本仍然
较高。GEM方法对国际标准法进行了改进，样品先用氢氧化
物碱性处理，再用 exo － 1 － 3 － β － D － glucanase(外切型葡聚
糖酶)和 β － glucosidase(β －葡萄糖苷酶)2 种酶特异地把 β －
葡聚糖转化成葡萄糖，再对葡萄糖进行定量测定，由于该法成
本仍然较高，对于工业生产依旧难以大规模施行，因此在要求
准确度较高且材料较少时可以选择改进酶法或 GEM法，在大
规模工业生产测定 β －葡聚糖含量时可以采用刚果红法。
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