全 文 ：分子植物育种,2006年,第4卷,第1期,第147-149页
MolecularPlantBreeding,2006,Vol.4,No.1,147-149
实验方法
ExperimentalTechnique
羊蹄甲果荚中总RNA提取的新方法
夏海武 1,2 吕柳新 1* 陈桂信 1
1福建农林大学园艺学院,福州,350002;2潍坊学院生物系,潍坊,261061
*通讯作者,lxlu2000@yahoo.com.cn
摘 要 高质量RNA的获得是开展羊蹄甲分子生物学研究的基础,但要获得高质量的植物总RNA比较困
难,RNA的提取方法会因植物材料的不同而有较大差异。目前已有多种从植物组织中提取RNA的方法。但
是由于羊蹄甲中的次生物质含量较高,这些常用方法并不适用于羊蹄甲 RNA的提取。本文介绍一种羊蹄
甲果荚中总RNA的提取方法,它可以有效的排除羊蹄甲组织中大量存在的多酚类和多糖类物质的干扰。
所得 RNA样品经紫外分光光度计检测和 1%琼脂糖凝胶电泳分析证明无明显降解,且具有较高的纯度。获
得的 RNA样品在纯度和浓度上都可以满足 RT-PCR,Northernblot和 cDNA文库构建等分子生物学实验
的要求。本方法尤其适用于多酚和多糖含量较高的植物组织的 RNA提取,且试剂简单经济,试验结果稳
定,重现性强。
关键词 羊蹄甲,多酚,多糖,RNA提取
NewMethodforTotalRNAExtractioninLegumeofBauhiniaVariegata
XiaHaiwu1,2 LuLiuxin1* ChengGuixin1
1ColegeofHorticulture,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,350002;2DepartmentofBiology,WeifangUniversity,Weifang,261061
*Corespondingauthor,lxlu2000@yahoo.com.cn
Abstract TheacquisitionofhighqualityRNAisfoundationoflaunchingmoleculebiologicalstudyofBauhinia
variegata.ButitisrelativelydificulttoextractqualitytotalRNAthoseextractingmethodsverydependingondif-
ferentplantmaterials.ManymethodsfortheextractionofRNAfromplanttissueshavebeendevelopedatpresent.
BecausethehigherlevelsofthesecondarycompoundsinBauhiniavariegata,somemethodsthatusualyusedare
notappropriatefortheextractionofRNAfromBauhiniavariegatatissues.Asimpleextractionmethodforthetotal
RNAofBauhiniavariegatalegumeisintroducedhere.Itcaneficientlyeliminatetheinterferentofpolyphenolies
andpolysaccharideswhichareveryrichinBauhiniavariegata.Theresultsof1%agarosegelelectrophoresisand
ultravioletspectrophotometeranalysisshowthatthetotalRNAofBauhiniavariegataextractedthroughthis
methodhasnoobviousdegradationandhasagoodpurity.ThepurityandconcentrationofextractedtotalRNA
conmeetthedemandofmolecularbiologyexperimentsuchasRT-PCR,NorthernblotexperimentandcDNAli-
braryconstruction.ItisespecialyusefulfortheRNAextractionofplanttissueswhichusualyhasplentyof
polyphenoliesandpolysaccharides.Itissimple,inexpensive,stableandeasilyrepeated.
Keywords Bauhiniavariegata,Polyphenolies,Polysaccharides,RNAextraction
核糖核酸(RNA)是分子生物学研究的重要材料
之一,是进行 Northern杂交分析,RT-PCR,cDNA文
库构建,DD-PCR分析及体外转译等实验的必要前
提。然而,羊蹄甲等多年生豆科植物的果荚中存在大
量的多糖和多酚类物质,它们对RNA的分离和纯化
有很大的干扰。这主要是因为多酚类物质极易氧化
成多醌类物质而褐化,并与核酸紧密结合。同时,一
些常用的使 RNA酶失活的强烈变性剂和较高的处
理温度都会使多糖类物质糊化,并且这些物质在组
织抽提时可以与核酸形成复合物,并在后来的异丙
醇沉淀阶段共同沉淀下来。由于这些污染物的性质
使得沉淀物可能呈凝胶状,难于溶解。受多糖和多酚
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
污染的RNA溶液很黏,并且在 230nm有强烈的吸
收。这种紫外吸收会影响对RNA含量的精确定量。
因此,去除多糖和多酚类物质是分离这些植物组织
总RNA的关键(李宏和王新力,1999)。
我们通过改进 CTAB提取植物 DNA的方法来
提取羊蹄甲果荚中的RNA获得了较好的效果。
1材料与方法
1.1植物材料
所用材料采自福建农林大学校园内,为5月份
羊蹄甲开花后2周左右的果荚。去除幼嫩的种子,用
液氮速冻后保存于-80℃超低温冰箱中待用。
1.2RNA提取试剂
所用试剂均为新开封或专门用于提取RNA的。
无RNase的水和LiCI、KAC及NaAC溶液配好后加
入0.1%DEPC,充分摇匀,室温放置过夜,124℃灭菌
20min(萨姆布鲁克等,1999)。提取缓冲液成分为:2%
CTAB;100mmol/LTris-Cl,pH=8.0;25mmol/LED-
TA,pH=8.0;1.4mol/LNaCl。SSTE缓冲液成分为:
0.5%SDS;10mmol/LTris-Cl,pH=8.0;1.25mmol/L
EDTA,pH=8.0;1mol/LNaCl。
1.3RNA提取方法
1)从 -80℃超低温冰箱中取出 2g羊蹄甲果荚,
置于预冷的研钵中,加入 0.2gPVPP,加入液氮研磨
成细粉末,勿让组织解冻。
2)在 50ml离心管中加入 20ml经 65℃预热的
CTAB提取缓冲液和400!l!-巯基乙醇,然后将研
磨碎的材料倒入,充分振摇混匀后 65℃水浴加热
30min。
3)加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)颠倒混匀后
于4℃,20000r/min离心20min。重复本步骤一次。
4)取上层水相至另一离心管中,加入等体
积的 4mol/LKAC(pH=4.8),混匀,冰浴 30min。
4℃,20000r/min离心20min。
5)将上清移至另一离心管中,加入 1/4体积
10mol/LLiCl,混匀,4℃沉淀过夜。4℃,20000r/min
离心 20min,去上清,用 2mol/LLiCl将沉淀洗一次,
离心获沉淀。
6)用 2mlSSTE缓冲液溶解沉淀,转入 4个
1.5ml离心管中,每个离心管中 0.5ml,加等体积的氯
仿 /异戊醇,振摇混匀后于 4℃,20000r/min离心
15min。
7)取上层水相于另一离心管中,加入 1/10体积
的 3mol/LNaAC(pH=4.5)和 2倍体积的无水乙醇,
-20℃放置2h沉淀RNA。
8)4℃,20000r/min离心15min,弃上清,沉淀用
75%乙醇漂洗2次,在超净工作台中开离心管口吹
干10min。溶于100l无RNase的水中。取少量样品
进行电泳分析和紫外分光光度测定。
2结果
取本法提取的 3#lRNA,经 1%琼脂糖凝胶电
泳,结果显示 28s与 18s带型整齐清楚,且 28s
rRNA带比 18srRNA带更亮,说明 RNA完整性较
好(图1)。
利用紫外分析法检测RNA纯度,测得RNA紫
外光吸收值:OD230=0.242,OD260=0.520,OD280=0.269,
OD260/230=2.15,OD260/280=1.93,说明RNA的纯度较高。
利用芪合酶基因的引物进行 RT-PCR后,扩增
出780bp的片断(图2)。表明本方法提取的 RNA可
满足多数分子生物学实验的需求。
3讨论
实验中发现应用常用的异硫氰酸呱一步法以及
在此基础上开发出来的 RNA提取试剂盒很难从羊
蹄甲果荚中提取出RNA(张玉进等,2001),这可能是
因为羊蹄甲果荚中含有的多酚和多糖等次生物质特
图1RNA电泳图
Figure1ElectrophoresispaternoftotalRNA
图2RT-PCR电泳图
Figure2ElectrophoresispaternofRT-PCR
148
别多。多酚类物质在酸性条件下极易氧化或与多酚
试剂作用而生成多元醌,成棕褐色。与核酸不可逆结
合,从而引起RNA降解或不能溶于水相中。本方法
提高了提取缓冲液的pH值(8.0),有效的防止了多酚
类物质的氧化,并且提取缓冲液中的EDTA的存在
抑制了内源 RNase的活性。同时,利用 PVPP和 !-
巯基乙醇也有较好的抗氧化的作用,PVPP作为多酚
化合物的鳌合剂具有很强的结合酚的能力,使之不
能被氧化成醌类;!-巯基乙醇作为强的还原剂防止
了多酚的氧化,二者协同作用,!-巯基乙醇提供还
原条件使得多酚类物质不易氧化,得以与水溶性的
PVPP充分结合,形成鳌合物,再通过以后的步骤抽
提除去。
多糖是另一个干扰羊蹄甲果荚总 RNA提取的
因素。由于多糖可以抑制许多酶的活性。因此,污染
多糖的 RNA样品亦无法用于进一步的分子生物学
研究。我们利用终浓度2mol/L的醋酸钾将位于水相
中的多糖选择性的沉淀出来,然后用氯化锂选择性
的沉淀 RNA,去除胶质和多糖类物质,有效地排除
了多糖类物质对RNA提取和纯化的干扰,获得了纯
度和数量合乎试验要求的RNA。
目前发表的关于植物RNA提取的文献较多,但
是不同植物或同一种植物的不同品种往往因为种质
的差异,材料内含物组分及含量有很大的不同,所以
需要采用不同的 RNA提取方法 (夏兰芹和郭三堆,
2000;周明兵等,2003;张今今等,2003)。特别是对多
年生木本植物果实而言,其细胞组成成分的复杂多
样性,使得 RNA的提取相对于其他植物要困难得
多。因此,针对羊蹄甲富含多酚类物质和多糖的特
点,在CTAB提取DNA方法的基础上加以改进,有
效的抑制了多酚类物质和多糖的干扰。从果荚中提
取到了高质量的RNA。
本方法特别适合于多酚类和多糖类等次生代谢
物质含量高的植物材料的RNA的提取,而对于次生
物质含量少的植物材料采用此法反而会降低 RNA
的产率。
致谢
本项目由福建省211重点学科项目资助。
参考文献
LiH.,andWangX.L.,1999,TheDificultiesintheisolationof
RNA from planttissuesandtheirresolvingstrategies,
ShengwuJishuTongbao (BiotechnologyBuletin),(1):
36-39(李宏,王新力,1999,植物组织RNA提取的难点及
对策,生物技术通报,(1):36-39)
SambrookJ.,FritschE.F.,andManiatisT.,eds.,JinD.Y.,andLi
M.F.,trans.,1999,MolecularCloning:ALaboratoryManu-
al(2nded),SciencePress,Beijing,China,pp.343-362(萨
姆布鲁克 J.,费里奇 E.F.,曼尼阿蒂斯 T.,主编,金冬雁,
黎孟枫主译,1999,分子克隆实验指南(第二版),科学出版
社,中国,北京,pp.343-362)
XiaL.Q.,andGuoS.D.,2000,AmethodofRNAfastextracting
incotontissues,MianhuaXuebao (ActaGossypiSinica),
12(4):205-207(夏兰芹,郭三堆,2000,棉花 RNA的快速
提取方法,棉花学报,12(4):205-207)
ZhangJ.J.,WangY.J.,WangX.P.,YangK.Q.,andYangJ.X.,
2003,AnimprovedmethodforrapidlyextractingtotalRNA
fromVitis,GuoshuKexue(JournalofFruitScience),20(3):
178-181(张今今,王跃进,王西平,杨克强,杨进孝,2003,
葡萄总RNA提取方法的研究,果树学报,20(3):178-181)
ZhangY.J.,MengX.C.,PanR.C.,andWangX.J.,2001,Modifi-
cationofthemethodsofextractingtotalRNAfromGerbera
hybridaCorolatissue,ZhiwuxueTongbao (ChineseBul-
letinofBotany),18(6):722-726(张玉进,孟祥春,潘瑞炽,
王小菁,2001,非洲菊总 RNA提取方法的改进,植物学通
报,18(6):722-726)
ZhouM.B.,WangH.Z.,andZhaoD.G.,2003,Fastextractionof
RNAinbarksandleavesofEucommiaulmoidesOlive,
ShandiNongyeShengwuXuebao(JournalofMountainA-
gricultureandBiology),22(5):430-431(周明兵,王红珍,
赵德刚,2003,杜仲叶和树皮总 RNA的快速提取方法,山
地农业生物学报,22(5):430-431)
羊蹄甲果荚中总RNA提取的新方法
NewMethodforTotalRNAExtractioninLegume!fBauhiniaVariegata 149