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薇甘菊叶的总黄酮提取及抑菌活性研究



全 文 :第 31 卷 第 2 期
2014 年 6 月
广东工业大学学报
Journal of Guangdong University of Technology
Vol. 31 No. 2
June 2014
收稿日期:2013-12-04
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30772739)
作者简介:张 敏(1987-),女,硕士研究生,主要研究方向为天然药物及其药理学.
通讯作者:韩雅莉(1957-),女,教授,博士,E-mail:ylhan57@ 126. com
doi:10. 3969 / j. issn. 1007-7162. 2014. 02. 026
薇甘菊叶的总黄酮提取及抑菌活性研究
张 敏,韩雅莉
(广东工业大学 轻工化工学院,广东 广州 510006)
摘要:以总黄酮提取率为考察指标,采用超声波辅助提取薇甘菊叶中的总黄酮,并采用正交设计试验优化薇甘菊叶
的总黄酮提取工艺.通过体外抑菌实验,利用打孔法和试管法分别测定了其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏
菌、志贺菌这 4 种常见细菌的抑菌活性和最低抑菌浓度(MIC).结果表明,叶中总黄酮最佳提取条件为乙醇体积分
数 50%、料液比 1∶ 30、超声功率 50 W、超声时间 50 min,此条件下黄酮得率为 10. 62%;薇甘菊叶的黄酮提取物对金
黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺菌均有良好的抑菌活性,其最低抑菌浓度分别为 1. 562 5、1. 562 5、3. 125 0、
3. 125 0 mg /mL(以黄酮质量浓度计).
关键词:薇甘菊叶总黄酮;超声波辅助提取;抑菌活性
中图分类号:TS201. 2 文献标志码:A 文章编号:1007-7162(2014)02-0133-06
Extraction of Total Falconoids from Mikania Micrantha and
Study of Antibacterial Activities
Zhang Min,Han Ya-li
(School of Chemical Engineering and Light Industry,Guangdong University of Technology,Guangzhou 510006,China)
Abstract:With the falconoids extraction rate as index,total flavonoids from Mikania Micrantha leaves
were extracted by the ultrasonic assistance method,and the extraction process was optimized by the or-
thogonal design. Moreover,the in vitro antibacterial activity (inhibition zone diameter)and minimum in-
hibitory concentration (MIC)of the above product against Staphyloccocus aureus,Escherichia coli,Sal-
monella and Shigella were identified by the diffusion method and test tube method respectively. The re-
sults show that the optimum extracting conditions are as follows:ethanol concentration is 50%,the ratio
of material to 1iquid 1∶ 30,ultrasonic power 50 W,and time 50 min,and the extracting rate of leaves is
10. 62 % . Under such conditions,the above extract of flavonoids has good antibacterial activities against
Staphyloccocus aureus,Escherichia coli,Salmonella and Shigella,and the MIC is 1. 562 5,1. 562 5,
3. 125 0,3. 125 0 mg /mL respectively (calculated through the flavonoid quality concentration).
Key words:total falconoids of Mikania Micrantha leaves ;ultrasonic assistant extraction ;antibacterial
activity
薇甘菊(Mikania Micrantha)是菊科假泽兰属多
年生藤本植物,也称小花蔓泽兰或小花假泽兰.因其
具有超强繁殖能力且适于攀缘缠绕于乔灌木,往往
重压于其冠层顶部阻碍该植物光合作用,继而导致
其死亡,被认为是世界上最具危险性的有害植物之
一,因而被称为“植物杀手”[1]. 薇甘菊原产于中美
洲,现已广泛分布于我国海南及珠江三角洲地区,它
已被列入中国首批外来入侵物种[2]. 如何对其进行
防除和有效的开发利用已成为治理的关键[3-4]. 目
前对薇甘菊的开发利用研究主要集中于对其进行营
养成分的提取和生理活性物质的发现[5-6]等方面.
有关研究发现薇甘菊中含有多种化学成分[7],包括
单萜、倍半萜、醇和酮的衍生物、黄酮类化合物等,其
中多种物质具有潜在的保健与药用价值.
随着崇尚自然的消费理念逐步得到人们的认
可,天然防腐剂的研究与开发成为了防腐剂领域的
研究热点[8].从天然产物中寻找植物源抗菌剂已成
为植物学的研究方向之一.为此,本文主要研究了薇
甘菊叶总黄酮提取工艺,并对其进行了黄酮提取液
体外抑菌活性研究,以期为薇甘菊的开发利用提供
实验参考.
1 材料与仪器
1. 1 材料与试剂
薇甘菊叶采于 2 月份的广州市番禺区广东工业
大学外环路,日照充足,洗净,60 ℃烘干,粉碎过 40
目筛,备用. 大肠杆菌(E. coli)、金黄色葡萄球菌
(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonella )以
及志贺菌(Shigella)均由广东工业大学微生物实验
室提供.
胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)(青岛高科园海博生
物技术有限公司,批号:20130725)、琼脂粉(青岛高
科园海博生物技术有限公司,批号:20130304). 芦
丁、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇、石油醚
均为分析纯.
1. 2 设备与仪器
BS224S型电子分析天平(北京赛多利斯科学仪
器有限公司);SHZ-D(Ⅲ)型循环水式多用真空泵
(巩义市予华仪器有限责任公司);KQ2200- DV 型
超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);UV-
1800 型紫外-可见分光光度计(上海精密科学仪器
有限公司);LDZM-60KCS 立式压力蒸汽灭菌器(上
海申安医疗器械厂);DHP-9052 型电热恒温培养箱
(上海一恒科学仪器有限公司);HD-650-U 标准型
净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司);ZHWY-
103B型多振幅轨道摇床(上海智城分析仪器制造有
限公司).
2 实验方法
2. 1 超声辅助提取薇甘菊叶黄酮工艺研究
2. 1. 1 芦丁标准曲线的绘制
参考文献[9-10]中的方法,用体积分数 70%的
乙醇溶解 10. 2 mg芦丁标准品后定容到 100 mL.分
别取芦丁标准溶液 0、1、2、3、4、5 mL 到 6 支 10 mL
刻度试管中,加 0. 3 mL 质量浓度 5%的亚硝酸钠水
溶液,摇匀,放置 6 min;加 0. 3 mL 质量浓度 10%的
硝酸铝溶液,摇匀,放置 6 min;加摩尔浓度为 1 mol /
L氢氧化钠溶液 4. 0 mL,用体积分数 70%的乙醇定
容至 10 mL,摇匀,以空白溶液为参照,用紫外可见
分光光度计测不同质量浓度芦丁溶液在 510 nm 下
吸光度,以芦丁质量浓度(mg /mL)为横坐标、吸光
值 A为纵坐标绘制标准曲线.
2. 1. 2 黄酮提取液的制备
将薇甘菊叶的粉末与石油醚按 1∶ 10(g /mL)混
合,静置 2 h,抽滤,滤渣晾干备用. 称取处理过的粉
末 1 g 置 150 mL 锥形瓶中,加入适量乙醇,进行超
声辅助提取.将醇提液抽滤后定容至 100 mL,备用.
2. 1. 3 样品总黄酮的测定
将薇甘菊叶黄酮待测液进行适量稀释,取稀释
液 1 mL,按 2. 1. 1 中方法加样,在波长 510 nm 下测
吸光度 A,按式(1)计算样品溶液中总黄酮质量浓度
(mg /mL),据式(2)可得总黄酮提取率.
总黄酮质量浓度 =(A - 0. 002 9)11. 497 (mg /mL),(1)
总黄酮提取率 =
总黄酮质量浓度 × 10 × 5 × 100
1 000 × 1. 000 5 × 100% . (2)
2. 1. 4 单因素实验
采取确定 3 个因素、变换 1 个因素的方法分别
对料液比、乙醇体积浓度、超声功率、超声时间这 4
个关键因素进行分析[11].料液比(g /mL)分析:确定
提取时间为 30 min,乙醇体积分数为 70%,超声功
率为 60 W,料液比分别为 1 ∶ 10、1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 25、
1∶ 30、1∶ 40;乙醇体积浓度(V /V)分析:确定提取时
间为 30 min,物料比为 1∶ 30,超声功率 60 W,将乙醇
体积分数设定为 30%、40%、50%、60%、70% 和
80%;超声功率(W)分析:确定提取时间为 30 min,
物料比为 1∶ 30,乙醇体积分数为 50%,超声功率为
40、50、60、70、80、90 W;超声时间(min)分析:确定
乙醇体积分数为 50%,料液比为 1∶ 30,超声功率 60
W,超声时间分别为 10、20、30、40、50、60 min.
2. 1. 5 正交试验设计
在单因素试验基础上,以乙醇体积浓度、超声功
率、超声时间,料液比为考察因素,每个因素 3 水平
进行 L9(34)正交试验(表 1),以总黄酮提取率为考
察指标,确定最佳提取工艺[12].
431 广 东 工 业 大 学 学 报 第 31 卷
表 1 因素水平设计
Tab. 1 Factors and levels
水平
因素
A
料液比
/(g·mL -1)
B
乙醇体积分数
/%
C
超声时间
/min
D
超声功率
/W
1 1∶ 20 40 30 50
2 1∶ 30 50 40 60
3 1∶ 40 60 50 70
2. 2 体外抑菌实验
2. 2. 1 薇甘菊叶的总黄酮提取液的制备
根据 1. 3 中最佳提取工艺,称取叶的粉末 10 g,
提取溶剂为体积分数为 50%的乙醇,料液比 1∶ 30,
超声功率 50 W,提取时间 50 min.然后抽滤除去废
渣,旋蒸浓缩至无醇味即得叶的黄酮提取液(经紫
外分光光度测定总黄酮质量浓度为 12. 5 mg /mL).
2. 2. 2 供试菌种菌悬液制备
准确移取 80 μL活化好的菌液于装有 4 mL 无
菌水的试管中,充分摇匀,校正浓度至 0. 5 麦氏标
准[13],使含菌量达到 108 cfu /mL,备用.
2. 2. 3 样品抑菌效果测定
采用打孔法 [14-15]. 选用同样规格培养皿,每皿
加 20 mL培养基,凝固后,将各菌种悬液 100 μL 分
别加入各平板表面,均匀涂开菌种,待平板干燥后,
用直径为 6 mm 的玻璃管(0. 1 MPa、121 ℃灭菌 20
min)打孔.每皿均为 4 孔,每菌做 3 次重复. 以硫酸
链霉素为阳性对照,以无菌水为空白对照,每孔加样
60 μL.将细菌置 37 ℃恒温培养箱培养 24 h.取出后
测量抑菌圈大小,比较其抑菌效果.直径大于 9 mm
抑菌圈为有显著抑菌效果,小于 6 mm 为无抑菌效
果,抑菌圈在 6 ~ 9 mm之间为有一定抑菌作用.
2. 2. 4 最低抑菌浓度(MIC)测定
采用试管法[16-17].取 36支灭菌试管分为 4 组,每
组 9支.每支试管加入1 mL TSB液体培养基,另每组
第 1支试管加入 1 mL薇甘菊叶黄酮醇提液(黄酮质
量浓度为 12. 5 mg /mL),混匀液体,再从每组第 1 管
吸取 1 mL混匀液到每组第 2 管中,如此类推一直到
第 8管,再从第 8管中吸取1 mL混匀液舍去,第 9管
为细菌对照组,不加药液. 4组试管分别加入金黄色葡
萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌和志贺菌液各 50 μL.另
取 9支试管,稀释步骤按上述进行,此组不加入菌液,
为药液对照组.将试管置于 37 ℃摇床中振荡培养 24
h,实验组与对照组对比观察结果.
3 结果与讨论
3. 1 芦丁标准曲线的绘制
图 1 为芦丁标准曲线,表明在 0 ~ 0. 05 mg /mL
质量浓度范围内的芦丁标准品在波长 510 nm 下吸
光度有良好的相关性. 线性方程为:y = 11. 497x +
0. 002 9;R2 = 0. 999 2.
图 1 芦丁标准曲线
Fig. 1 Standard Curve
3. 2 单因素实验结果
3. 2. 1 料液比对总黄酮提取率的影响
由图 2 可知,随料液比的增加,总黄酮提取率呈
先上升后下降趋势,料液比为 1∶ 30 时薇甘菊总黄酮
提取率达到最大. 其原因可能是在短时间内超声波
促使组织细胞膜急剧破裂,随之萃取的黄酮类物质
迅速进入溶剂,直至达到饱和. 但当料液比增加至
1∶ 30后,增加溶剂不但不会增加其提取率,反而会更
有利于杂质溶出,因而提取率有所下降.
图 2 料液比对薇甘菊总黄酮提取率的影响
Fig. 2 The influence of liquid-material ration on falconoids
extraction
3. 2. 2 乙醇体积浓度对总黄酮提取率的影响
由图 3 看出,随乙醇体积浓度提高总黄酮提取
率呈先上升后下降趋势,乙醇体积分数达 50%时黄
酮提取率最高.可能是溶剂浓度太低,不利于其渗透
进入植物细胞内,随着乙醇体积分数的提高,黄酮类
化合物溶出量增加.当乙醇体积浓度到一定水平时,
部分水溶性黄酮类化合物溶出量降低,相反一些脂
溶性成分溶出,造成黄酮得率相对降低.
531第 2 期 张 敏,等:薇甘菊叶的总黄酮提取及抑菌活性研究
图 3 乙醇体积浓度(体积分数)对薇甘菊总黄酮提取率的
影响
Fig. 3 The influence of ethanol concentration on falconoids
extraction
3. 2. 3 超声功率对总黄酮提取率的影响
由图 4 可知,随超声功率增大,总黄酮提取率呈
先上升后下降趋势,当超声功率为 60 W 时总黄酮
提取率最高.这可能是不同物质对超声功率有不同
的适应范围,超过此范围超声可能会导致目标产物
降解,因而提取率显著下降.
图 4 超声功率对薇甘菊总黄酮提取率的影响
Fig. 4 The influence of ultrasonic power on falconoids ex-
traction
3. 2. 4 超声时间对总黄酮提取率的影响
由图 5可知,随时间延长总黄酮提取率呈先上升
后下降趋势,时间为 40 min 时总黄酮量最大.可能是
达一定时间后大部分黄酮类物质已经溶出,继续延长
提取时间反而导致黄酮水解,导致提取率降低.
图 5 超声时间对薇甘菊总黄酮提取率的影响
Fig. 5 The influence of ultrasonic time on falconoids extraction
3. 3 提取工艺正交实验结果
由表 2 可知,各因素对薇甘菊叶黄酮提取影响
的大小顺序为 B > A > D > C,即乙醇体积浓度 >料
液比 >超声功率 >超声时间. 最佳提取条件组合为
B2A2D1C3,即:乙醇体积分数 50%、料液比 1∶ 30、超
声功率 50 W,超声时间 50 min,在此条件下薇甘菊
叶黄酮提取率为 10. 616% .分别取 3 份同一批次的
薇甘菊叶的粉末,在最优组合条件下进行提取,重复
3 次,总黄酮提取得率分别为 10. 62%、10. 80%、
10. 54%,RSD 值为 0. 012 %,证明该方法稳定可靠.
表 2 正交试验结果
Tab. 2 Results of orthogonal experiments
序号
各因素水平
A B C D
叶中黄酮
得率 /%
1 1 1 1 1 9. 518
2 1 2 2 2 9. 903
3 1 3 3 3 10. 091
4 2 1 2 3 9. 850
5 2 2 3 1 10. 616
6 2 3 1 2 10. 359
7 3 1 3 2 9. 807
8 3 2 1 3 10. 442
9 3 3 2 1 10. 370
K1 9. 837 9. 727 10. 107 10. 170
K2 10. 277 10. 320 10. 040 10. 023
K3 10. 207 10. 273 10. 173 10. 127
R 0. 440 0. 593 0. 133 0. 147
3. 4 抑菌效果的测定
由表 3 可知,薇甘菊叶的黄酮提取液对金黄色
葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺菌的抑菌圈平
均直径分别为 15. 0、11. 0、7. 5、8. 0 mm;阳性对照硫
酸链霉素组测得的直径分别为 17. 3、20. 8、13. 2、
18. 5 mm;阴性对照无菌蒸馏水组均无抑菌圈出现.
由此可知,薇甘菊叶的黄酮提取液对金黄色葡萄球
菌和大肠杆菌有明显抑菌效果,对沙门氏菌和志贺
菌有一定的抑菌效果,其中对金黄色葡萄球菌的抑
制作用最强.
表 3 总黄酮提取液的抑菌效果(24 h)
Tab. 3 Antibacterial activity of total falconoids extract (24 h)
供试菌种
抑菌圈直径 /mm
薇甘菊叶
黄酮提取液
无菌
蒸馏水
硫酸
链霉素
金黄色葡萄球菌 15. 0 6. 0 17. 3
大肠杆菌 11. 0 6. 0 20. 8
沙门氏菌 7. 5 6. 0 13. 2
志贺菌 8. 0 6. 0 18. 5
631 广 东 工 业 大 学 学 报 第 31 卷
3. 5 最低抑菌浓度(MIC)测定
由表 4 可知,薇甘菊叶黄酮提取液在一定浓度
下对4种菌均有一定抑制作用,而且随着黄酮质量
浓度的增加,抑菌作用增强呈正相关,具有广谱的抑
菌性.其中,对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作
用最强,其 MIC均为 1. 562 5 mg /mL,对沙门氏菌和
志贺菌的抑制作用稍弱,其 MIC 均为 3. 125 0
mg /mL(以黄酮质量浓度计).
表 4 总黄酮提取液的MIC1)
Tab. 4 The MIC of total falconoids extract
管号
稀释
倍数
金黄色
葡萄球菌
大肠
杆菌
沙门
氏菌
志贺菌
1 1∶ 2 - - - -
2 1∶ 4 - - - -
3 1∶ 8 - - ++ +
4 1∶ 16 + ++ ++ ++
5 1∶ 32 + ++ +++ ++
6 1∶ 64 ++ ++ +++ +++
7 1∶ 128 +++ +++ +++ +++
8 1∶ 256 +++ +++ +++ +++
9 - +++ +++ +++ +++
对照组 - - - - -
MIC /(mg·mL -1) 1. 562 5 1. 562 5 3. 125 0 3. 125 0
1)稍微浑浊有少数细菌生长,用“+”表示;比较浑浊有
较多细菌生长,用“ + +”;完全浑浊细菌生长良好,
用“+++”表示;透明清亮,无细菌生长,用“-”表示
4 结论
在单因素实验的基础上,通过四因素三水平的
正交试验,得到了超声辅助提取薇甘菊叶中总黄酮
的最优工艺.其中各因素对薇甘菊叶黄酮提取影响
的大小顺序为 B > A > D > C,即乙醇体积分数 >料
液比 >超声功率 >超声时间. 叶中总黄酮最佳提取
工艺条件组合为 B2A2D1C3,即:乙醇体积分数 50%、
料液比 1∶ 30、超声功率 50 W、超声时间 50 min,在此
条件下,叶中总黄酮含量可达 10. 62% .
抑菌试验结果表明,薇甘菊叶的黄酮提取液对
常见的致病菌具有较好的抗菌活性,而且随着提取
液中黄酮质量浓度的增加而增强. 薇甘菊叶的黄酮
提取液对不同的菌种抑制效果不同,其中对金黄色
葡萄球菌的抑制作用最强,对大肠杆菌的抑制作用
稍微次之,而对沙门氏菌和志贺菌的作用较弱,这可
能与提取液所含的黄酮种类、含量以及提取液中的
其他活性成分有关,原因还需要进一步深入研究.
薇甘菊叶的黄酮提取液良好的抑菌活性预示着
其在天然防腐剂开发利用方面的广阔前景. 由于薇
甘菊生长能力强,来源丰富,对有效成分开发,从而
实现更好利用将具有重大意义.
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831 广 东 工 业 大 学 学 报 第 31 卷