全 文 ：甘菊遗传转化再生体系的建立
刘占磊 1, 2 ,黄丛林 1 ,张秀海1 ,于 荣2 ,吴忠义 1 ＊　
(1.北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心 ,北京 100097;2.首都师范大学生命科学学院 ,北京 100048)
摘要　[目的 ] 建立高效稳定的甘菊再生体系 ,并确定卡那霉素和草丁膦的筛选压。 [方法 ] 以甘菊无菌苗叶片为外植体 ,通过添加不
同浓度的 NAA和 6-BA建立了甘菊遗传转化再生体系。 [结果] 在 5种芽诱导培养基中 , MS3(MS+NAA0.1mg/L+6-BA0.1mg/L)的
再生频率最高 ,可达 98%,其不定芽生根率可达 100%。培养 35d后 ,添加 5和 10mg/L卡那霉素的培养基上甘菊再生率为 11.3%和
1.0%,添加 15和 20mg/L卡那霉素的培养基上没有芽的分化;添加 0.5mg/L草丁膦的培养基上甘菊再生率为 8.7%,添加 1mg/L草丁
膦的培养基上没有芽的再生 ,添加 1.5和 2.0mg/L草丁膦的培养基上没有芽的分化。卡那霉素和草丁膦在甘菊遗传转化中的筛选浓
度分别为 8.0和 0.8mg/L。 [结论] 该研究为进行甘菊转基因试验打下了基础。
关键词　甘菊;叶盘;再生体系;筛选压
中图分类号　S682.11　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)14-06328-02
EstablishmentofRegenerationSystemfortheGeneticTransformationofDendranthemalavandulifolium
LIUZhan-leietal　(BeijingResearchCenterofAgriculturalBiotechnology, BeijingAcademyofAgriculturalandForestrySciences, Beijing
100097)
Abstract　[ Objective] ThepurposewastoestablishthehigheficientandsteadyregenerationsystemofDendranthemalavandulifoliumand
ascertiantheselectionpressuresofkanamycin(Km)andphosphinothricin(PPT).[ Method] WithleavesofasepticD.lavandulifoliumseed-
lingsasexplants, theregenerationsystemforitsgenetictransformationwasestablishedthroughaddingNAAand6-BAatdiferentconcn.[ Re-
sult] Amongthe5kindsofmediaforbudinduction, theregenerationfrequencyofMS3(MS+NAA0.1mg/L+6-BA0.1mg/L)washigh-
est, whichcouldbeupto98%andtherootingrateofitsadventitiousbudscouldbeupto100%.Afterculturingfor35 d, theregeneration
ratesofD.lavandulifoliumonthemediaaddedwithKmat5and10mg/Lwere11.3%and1.0%andtherewasnobuddiferentiationoc-
curredonthemediaaddedwithKmat15and20mg/L;theregenerationrateofD.lavandulifoliumonthemediaaddedwithPPTat0.5mg/L
was8.7%, therewasnobudregenerationoccuredonthemediaaddedwithPPTat1mg/Landtherewasnobuddifferentiationoccurredon
themediaaddedwithPPTat1.5and2.0mg/L.Theselectionconcn.ofKmandPPTforthegenetictransformationofD.lavandulifolium
were8.0and0.8mg/Lresp.[ Conclusion] TheresearchlayedafoundationforperformingthetransgenicexperimentonD.lavandulifolium.
Keywords　Dendranthemalavandulifolium;Leafdisc;Regenerationsystem;Selectionpressure
作者简介　刘占磊(1982-),男 ,河南商丘人 , 硕士研究生 ,研究方向:
菊花转基因。 ＊通讯作者,副研究员 , E-mail:zwu22@126.com。
收稿日期　 2008-12-29
　　菊花是世界上重要的观赏花卉和重要的切花 ,也是我国
有着悠久历史的传统名花 ,具有观赏 、食用 、药用等多种价
值 ,市场前景广阔。研究菊花的再生有重要的经济效益和社
会效益。菊花再生体系的建立已经有很多报道 。Hil用芽
尖为外植体建立了菊花的再生体系 [ 1] 。Roest等以叶片为外
植体建立了菊花的再生体系 [ 2] 。Yepes等以叶柄为外植体建
立了再生体系 [ 3] 。司怀君等以菊花的幼嫩花瓣为外植体 ,获
得了菊花的再生植株 [ 4] 。目前菊花的再生体系主要以 MS
培养基为基础 ,添加不同比例的生长调节物质(如 NAA、
IAA、6-BA、BA、KT等),从中筛选出最佳的生长调节物质比
例 ,从而建立再生体系。
随着现代基因工程的发展 ,可以通过转入新的基因定向
修饰某个目标性状并保留其他性状不变 ,打破种间杂交障
碍 ,克服远缘杂交不亲和性和不同染色体倍性差异的限制 ,
从而培育出新的菊花品种。目前转基因技术已经在改变花
色 [ 5-6] 、提高抗性 [ 3 , 7] 、改变株型 [ 8] 、调节花期 [ 9]等方面发挥
了重要作用。成功的遗传转化依赖于高效 、稳定的再生体系
的建立。由于菊花的再生受基因型的限制 ,使得菊花的再生
体系没有普遍性 ,因此建立一个高效稳定的再生体系是进一
步研究菊花转基因的关键 。笔者以甘菊的叶片为外植体 ,以
6-BA、NAA为生长调节物质进行离体培养研究 ,以期建立高
效稳定的再生体系 ,并且进一步确定了植物遗传转化过程中
常用的 2种选择标记卡那霉素(Km)和草丁膦(PPT)的筛选
压 ,为下一步进行甘菊的遗传转化打下基础。
1　材料与方法
1.1　材料　以甘菊无菌苗为试验材料(该试验所用甘菊由
北京农科院生物中心提供)。
1.2　方法
1.2.1　组织培养。以 25 ～30d苗龄的甘菊无菌苗的叶片为
试验材料 ,剪取无菌苗顶端 5片幼嫩的完全伸展开的叶片 ,
切成 5mm×5 mm大小的方形小块 ,再沿垂直于主叶脉的方
向划 3～ 5刀 ,以叶片背面接触于培养基的方式直接接种到 5
种诱导芽分化的培养基上(表 1),在 25 ℃、16 h/d的光照条
件下培养。 30 d时 ,统计分化出长度超过 0.5 cm的不定芽
的数量 ,计算再生率和繁殖系数。待苗长到 2 cm左右时将
其剪下接种到生根培养基 1/2 MS+NAA(0.1 mg/L)上 ,观
察不定芽的生根情况。
1.2.2　培养基配制及数据统计方法。以 MS培养基为基础
培养基 ,添加蔗糖 30 g/L、琼脂 6.0 g/L,设计多种不同比例
的 NAA和 6-BA,高压灭菌前调 pH值为 5.8 ～ 6.0, 117 ℃高
压灭菌 17 min,经过筛选以获得再生频率较高的培养基 ,确
定甘菊叶盘再生的最佳体系 。
在进行甘菊再生体系的建立和筛选压力确立的试验中 ,
每处理均选取 100个叶盘作为外植体 , 3次重复。甘菊再生
频率的统计是计算有不定芽分化的外植体数占所有接种外
植体总数的比例;繁殖系数的计算方法是外植体再生的不定
芽总数与有不定芽分化的外植体的比值 。
1.2.3　甘菊卡那霉素和草丁膦筛选压的确定。 ①卡那霉
素。以再生率最高的 MS2(MS+NAA0.1 mg/L+6-BA0.1
责任编辑　罗芸　责任校对　卢瑶安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2009, 37(14):6328-6329, 6334
mg/L)为基础培养基 ,设添加 5、10、15、20 mg/L4种不同浓
度的卡那霉素 。②草丁膦 。以 MS2为基础培养基 ,设添加草
丁膦 0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L4种不同浓度的草丁膦。把叶
片切成 5 mm×5mm大小的叶盘 ,以背接的方式分别接种到
上述培养基上 ,在 25 ℃, 16 h/d光照条件下培养 , 40 d时统
计出芽数 ,计算再生率。
2　结果与分析
2.1　再生体系的建立　叶盘接种到芽诱导培养基上 ,培养 5
d时可以看到叶片逐渐增厚 ,切口边缘开始膨大(图 1-a)。
培养 15 d时 ,陆续有不定芽的分化(图 1-b)。培养 30 d时
(图 1-c),分别统计 5种培养基中长度在 5 mm以上的不定芽
的数目 ,计算外植体的再生频率和增殖系数 。结果表明 , 5种
芽诱导培养基中 ,以 MS2(MS+NAA0.1 mg/L+6-BA0.1
mg/L)的再生频率最高 ,可以达到 98%,该体系可作为下一
步研究甘菊遗传转化试验的再生体系 。当不定芽长到 2 cm
左右时将其剪下接种到生根培养基 1/2 MS+NAA(0.1
mg/L)上 ,可观察到不定芽生根情况良好(图 1-d),生根率达
100%。
表 1　不定芽诱导培养基及甘菊的再生率和繁殖系数
Table1　Mediumforshootinductionandregenerationrateandpropa-
gationcoefficientofDendranthemalavandulifolium
培养基
Medium
NAA
mg/L
6-BA
mg/L
再生频率∥%
Regenerationrate
增殖系数
Propagationcoeficient
MS1 0.1 0.05 40 3.1
MS2 0.1 0.10 98 5.4
MS3 0.1 0.20 64 3.0
MS4 0.1 0.50 25 2.3
MS5 0.1 1.00 7 1.3
注:a.在 MS2培养基上培养 5d时的叶盘;b.培养 15d时的叶盘;c.培养 30d时诱导出的芽;d.再生苗的生根。
Note:a.Leafdiscscultivatingfor5days;b.Leafdiscscultivatingfor15days;c.Buddiferentiationcultivatingfor30days;d.Rootingofregeneratedseed-
lings.
图 1　叶盘的再生及不定芽的生根情况
Fig.1　Leafdiscregenerationandadventitiousbudsrootingsituation
2.2　甘菊卡那霉素筛选压的确定　叶盘接种到添加了不同
浓度的卡那霉素的 MS2培养基上 ,培养 5 d时 ,一部分叶片
逐渐开始增厚 ,切口边缘开始膨大;培养 20d时 ,少数的叶片
有芽点的出现 ,叶盘仍保持绿色 ,大部分叶片没有芽点且没
有明显的增厚现象;培养 35 d时 ,大部分叶盘已经干枯而死 。
其中卡那霉素 5 mg/L的培养基中有 11.3%的再生率 , 10
mg/L的培养基中有 1.0%的再生率 , 15和 20 mg/L培养基上
没有芽的分化 。所以该试验确定 8 mg/L的卡那霉素为遗传
转化时的筛选浓度 。与对照(没有添加卡那霉素的叶盘再
生)相比 ,可以看出卡那霉素对叶盘再生有很大的影响:叶盘
的再生受到抑制 ,大部分叶片没有明显的增厚现象 ,出芽的
时间比对照推迟 ,增殖系数大大降低 ,大多数叶盘在 35 d时
死亡等。
2.3　甘菊草丁膦筛选压的确定　叶盘接种到添加了不同浓
度的草丁膦的 MS2培养基上 ,培养 5 d时 ,一部分叶片逐渐
增厚 ,切口边缘开始膨大;培养 20 d时 ,少数叶片有芽点的出
现 ,大部分叶片没有芽点且没有明显的增厚现象;培养 35 d
时 ,大部分叶盘已干枯死亡。其中草丁膦 0.5 mg/L的培养
基中有 8.7%的再生率 , 1.0 mg/L的培养基中没有芽的再
生 , 1.5和 2.0mg/L的培养基上没有芽的分化。所以该试验
确定 0.8mg/L的草丁膦为遗传转化时的草丁膦筛选浓度 。
与对照相比 ,草丁膦对叶盘再生有很大的影响:叶盘的再生
受到抑制 ,大部分叶片没有明显的增厚现象 ,出芽时间比对
照推迟 ,增殖系数大大降低 ,大多数叶盘在 35 d时死亡等 。
3　讨论
研究了不同比例的 NAA和 6-BA对甘菊叶盘再生的影
响 ,当 NAA浓度固定在 0.1 mg/L时 ,再生率随着 6-BA浓度
的变化而变化 ,表明不同比例的 NAA和 6-BA对甘菊叶盘再
生的影响 ,该试验表明 ,当 NAA和 6-BA的比例为 1∶1时再生
效果最好。试验还表明 Km和 PPT对甘菊叶盘再生有强烈
的抑制作用 ,说明 Km和 PPT可以作为下一步甘菊转基因时
的选择标记。该研究为甘菊转基因试验的进行打下了基础。
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(下转第 6334页)
632937卷 14期　　　　　　　　　　　　　　　　刘占磊等　甘菊遗传转化再生体系的建立
表 1　烟草叶片愈伤组织诱导及诱导率情况统计
Table1　StatisticsforcalusinductionanditsrateofNicotianatabacom
编号
Number
接种数
Inoculationnumber
污染数
Polutionnumber
愈伤组织形成数∥块
Calusnumber
诱导率∥%
Inductionrate
愈伤组织生长状态
Growthstateofcalus
1 5 0 5 100 5块都比较大 ,且较均匀
2 5 0 4 80 有 2块较小
3 5 0 4 80 不均匀 , 2块中等, 2块很小
4 5 0 3 60 2块较小 , 1块上面有黑点
5 5 0 5 100 中等均匀
表 2　烟草叶片愈伤组织分化及分化率情况统计
Table2　StatisticsforcalusdifferentiationanditsrateofNicotianatabacom
编号
Number
接种数
Inoculation
number
分化数
Diferentiation
number
分化率∥%
Diferentiation
rate
分化数量
Diferentiation
amount
备注
Remark
1 5 5 100 +++ 2块较多 ,分化出的芽大于 20个
2 5 5 100 ++ 1块较少 ,大约有 6～ 10个;其他的分化培养物正常 ,且分化点均匀,但都较小
3 5 4 80 ++ 都较均匀
4 5 3 60 + 1块上面较多(>10个)
5 5 5 100 +++ 分化出了大量丛生芽 ,且均匀
　注:“ +”表示极度分布不均 ,多数在一个以下;“ ++”表示均匀分布 ,但都较小,多为分化点 ,且其数量在 10～ 20;“ +++”表示分布均匀 ,且都很
多,最少的愈伤组织上至少也有 20个丛生芽或者分化点。
　Note:+indicatesthedistributionisextremelyuneven, thenumberisunderone;++indicatesthedistributioniseven, butitislitle, mostofthemaredif-
ferentiationpoint, thenumberis10-20;+++indicatesthedistributionisevenandmuch, theleastcalusnumberis20multipleshootsordiferen-
tiationpointsatleast.
2.3　培养结果分析　烟草叶片愈伤组织诱导阶段中 ,每瓶
培养物的接种数均为 5片 5mm×5 mm的烟草叶片组织块 。
在诱导出的愈伤组织中 ,中等大小的偏多 ,大块的偏少 ,小块
的居中 ,原因有多种。 ①组织切块与培养基接触面积大小 。
组织切块与培养基的接触面积 ,尤其是切块边缘部分与培养
基的接触面积越大 ,越利于愈伤组织的形成 ,并且愈伤组织
块相对就越大 ,反之 ,就越小 。②消毒后的接种工具没有充
分冷却。没有消毒的接种工具易引起培养物的污染 ,消毒完
全的接种工具不易引起污染;但消毒完全的接种工具没有充
分冷却后就去切割材料 ,很容易导致组织材料被烫伤或者烧
死 ,增大了培养材料的死亡率 ,导致试验的失败。 ③组织切
块放置时间过长。组织切块放置时间过长 ,则很容易失去水
分而枯萎;同时也容易引起褐变 ,导致培养材料不能成活 。
该试验中 ,烟草叶片愈伤组织的诱导率比较高 ,可能与适当
的激素浓度 、适合的温度 、相对湿度 、培养基 pH值 、黑暗环境
等条件有关。
在愈伤组织的分化培养过程中 ,大部分愈伤组织都分化
形成了丛生芽或分化点。但是 ,仍有几块没有发生分化 ,原
因也有多种。 ①分化培养中愈伤组织自身因素的影响 。从
诱导环境改变到分化环境 ,愈伤组织需要一定时间的适应
期;同时 ,诱导的愈伤组织其内部还没有形成瘤状结构就被
转移到分化培养基上培养 ,这也会导致其不能继续生长 、分
化。②光照不足。分化培养中 ,愈伤组织的需光量和光强必
须要满足 ,若光量和光强不足 ,易导致分化的中断。③接种
工具冷却不充分 。与诱导培养中的接种工具冷却不充分相
同 ,会引起接种材料被烫伤或烧死现象发生 。从总体上来
看 ,分化率还是比较高 ,说明该次试验比较成功。
通过试验 ,烟草叶片愈伤组织的器官分化培养中 NAA
的量为 0.1mg/L, 6-BA的量为 2.0mg/L,可能更有利于丛生
芽或分化点的生成。
3　结语
在烟草叶片愈伤组织的诱导与分化培养中 ,由一小块烟
草叶片组织在培养基中便能分化出大量的丛生芽或分化点 ,
这为烟草优良品种的培育与快速繁殖提供了一个行之有效
的方法。同时 ,也为其他植株的繁育提供了良好的技术
支持。
参考文献
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6334 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年