全 文 ：分子植物育种，2014年，第 12卷，第 2期，第 356-362页
Molecular Plant Breeding, 2014, Vol.12, No.2, 356-362
技术主题
Technology Feature
甘菊下胚轴遗传转化体系的建立
亓帅 付建新 王翊 杨立文 戴思兰 *
北京林业大学园林学院,北京, 100083
*通讯作者, silandai@gmail.com
摘 要 甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium (Fisch. ex Trautv.) Makino)可作为菊花遗传育种研究模式植物，
但目前尚未建立甘菊的遗传转化体系。本研究在甘菊下胚轴再生体系的基础上，以甘菊下胚轴为外植体，对
影响转化体系的 5个因素进行筛选，尝试利用农杆菌介导的方法获得最佳转化体系。研究结果表明：甘菊下
胚轴在不经过预培养，农杆菌浓度 OD600=0.4时浸染 10 min，共培养 2 d，延迟培养 1 d时抗性芽分化率和转
化率均最高。通过卡那霉素抗性筛选及 PCR检测，获得 45株 PCR阳性植株，阳性转基因植株频率为 5%。
关键词 甘菊,下胚轴,农杆菌介导,遗传转化
Establishment of Genetic Trasformation System for Chrysanthemum
lavandulifolium
Qi Shuai Fu Jianxin Wang Yi Yang Liwen Dai Silan *
College of Landscape Architecture, Beijing Forestry University, Beijing, 100083
* Corresponding author, silandai@gmail.com
DOI: 10.13271/j.mpb.012.000356
Abstract Genetic transformation system of Chrysanthemum lavandulifolium which is the model plant of chrys-
anthemum genetic engineering has not been established. Using hypocotyl of Chrysanthemum lavandulifolium as
explants, an efficient and stable genetic transformation system mediated by Agrobacterium was established
through investigating some factors influencing the transformation efficiency. The highest transformation frequency
was obtained, with no pre-cultivate, the suitable infection duration 10 min with bacterial concentration OD600=0.4,
appropriate co-culture for 2 days. Several putative transformants were obtained after two round of selection proc-
edure. PCR analysis indicated that target gene had been integrated into the genome of Chrysanthemum lavan-
dulifolium and its transgenic frequency was 5%.
Keywords Chrysanthemum lavandulifolium, Hypocotyl, Agrobacterium-mediated, Genetic transformation
收稿日期：2013-07-05 接受日期：2014-02-06 网络出版日期：2014-02-10
URL: http://5th.sophiapublisher.com/abstract-1704-mpbopa
基金项目：本研究由高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(20130014110013)和北京市自然科学基金资助项目(6132020)
共同资助
甘菊 (Chrysanthemum lavandulifolium (Fisch. ex
Trautv.) Makino)为菊花 (Chrysanthemum morifolium
Ramat.)起源亲本之一(戴思兰, 1994,北京林业大学,
pp.71-72)，其为二倍体(周树军和汪劲武 , 1997;汪
劲武等, 1991)，遗传背景简单，适宜作菊科植物遗传
育种研究的模式植物(彭玉华等, 2010)。菊花是中国
的传统名花，从原始野生种类经过人工栽培、杂交
和培育，已经成为世界上品种最多的栽培植物之一
(李鸿渐和邵建文, 1990)。利用甘菊进行基础生物学
研究，对于解析菊科植物一些生物学现象，并进行品
种改良研究具有重要意义(付建新等, 2012)。目前已
经对甘菊进行了很多生物学研究，涉及到开花期相
关基因(白凌等, 2007)、抗逆性相关基因(刘振林等,
2008)等，并得到了许多优良的基因资源，但由于一
直没有建立甘菊遗传转化体系，因此只能在模式植
物中进行基因功能验证(白凌等, 2007)。早在 2005
年，丁焱和戴思兰(2005)已建立起甘菊再生体系，在
此基础上，付建新等(2012)做了改进，以下胚轴为材
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
料，建立了甘菊下胚轴离体再生体系，但尚未见甘菊
遗传转化的相关报道。
本研究在借鉴前人建立的甘菊下胚轴再生体系
的基础上，尝试建立甘菊下胚轴高效转化体系，为后
期开展甘菊转基因研究提供平台。
1结果与分析
1.1卡那霉素适宜筛选浓度的确定
由表 1看出，下胚轴在卡那霉素浓度为 3 mg/L
时有 40%褐化，不能生成愈伤组织，诱导出的愈伤组
织后期也会逐渐褐化死亡不能分化成苗，所以甘菊
下胚轴对卡那霉素的选择压为 1 mg/L。正常生长的
愈伤组织在卡那霉素浓度为 10 mg/L时已完全不能
分化，而在卡那霉素浓度为 5 mg/L时愈伤组织达到
半致死，有 43%可以分化，所以愈伤组织对卡那霉素
的选择压为 5 mg/L。试验结果也说明下胚轴较愈伤
组织对卡那霉素更加敏感。
1.2预培养时间对转化率的影响
下胚轴不经过预培养直接进行农杆菌浸染，抗性
苗分化率为 18%，经过一段时间预培养后其转化率
下降，故甘菊下胚轴不经过预培养为宜(表 2)。正常情
况下，下胚轴只需 12~13 d即诱导出大量成熟的愈伤
组织，速度非常快，因此经过预培养后，切口边缘可
能已开始分化形成愈伤组织，不利于农杆菌附着。
表 1 Kan浓度对甘菊下胚轴及愈伤组织的影响
Table 1 Effect of Kanamycin on hypocotyls and callus of C. lavandulifolium
卡那霉素浓度(mg/L)
Kan concentration (mg/L)
0
1
3
5
10
愈伤组织分化率(%)
Callus rate of differentia-
tion (%)
73
68
60
43
0
1.3菌液浓度对转化率的影响
不同浓度农杆菌浸染甘菊下胚轴时转化率不
同，当菌液 OD600小于 0.4时，抗性芽再生率比较
高，在菌液 OD600=0.4 时抗性芽再生率达到 15.3%
(表 3)。当菌液浓度继续提高时，分化率降低。分析原
因，下胚轴为非常幼嫩的组织，农杆菌浓度高会导致
其在培养过程中过度生长对下胚轴产生毒害致死。
因此甘菊下胚轴的农杆菌浸染最佳浓度为 OD600在
0.1~0.4之间。
1.4浸染时间对转化率的影响
农杆菌浸染时间对甘菊下胚轴转化率有较大的
影响，试验结果表明，浸染 10~15 min，抗性芽再生率
达到最高，在 10 min时达到 18% (表 4)。试验中也发
现，菌液浓度和浸染时间是一对共同作用的因素，当
菌液浓度低时，需要的浸染时间较长，而菌液浓度高
时，浸染时间则要缩短。
1.5共培养时间对转化率的影响
如表 5所示，甘菊下胚轴与农杆菌共培养最佳
时间为 2 d，抗性芽分化率达到最高值 23%，之后随
着共培养时间的延长，由于农杆菌过度增殖而对下
胚轴的毒害作用也随之增强，分化频率不断下降，但
褐化率没有明显增大，而且转化率有所提高，因此本
研究认为在试验中若没有明显农杆菌菌落出现，可
以适当延长共培养时间。
表 2预培养时间对甘菊下胚轴分化的影响
Table 2 Effect of pre-culture time on hypocotyl differentiated of C. lavandulifolium
预培养时间
Pre-culture time
0
1
2
3
接种数
Numerber of explants inoculated
200
200
200
200
抗性芽获得率(%)
Rate of resistant buds (%)
18.0
13.3
12.0
4.0
转化率(%)
Transformation frequency (%)
17
6
10
8
诱导愈伤率(%)
Rate of callus (%)
90
73
60
10
1
分化率(%)
Rate of differentiation (%)
73
30
0
0
0
下胚轴
Hypocotyls
357
1.6延迟培养时间对转化率的影响
加入抗生素的时间早晚也是影响遗传转化的
重要因素。从表 6 可以看出，共培养结束后，经过
一段时间的延迟培养，再把下胚轴接到筛选培养基
上，能提高抗性芽获得率，其中，以延迟培养 1 d 的
效果最佳。
1.7最佳转化体系
由上面的分析可得出甘菊下胚轴最佳转化体
系：甘菊下胚轴在不经过预培养，菌液浓度 OD600=
0.1~0.4时浸染 10~15 min，共培养 2~4 d，延迟培养
1 d时，转化率最高。
1.8 转基因植株的获得
利用本研究的方法，我们成功获得了大量抗性植
株(图 1)。目前，在含有目的基因的农杆菌株 GV3101
浸染的甘菊下胚轴外植体中，获得再生植株约 115
株，对这些植株进一步进行了转基因 PCR检测。
1.9 PCR检测
用 Edwards法(郭兆奎等, 1999)提取再生转化甘
菊总 DNA，通过 PCR扩增检测目的基因表达情况。
以非转基因甘菊作为阴性对照，1%琼脂糖凝胶电泳
表 6延迟培养时间对甘菊下胚轴分化的影响
Table 6 Effects of delayed screening culture time on hypocotyl differentiated of C. lavandulifolium
延迟培养时间(d)
Later-culture time (d)
0
1
2
3
接种数
Numerber of explants inoculated
200
200
200
200
抗性芽获得率(%)
Rate of resistant buds (%)
8.7
25.0
8.0
18.0
转化率(%)
Transformation frequency (%)
5.5
27.0
6.0
8.0
甘菊下胚轴遗传转化体系的建立
Establishment of Genetic Trasformation System for Chrysanthemum lavandulifolium
表 3菌液浓度对甘菊下胚轴分化的影响
Table 3 Effects of bacterial concentration on hypocotyl differentiated of C. lavandulifolium
菌液浓度(OD600)
Bacterial concentration (OD600)
0.1
0.4
0.6
0.8
接种数
Numerber of explants inoculated
200
200
200
200
抗性芽获得率(%)
Rate of resistant buds (%)
13.3
15.3
4.0
8.0
转化率(%)
Transformation frequency (%)
12.0
13.3
8.0
4.0
表 4农杆菌浸染时间对甘菊下胚轴分化的影响
Table 4 Effects of infection time on hypocotyl differentiated of C. lavandulifolium
浸染时间(min)
Infection time (min)
5
10
15
20
接种数
Numerber of xplants inoculated
200
200
200
200
抗性芽获得率(%)
Rate of resistant buds (%)
6
18
16
6
转化率(%)
Transformation frequency (%)
5.0
15.3
14.0
6.0
表 5共培养时间对甘菊下胚轴分化的影响
Table 5 Effects of co-culture time on hypocotyl differentiated of C. lavandulifolium
共培养时间(d)
Co-culture time (d)
1
2
3
4
接种数
Numerber of explants inoculated
200
200
200
200
抗性芽获得率(%)
Rate of resistant buds (%)
4
23
12
10
转化率(%)
Transformation frequency (%)
4.0
17.0
7.0
12.7
358
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
部分结果如图 2所示，转基因植株均扩增出 649 bp
的目的条带，非转化阴性对照植株则无此条带，通过
PCR检测，共得到 45株阳性转基因植株。同时表明
此 PCR体系可以扩增到 SOC1基因片段。
2讨论
分子育种具有精确性、科学性、速度快、目标性
强等特点，已经成为植物育种的重要手段，而建立遗
传转化体系是其关键技术步骤。
目前观赏植物采用的转基因方法主要有农杆菌
介导法、基因枪法、花粉管通道法、激光法等(崔广荣,
2003)。农杆菌介导法具有许多优点：操作简便；效率
高；稳定性好；可以用不同的启动子进行特异表达及
较少出现基因沉默等(王关林和方宏筠, 2002, 科学
出版社, pp.395-397; Hooykaas and Schilperoort, 1992)，
因此广泛应用在各类植物转基因研究中。
图 1转基因植株筛选流程
注: A:愈伤组织; B,C:抗性芽 D:抗性苗
Figure 1 Screening of transgenic plants
Note: A: Callus; B,C: Resistant bud; D: Resistant plant
图 2 PCR分析检测阳性植株结果
注 : M: D2000 plus DNA marker; 1: 阳性对照 ; 2: 阴性对照 ;
3~11:转 SOC1基因阳性植株
Figure 2 The results of PCR analysis
Note: M: D2000 plus DNA marker; 1: Positive control; 2: Nega-
tive control; 3~11: Transgenic positive plants
根据植物材料的特点选择合适外植体作为受体
非常重要。比如在香蕉中，采用的受体材料包括原生
质体、胚性细胞、茎尖分生组织等(胡春华等, 2010)。
在大豆中，采用的受体材料有初生叶(Wrigh et al.,
1987)、幼胚轴(Mccabe et al., 1988)、子叶节(Olhoft et
al., 2003; Chen, 2004)等。在番茄中对叶片、子叶和下
胚轴三种外植体的再生能力进行了比较(欧阳波等,
2002)，其再生能力为叶片>子叶>下胚轴(Düzyaman
et al., 1994)，再生芽生长速度为下胚轴>子叶>叶片
(Plastira and Perdikaris, 1997)。对大豆子叶节和下胚
轴进行了比较，二者筛选条件和转化条件都存在区
别(段莹莹等, 2010)。鉴于之前探索甘菊叶片转化体
系试验的失败经验，而甘菊下胚轴中已建立起成熟
的离体再生体系，因此本次研究中我们选用的受体
材料是甘菊下胚轴。通过试验发现，以下胚轴做外植
体，优点有以下方面：(1)试验周期短。无论是下胚轴
的获得还是再生，其速度都明显快于其他外植体，这
个特点使其显著优于其他外植体。(2)筛选方便。甘菊
下胚轴对于抗生素非常敏感。(3)成本低。下胚轴因其
体积小，在试验中运用的培养基、菌液等各类材料都
很较少，因此有效减少了试验成本和工作量。但是，
也有其缺点：对操作技术要求高。切取的下胚轴既不
能太大也不能太小，最适宜的位置是刚好切取其生
长点位置，这对实验操作技术较高。
试验中需要添加两种抗生素，一种是卡那霉素，
可以通过选择压筛选出阳性株系，另一种是羧苄青
霉素，用于抑制后期农杆菌过度生长。我们对这两种
抗生素的浓度进行了筛选。抗生素的使用一般会对
外植体的生长分化造成一定影响，相对于其他外植
体，下胚轴对抗生素通常更为敏感。本次试验中对下
胚轴及愈伤组织进行了卡那霉素筛选，发现甘菊下
胚轴的卡那霉素选择压为 1 mg/L，愈伤组织的卡那
霉素选择压为 5 mg/L。这个浓度既可以筛掉大部分
假阳性苗，又不影响阳性植株的正常生长。我们后期
在培养基中加入了 400 mg/L的 Carb，没有出现农杆
菌污染现象，而且植株生长也没有受到影响，因此
Carb浓度为 400 mg/L较为适宜。
一般而言，外植体先经过一段时间的预培养后
再进行浸染，既可以减少农杆菌的损伤又能促进细
胞处于最佳分裂状态。但不同植物对农杆菌的敏感
度不同，因此预培养时间要根据情况确定。本研究发
现不经过预培养的甘菊下胚轴转化率最高，这与有
些植物结果相似，如烟草叶片(张宁和王蒂, 2004)、爬
行卫矛下胚轴(尚爱芹等, 2008)。
359
不同外植体对农杆菌浓度及浸染时间都有不同
要求。农杆菌的浓度与浸染时间是两个共同作用的
因子。浓度过低、浸染时间过短，导致农杆菌不能成
功附着；而浓度过高、浸染时间过长，农杆菌会对外
植体产生较大伤害，两种情况都会导致转化率降
低。本研究发现农杆菌浓度为 OD600=0.1~0.4时浸染
10~15 min时转化率最高。
共培养是目的基因整合的关键阶段，直接影响
转化细胞的数量，大量试验也表明共培养时间是影
响遗传转化的最关键因素(Sangwan et al., 1991)。理
论上来说，共培养的时间越长，受浸染的细胞数目越
多，转化率也就越高，但共培养的时间过长会导致外
植体受农杆菌感染而软腐、变褐、死亡(李文兰等,
2010)。本研究发现甘菊下胚轴与农杆菌共培养最佳
时间为 2~4 d。
选择压大小及加入选择压的时间是遗传转化中
的重要环节，确定选择压目的是使转化细胞在适宜
的选择压力下发育成苗并要抑制非转化细胞的生长
(于淼等, 2009)。本研究发现甘菊下胚轴的最佳延迟
培养时间为 1 d。
3材料与方法
3.1试验材料
本研究所用甘菊种子为 2011 年秋采集于北京
大学校园内，供试菌株为根癌农杆菌菌株 EH105，植
物表达载体 PBI121带有甘菊 SOC1同源基因和卡那
霉素抗性基因，启动子为 35S和终止子 NOS (表达载
体如图 3所示)。试验所需培养基见表 7。
3.2工程菌液制备
操作均在超净工作台上进行，保证无其他杂菌
图 3表达载体 pBI121
Figure 3 The structure of binary vector pBI121
表 7试验所需培养基类型
Table 7 Several medium type for the experiment
培养基
Culture medium
MS0
MS1
MS2
MS3
MS4
培养基组成
Culture mediumingredients
1/2MS medium+30 g/L Sucrose, pH 5.8
MS medium+30 g/L Sucrose+6 g/L Agar, pH 5.8
MS medium+30 g/L Sucrose+6 g/L Agar+2,4-D 1.0 mg/L+0.5 mg/L 6-BA, pH 5.8
MS medium+30 g/L Sucrose+6 g/L Agar, pH 5.8
MS medium+30 g/L Sucrose+0.1 mg/L NAA+6 g/L Agar, pH 5.8
功能
Function
液体共培养培养基
Liquid co-culture medium
种子萌发培养基
Seed germination medium
愈伤组织诱导培养基
Callus induction medium
分化培养基
Differentiation medium
生根培养基
Rooting medium
污染。从 LB培养平板上(Rif+, Kan+)用消毒牙签挑取
含有目的基因的农杆菌单菌落，接种于加有 80 mg/L
利福平和 100 mg/L卡那霉素的 LB液体培养基，在
28℃摇床内 180 r/min振荡培养过夜，以 1/1000的比
例活化，然后 4 000 r/min，4℃离心 10 min，收集菌
液，重悬于MS0。
3.3甘菊下胚轴的获得
选取发育良好的甘菊种子先进行灭菌：75%乙醇
浸泡 30 s，无菌水冲洗 3次，每次 1 min，2.5%次氯酸
钠溶液浸泡 10 min，无菌水冲洗 5~8次直至完全冲
洗干净。将灭菌的甘菊种子均匀接种于MS1中。在
组培室黑箱中进行黑暗培养。7 d后下胚轴长度达到
1.4~1.8 cm，用手术刀切取长度为 3 mm的甘菊下胚
轴作为外植体。
3.4甘菊下胚轴及愈伤组织抗生素敏感程度试验
将刚切取的甘菊下胚轴分别加入卡那霉素浓度
为 0、1 mg/L、3 mg/L、5 mg/L 和 10 mg/L 的 MS2 培
养基，置于黑暗条件下培养，15 d后观察愈伤组织状
态，并统计能够形成愈伤组织的外植体数，计算出愈
伤组织形成率。每处理取 30个甘菊下胚轴，重复 3
次。取生长良好甘菊的切取下胚轴在MS2培养基上
诱导愈伤组织，然后将生长良好的愈伤组织转接到
不同浓度卡那霉素的 MS3培养基，培养机中卡那霉
甘菊下胚轴遗传转化体系的建立
Establishment of Genetic Trasformation System for Chrysanthemum lavandulifolium 360
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
素浓度分别为 0、1 mg/L、3 mg/L、5 mg/L和 10 mg/L。
每隔 7 d继代 1次，1个月后统计并计算不定芽分化
率。每个处理接种甘菊愈伤组织为 30个，每个处理
重复 3次。
3.5影响农杆菌转化效率的因素
采用正交试验设计，对影响转化率的几个关键
因子进行了筛选试验。
预培养时间：切取长度约 3 mm大小的甘菊下胚
轴作为外植体，接种到 MS2培养基上，在黑暗条件
下进行预培养。预培养时间分别为 0、1 d、2 d和 3 d。
浸染条件：MS0重悬菌液，用分光光度计测定其
浓度，调节其 OD600值分别为 0.1、0.4、0.6和 0.8。将
预培养后的下胚轴在农杆菌菌液中浸染，浸染时间
分别为 5 min、10 min、15 min和 20 min。用无菌滤纸
将下胚轴上的菌液吸干净，接到MS2培养基上。
共培养时间：将浸染后的下胚轴在组培室正常
光照条件下进行共培养，共培养时间分别为 1 d、2 d、
3 d和 4 d。
延迟培养时间：共培养后先用无菌水冲洗，然后
在 4 000 mg/L的羧苄青霉素中清洗 15 min，之后再
用无菌水冲洗 4~5次，用无菌滤纸吸干。将清洗干净
的下胚轴接到延迟培养培养基进行延迟培养，延迟
培养时间分别为 0、1 d、2 d和 3 d。
延迟培养后将其移到含有卡那霉素和羧苄青霉
素 500 mg/L的MS2培养基。长出愈伤组织后，将其
接到 MS3培养基，诱导分化形成不定芽，将长出的
丛生状态的不定芽分开后接到 MS4培养基，不定根
长至 1 cm时移栽到 V(泥炭):V(蛭石)=1:1的甘菊最
佳无土栽培基质中(彭玉华等, 2010)，进行正常养护。
3.6转基因植株的 PCR检测
取植株 30~50 mg叶片，采用 Edwards法提取基
因组 DNA (郭兆奎等, 1999)。引物由生工生物工程股
份有限公司合成，用 PBI121载体上的通用引物 35 s
和 nos进行多次 PCR检测。以 pBI121+SOCI质粒为
阳性对照，以非转基因植株为阴性对照，对转基因植
株进行 PCR检测。反应体系为 20 μL，模版 DNA
500 ng，dNTP 200 μmol/L，上、下游引物浓度分别为
1 μmol/L，Taq DNA聚合酶 2 U。PCR扩增反应程序
为：94℃预变性 5 min；94℃变性 1 min，56℃退火
1 min，72℃延伸 40 s，35 循环；72℃延伸 10 min。
PCR结束后，进行 1%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像
系统照相。
作者贡献
亓帅、付建新和戴思兰是本研究的实验设计和
实验研究的执行人；亓帅完成数据分析，论文初稿的
写作；王翊和杨立文参与实验设计，试验结果分析；
戴思兰是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数
据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最
终的文本。
致谢
本研究由高等学校博士学科点专项科研基金资
助项目(20130014110013)和北京市自然科学基金资
助项目(6132020)共同资助。
参考文献
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