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猴头菌不同生长发育期粗蛋白、粗多糖含量及水溶性粗多糖体外免疫活性



全 文 :食用菌学报2011.18(4):73~77
收稿日期:2011-09-15原稿;2011-10-01修改稿
基金项目:上海市农委重点攻关项目[编号:沪农委攻字(2008)第8-2号]的部分研究内容
作者简介:李巧珍(1986-),女,在读硕士研究生,主要从事药用真菌多糖的分离纯化及活性物质方面研究。
*本文通讯作者 E-mail:yangyan9200@yahoo.com.cn
文章编号:1005-9873(2011)04-0073-05
猴头菌不同生长发育期粗蛋白、粗多糖含量
及水溶性粗多糖体外免疫活性
李巧珍1,2,刘朝贵1,于海龙2,蒋 俊2,刘艳芳2,张劲松2,唐庆九2,杨 焱2*
(1西南大学园艺园林学院,重庆市蔬菜学重点实验室,重庆400715;2农业部南方食用菌资源利用重点实验室,
国家食用菌工程技术研究中心,上海市农业遗传育种重点开放实验室,
上海市农业科学院食用菌研究所,上海201403)
摘 要:测定猴头菌(Hericium erinaceus)华中猴头菌株不同生长发育期子实体中的粗蛋白、粗多糖和水溶
性粗多糖中β-葡聚糖含量,并研究不同生长发育期子实体粗多糖体外刺激巨噬细胞产生 NO的活性变化规
律。结果表明,供试菌株不同生长发育期子实体的粗蛋白、粗多糖和β-葡聚糖含量以及粗多糖体外刺激巨
噬细胞产生NO的活性均存在显著或极显著差异,随着生长发育的进行,猴头菌子实体中粗蛋白含量总体上
呈下降的趋势(小菌刺期比前一时期有所增加),而多糖含量则总体呈上升趋势(小菌刺期比后一时期高),β-
葡聚糖含量呈先快速上升后平稳的趋势;分裂期粗多糖在浓度500μg/mL时对RAW264.7释放NO的促进
作用较强。
关键词:猴头菌;生长发育期;粗蛋白;粗多糖;β-葡聚糖;NO释放量
  猴头菌(Hericium erinaceus)是我国著名的
八大“山珍”之一,与熊掌、海参和鱼翅并列为四
大名菜[1]。猴头菌的药效成分主要有多糖、低聚
糖、甾醇、脂肪酸、猴头菌素和猴头菌酮等,具有
保肝护胃、降血糖、保护神经、增强人体免疫力、
抗癌、抗氧化等功效[2]。近年来关于猴头菌的研
究主要集中在活性成分的分离、结构及相应药理
作用上,其中多糖因在免疫调节作用上发挥重要
作用而成为活性成分研究的焦点[3]。有关猴头
菌采收的研究报道较多,但是多以子实体七八成
熟为采收标准[4]。为了发挥最佳的食用和药用
价值,笔者对不同生长发育期的猴头菌子实体的
粗蛋白、粗多糖、β-葡聚糖含量和粗多糖体外免疫
活性变化规律进行了研究,以期为确定猴头菌的
适宜采收期提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株
  供试菌种华中猴头(H.erinaceus)由湖北省
华中食用菌栽培研究所提供。
1.1.2 子实体栽培及供试样品制备
  培养料配方:30%木屑,22%棉籽壳,16%玉
米芯,12%玉米粉,10%米糠,8%麸皮,2%石膏,
60%含水量。
2010年2月~2010年3月于上海市农业科
学院食用菌研究所国森生物科技有限公司进行
常规代料栽培出菇[5]。
根据形态特征将猴头菌子实体生长过程划
分为7个时期,各生育期的生长发育形态特征见
表1。并对这7个时期进行取样,用刀齐土表剪
下子实体,所采子实体自然风干4h,然后放入
60℃烘箱中烘至恒重,用DJ-10A型粉碎机(上
海淀久中药机械制造有限公司)粉碎后过孔径为
0.9mm的筛,备用。
1.1.3 仪器
  主要实验仪器包括凯式定氮仪(Foss公司)、
Büchi Vacuum Controler V-800 旋转蒸发仪
(Büchi公司)、冷冻干燥仪(Thermo Savant公
司)、Synergy HT 多功能酶标仪(Bio-Tek 公
司)、二氧化碳培养箱(Thermo Forma公司)和细
胞计数仪(Beckman Coulter公司)。
食 用 菌 学 报 第18卷
表1 猴头菌不同生育期的生长发育特征
Table 1 Morphological characteristics of H.erinaceus fruit bodies at different stages of development
编号
No.
生长发育期
Developmental stage
子实体形态特征
Morphological characteristics
1 现蕾期
Bud formation
刚形成小原基,洁白,直径小于3cm
Formation of a white bud≤3cm diameter
2 小疙瘩期
Smal lump formation
表面形成许多小疙瘩,菌肉紧实
Formation of smal protrusion on the fruit body surface
3 分裂期
Splitting
表面小疙瘩慢慢消失,出现裂痕,菌肉开始膨胀,松软
Disappearance of protrusion,formation of cracks in the fruit body which
becomes swolen and soft
4 小菌刺期
Smal spine formation
表面长满细短的小菌刺
Formation of smal spines on fruit body surface
5 中菌刺期
Spine extension
菌刺长至0.5cm左右
Spine extend to~0.5cm in length
6 成熟期
Maturation
菌刺长至1cm
Spines extend to~1cm in length
7 成熟后期
Post-maturation
孢子停止弹射
Termination of spore ejection
1.1.4 试剂及细胞株
  凯式消化片为Foss Scino公司产品,青霉素
和链霉素(双抗)为Amersco公司产品,DMEM、
RPMI-1640、胎牛血清、胰酶为 Gibco公司产品,
细菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、磺胺、
盐酸萘乙二胺为Sigma公司产品;其余试剂均为
国产分析纯试剂。
RAW264.7细胞株(小鼠巨噬细胞株)购自
ATCC(American Type Culture Colection)。
1.2 方法
1.2.1 子实体中粗蛋白含量的测定
  称取1g子实体粉样品,参照文献[6]中的微
量凯式定氮法进行蛋白质含量测定。每个样品3
次平行。
1.2.2 子实体中多糖含量的测定
  取粉末样品2g,加90mL蒸馏水,沸水浴提
取2h,提取液加蒸馏水定容至100mL,量取
10mL,加无水乙醇150mL,摇匀,4℃放置12h,
取出,4000 g离心20min,倒去上清液,沉淀用
10mL 95% 的 乙 醇 洗 涤 2 次,4000 g 离 心
20min。用蒸馏水将沉淀定容至50mL。采用苯
酚-硫酸法测定总糖含量[7]。
多糖含量=0.9×总糖含量
1.2.3 水溶性粗多糖制备
  取子实体粉样品15g,加270mL蒸馏水沸
水浴提取2h,滤渣重复提取2次,合并提取液,
在旋转蒸发仪上减压浓缩至50mL;取30mL浓
缩液,4000 g离心20min,去除沉淀,浓缩液再加
无水乙醇至乙醇终浓度为70%,4℃放置12h,倒
去上清液,4000 g离心20min,沉淀用70%的乙
醇洗涤一次,倒去上清液,沉淀部分加30mL蒸
馏水溶解,4000 g离心20min,除去不溶物质,冷
冻干燥仪冻干,得猴头水溶性粗多糖。
1.2.4 水溶性粗多糖中β-葡聚糖含量测定
  1.2.3制得的猴头水溶性粗多糖用截留分子
量为3500 Da透析袋对水4℃透析3 d,去除小
分子物质,将透析过的粗多糖冻干。称取少量冻
干后的粗多糖,用醋酸钠缓冲液(pH5.0)配成
1 mg/mL的粗多糖溶液,参照 Megazyme公司提
供的酵母和蘑菇β-葡聚糖检测试剂盒中的方法
进行β-葡聚糖含量测定。
1.2.5 水溶性粗多糖对 RAW264.7释放 NO量
影响的试验
  取1.2.3的冻干水溶性粗多糖5 mg,加
1 mL PBS将其配成5 mg/mL的母液,15000 g
离心30 min,将上清液转移至另一离心管中,然
后取一定量稀释成0.5 mg/mL和2 mg/mL,并
以10μg/mL LPS为阳性对照,以PBS为阴性对
照,按文献[8]的方法测定巨噬细胞释放 NO的
产量。
47
第4期 李巧珍,等:猴头菌不同生长发育期粗蛋白、粗多糖含量 及水溶性粗多糖体外免疫活性
2 结果与分析
2.1 子实体粗蛋白含量
  不同生长发育期粗蛋白含量相差较大(P<
0.05),总体呈下降趋势,现蕾期粗蛋白含量最高,达
到26.56%,衰老期含量最低,为11.04%(图1-A)。
2.2 子实体多糖含量
  在猴头菌整个生长发育过程中,多糖含量总
体呈上升的趋势(图1-B)。小疙瘩期较现蕾期略
有降低,之后上升,小菌刺期时较高,而后又下
降,中菌刺期较低,之后又升高,至成熟后期含量
达到整个发育过程的最大值4.44%。
图1 华中猴头不同生长发育期粗蛋白(A)、多糖(B)含量变化曲线
Fig.1 Protein(A)and polysaccharide(B)content of Huazhong H.erinaceus fruit bodies harvested
at different stages of development
2.3 水溶性粗多糖中β-葡聚糖含量
  在华中猴头子实体发育过程中,水溶性粗多
糖中β-葡聚糖的含量在现蕾期最低,为9.32%,
之后大幅上升,分裂期达到最高,为28.62%,在
小菌刺期含量显著下降,为25.04%,中菌刺期含
量又显著上升,仅次于分裂期,为28.35%,成熟
后期相比之前显著下降,与小菌刺期含量相当,
为25.20%(图2)。
2.4 水溶性粗多糖对RAW264.7释放NO量的影响
   供 试 菌 株 不 同 生 长 发 育 期 水 提 物 对
RAW264.7释放NO量影响的试验结果见图3。
相同生长发育期子实体水提物刺激 RAW264.7
产生NO的量随着样品浓度的增大而上升,具有
图2 华中猴头不同生长发育期水溶性粗多糖中
β-葡聚糖含量变化曲线
Fig.2 β-Glucan content in crude polysaccharide material
extracted from Huazhong H.erinaceus fruit bodies
harvested at different stages of development
*和**分别表示与阴性对照(PBS)比较,差异0.05和0.01水平显著
*,**Represent significant differences at P0.01and P0.05,respectively,compared with control(PBS)
图3 不同生长发育期华中猴头子实体粗多糖对RAW264.7细胞NO释放量的影响
Fig.3 Nitric oxide production by RAW264.7cels treated with crude polysaccharide extracted from Huazhong
H.erinaceus fruit bodies harvested at different stages of development
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食 用 菌 学 报 第18卷
浓度依赖性。在低浓度50μg/mL时,水提物对
RAW264.7 释 放 NO 量 无 影 响;当 浓 度 为
200μg/mL时,现蕾期和分裂期的水提物对
RAW264.7释放NO有明显的促进作用,而其它
时期水提物则作用不明显;当浓度为500μg/mL
时,除小疙瘩期外,其它时期水提物对RAW264.7
释放量均表现出显著的促进作用,其中分裂期水
提物的促进作用最强。
3 讨论
  关于食药用菌不同生育期子实体中所含物
质的研究较少,主要集中在灵芝上 [8,13-15],在猴头
菌上目前还未见报道。本试验首次对不同生长
发育期采收的猴头菌子实体中粗蛋白含量、粗多
糖含量进行研究,发现小菌刺期子实体中的蛋白
质和多糖含量较高,而后下降,在保证一定产量
的同时,在小菌刺期采收,能获得口感较好子实
体材料。中菌刺期子实体水溶性粗多糖对
RAW264.7细胞NO释放量有明显促进作用,所
以中菌刺期采收的猴头子实体可以作为优质的
保健品或药品的原料。
关于猴头菌多糖的组成,多数认为是由葡萄
糖、半乳糖、甘露糖组成,以葡萄糖为主,是由β
(13)键连接的主链和β(16)键连接的支链构
成的葡聚糖[9-11],所以β-葡聚糖是猴头菌中存在
的一类重要多糖,它能提高机体免疫功能[12]。本
试验结果表明,体外免疫活性较高的水溶性粗多
糖中β-葡聚糖含量也相对较高,初步说明水溶性
粗多糖中的β-葡聚糖在体外免疫活性上发挥重
要作用。
猴头菌在成熟期后其子实体多糖含量迅速
增加,但其多糖提取物的活性下降,这可能与多
糖的糖苷键类别、糖组成、糖结合物及其分子
量、水溶性、分支程度、构型以及支链与主链间
的连接方式密切相关,因此猴头菌在生长发育
过程中多糖的种类、结构与药理之间的相关性
以及整个过程中的多糖合成及分解机制有待进
一步研究。
参考文献
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第4期 李巧珍,等:猴头菌不同生长发育期粗蛋白、粗多糖含量 及水溶性粗多糖体外免疫活性
Protein,Polysaccharide andβ-Glucan Levels in
Hericium erinaceus Fruit Bodies Harvested at Different
Development Stages and the Effect of Extracted
Polysaccharide on NO Production byRAW264.7Cels
LI Qiaozhen1,2,LIU Chaogui 1,YU Hailong2,JIANG Jun2,LIU Yanfang2,
ZHANG Jingsong2,TANG Qingjiu2,YANG Yan2*
(1 Key Laboratory of Vegetable Research of Chongqing,Colege of Horticulture and Landscape Architecture,
Southwest University,Chongqing 400715,China;2 National Engineering Research Center of Edible Fungi;
Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding;Institute of Edible Fungi,Shanghai
Academy of Agricultural Sciences,Shanghai 201403,China)
Abstract:Fruit bodies of Hericium erinaceus,strain Huazhong,were harvested at seven different
developmental stages,dried and pulverized to pass a mesh size of 0.9mm.Determination of protein levels in
the powdered material,and polysaccharide levels in crude aqueous extracts,revealed that,in general,the
former decreased as mushroom development progressed whereas the latter increased.The concentration ofβ-
glucan in extracted polysaccharide material was much higher in samples taken at the second developmental
stage compared with first-stage samples but then remained generaly stable in samples taken at subsequent
developmental stages.Crude polysaccharide(500μg/mL)obtained from aqueous extracts of powdered fruit
bodies harvested at the third developmental stage,when the initial protrusion formed on the fruit body
disappeared and cracks formed in the fruit body which also became swolen and soft,enhanced the production
of NO by RAW264.7macrophages.
Key words:Hericium erinaceus;fruit body developmental stage;protein;crude polysaccharide;β-glucan;
NO production
[本文编辑] 于荣利
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