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山东长岛南4岛狗尾草(Setaira viridis(L.)Beauv)种群遗传多样性的ISSR分析



全 文 :第36卷第1期
2013年3月      
辽宁师范大学学报(自然科学版)
Journal of Liaoning Normal University(Natural Science Edition)
     
Vol.36 No.1
Mar. 2013
  文章编号:1000-1735(2013)01-0098-04
  doi:10.11679/lsxblk2013010098
山东长岛南4岛狗尾草(Setaira viridis(L.)Beauv)
种群遗传多样性的ISSR分析
张恒庆1, 吴锦美1, 房孝迪1, 杜 洋1,
谭 坤1, 张晓明1, 范强军2, 祝恩伟2
(1.辽宁师范大学 生命科学学院,辽宁 大连 116081;
2.山东长岛国家级自然保护区 管理局,山东 长岛 265800)
摘 要:利用ISSR分子标记技术研究了山东省长岛县南部4岛90份狗尾草材料的遗传
多样性及遗传结构.13个ISSR引物共扩增出148个位点,多态性位点比率为70.30%,
Shannon信息指数在物种水平上为0.344 9.根据Gst值,遗传变异有16.53%发生在种
群间.遗传距离分析表明,NCS种群与DHS种群遗传一致度最高,遗传距离与地理距离
之间没有相关性.
关键词:狗尾草;ISSR;遗传多样性;遗传结构
中图分类号:Q145.1   文献标志码:A
  收稿日期:2012-06-08
作者简介:张恒庆(1964- ),男,辽宁大连人,辽宁师范大学教授,博士.
狗尾草(也叫青狗尾草)(Setaira viridis(L.)Beauv)为禾本科狗尾草属的一年生草本植物,生于
海拔4 000m以下的荒野、道旁,为旱地作物常见的一种杂草.原产欧亚大陆的温带和暖温带地区,现
广布于全世界的温带和亚热带地区.
狗尾草具有很强的抗逆性、繁殖力以及适应性,抗旱耐瘠薄能力尤其强.本研究以山东省长岛县南岛群
的大黑山岛、小黑山岛、南长山岛、北长山岛这4个天然种群为研究对象,采用ISSR遗传标记技术,对其进行
了遗传多样性的分析,目的是探讨种群遗传多样性水平及遗传分化与地理隔离、人类活动影响的关系.
1 材料与方法
1.1 材料
本研究实验材料采自山东长岛县南岛群的大黑山岛、小黑山岛、南长山岛、北长山岛4个天然种
群,分单株采集嫩叶,样品间距离大于50m,记录采样环境.样品于2011年7月采集,单株保存于实验
室-20℃冰柜中备用.各种群编号、具体采样位置及环境见表1.
1.2 方法
1.2.1 DNA模板制备 采用CTAB法[1]提取狗尾草的总DNA.粗提DNA样品用蛋白酶K纯化处
理后,经紫外分光光度计(DU-T型)和琼脂糖凝胶电泳-EB染色的荧光强度,双重测定DNA浓度,以
已知浓度的λDNA为对照,确定DNA的含量和分子量.用于PCR反应的模板用0.1×TE稀释备用.
1.2.2 狗尾草ISSR反应体系及PCR扩增  参考本实验室前ISSR实验工作,经各组成成分梯度实
第1期 张恒庆等: 山东长岛南4岛狗尾草(Setaira viridis(L.)Beauv)种群遗传多样性的ISSR分析 99 
表1 狗尾样品数量及采样地点概况
Table 1 Sample size of Setaira viridis(L.)Beauv and the overview of colection sites
种群名称 样品数 地理位置 环境条件
大黑山DHS  32 N37°58′03′′ E120°36′28′′ 面积7.47km2,位于庙岛列岛最西边
小黑山XHS  18 N37°58′36′′ E120°38′95′′ 面积1.29km2,属于未开发海岛
南长山NCS  21 N37°54′52′′ E120°44′84′′ 面积12.8km2,是山东省最大的岛屿
北长山BCS  19 N37°58′78′′ E120°42′15′′ 面积7.87km2
验,最终确定在TaKaRa公司提供的扩增系统25μL狗尾草的ISSR-PCR反应系统中适宜各组成成分
是:10×PCR缓冲液2.5μL,dNTPs 0.2mmol·L
-1,引物0.2mmol·L-1,Mg2+0.2mmol·L-1,模
板含量为10ng,Taq DNA聚合酶为1U.对 UBC set.9中的30个引物进行了筛选,确定了13个扩增
条带清晰、稳定性高的引物作为本研究的引物对所有个体进行扩增,扩增反应在英国TECHNE TC-
512型PCR循环仪上进行,狗尾草的ISSR-PCR反应程序为:94℃、5min使模板DNA充分变性,然后
进入下列温度循环:94℃变性45s,40.8~48.5℃退火40s(退火温度因引物不同),72℃延伸
1min 30s,共进行35个循环,最后1个循环在72℃保持7min使DNA片段得到完全延伸.扩增引物
序列及退火温度见表2.
表2 狗尾草ISSR扩增的引物及退火温度
Table 2 ISSR primersequences and annealing
temperatures of Setaira viridis(L.)Beauv
引物 序列 扩增位点数 退火温度/℃
UBC820 (GT)8C  10  48.2
UBC825 (AC)8T  19  48.2
UBC834 (AG)8YT  11  48.5
UBC836 (AG)8YA  9  48.2
UBC841 (GA)8YC  10  48.5
UBC843 (CT)8RA  8  48.5
UBC846 (CA)8RT  9  48.5
UBC851 (GT)8YG  13  48.5
UBC855 (AC)8Y  13  48.5
UBC857 (AC)8YG  12  48.2
UBC859 (TG)8RC  10  48.2
UBC868 (GAA)6 11  47.7
UBC876 (GATA)2(GACA)2 13  40.8
1.2.3 扩增产物的检测及数据统计分
析 采用水平板琼脂糖凝胶电泳技术检
测PCR扩增结果.在1×TBE电泳缓冲
液中,凝 胶 体 积 分 数 为1.2%,以
DL2000作为分子量标准,3h稳压电泳
(3V·cm -1),电泳结束后用美国冷泉
港P41G型凝胶成像系统照相,记录实
验结果.记录时只记录那些电泳条带清
晰,并能在重复实验中稳定出现的位点.
根据各条带的有无记录位点,有带的记
为“1”,无带的记为“0”,不确定的记为
“.”.数 据 经 POPGENE VERSION
1.31软件进行遗传多样性分析,各遗传
多样性指数计算公式参见Nei[2].
2 结果与分析
2.1 狗尾草各种群和物种水平上的遗传多样性
本实验对山东长岛南4岛的4个天然狗尾草种群90个个体的模板DNA进行ISSR-PCR扩增,筛
选出的13个引物共检测到148个位点,每个引物检测到的位点数在8~19个之间,扩增的DNA片段
长度介于150~2 330bp,平均每个引物检测到11.38个位点.在检测到的148个位点中多态位点为
107个,狗尾草种内多态位点比率为72.30%,4个种群内多态位点比率在46.62%~62.51%之间.多
态位点比率最高的是DHS(大黑山)种群,最低的是XHS(小黑山)种群.根据实验结果,用 Nei多样性
指数以及Shannon表型多样指数计算了狗尾草的遗传多样性水平,结果显示:Nei指数和Shannon指
数在人类活动频繁的大黑山(DHS)种群最高,而在人类活动较少的小黑山(XHS)种群最低,呈现出与
多态位点比率相一致的趋势(见表3).
2.2 狗尾草种群间遗传分化
根据148个位点计算的狗尾草种群间及物种水平上的多样性指标见表4.狗尾草种群间基因分化
100  辽宁师范大学学报(自然科学版) 第36卷
系数(Gst)为0.165 3,在4个狗尾草天然种群中,有16.53%的变异发生在种群间,而83.47%的变异
存在于种群内部.通过Nei指数计算,狗尾草种群间基因流为Nm =2.5255,表明这4个海岛上狗尾草
种群间有适度的基因交流.
表3 狗尾草各种群内遗传多样性水平
Table 3 Level of genetic diversity within population of Setaira viridis(L.)Beauv
种群名称 多态位点数 种群内多态位点比率/% Nei指数 Shannon指数
DHS  94  63.51  0.21(0.20) 0.32(0.28)
XHS  69  46.62  0.17(0.20) 0.25(0.29)
NCS  76  51.35  0.19(0.21) 0.28(0.30)
BCS  76  51.35  0.18(0.20) 0.27(0.29)
种内 107  72.30  0.23(0.18) 0.34(0.26)
注:括号内数字为标准差
2.3 狗尾草的种群间遗传距离和遗传相似性分析
遗传距离是分析种群间遗传相似性的重要指标,表5反映了4个狗尾草种群之间的遗传差异的水
平,南长山与大黑山种群遗传距离最小0.044 5,南长山与小黑山种群遗传一致度最低0.922 0.
表4 狗尾草种群间遗传分化
Table 4 Genetic differentiation of Setaira viridis(L.)Beauv
指标 参数
种群内基因多样性Hs
(Gene diversity within population)
0.1872
种群总的基因多样性Ht
(Total gene diversity)
0.2243
种群内基因多样性比率 Hs/Ht
(Ratio of gene diversity within population)
0.8346
遗传分化系数Gst
(Gene differentiation among population)
0.1653
基因流 Nm
(Gene flow)
2.5255
表5 狗尾草的遗传距离和遗传一致度
Table 5 Genetic distance and genetic
identity of Setaira viridis(L.)Beauv
大黑山
DHS
小黑山
XHS
南长山
NCS
北长山
BCS
大黑山 DHS **** 0.9421  0.9564  0.9486
小黑山 XHS 0.0596 **** 0.9220  0.9373
南长山 NCS 0.0445  0.0812 **** 0.9486
北长山BCS  0.0528  0.0647  0.0528 ****
  注:上三角为遗传一致度;下三角为遗传距离
3 讨论
3.1 山东省长岛县南部4岛狗尾草种群具有较高的遗传多样性
阎洪波等[3]用等位酶分析青狗尾草(Setaira viridis(L.)Beauv)、谷莠子(Setaira viridis race ma-
jor)、谷子(Setaira italica (L.)Beauv)、金狗尾草(Setaira glauca)的平均多态位点百分率分别为
38.9%、26.2%、33.5%、36.6%;李海权等[4]用SRAP标记技术对谷子及其近缘野生种青狗尾草(Se-
taira viridis(L.)Beauv)进行了遗传变异的检测,其多态位点百分率均值为28.30%;钱韦等[5]用
RAPD和ISSR标记对分别来自中国海南同为禾本科物种疣粒野生稻(Oryza granulata)的20个种群
混合样品及海南和云南2个种群各20个植株的遗传多样性进行了检测,20个RAPD引物和12个IS-
SR引物分别扩增出209和122条带,多态条带比率分别为64.11%和72.95%.虽然采样的分子标记
有所差异,但本研究所得到狗尾草物种水平上的多态位点百分率为72.30%,说明这4岛的狗尾草种
群有较高的遗传多样性.其可能原因是ISSR分子标记法能检测出更多的多态条带.Gilbert等[6]、
Yang等[7]和Jonsson等[8]的研究也都证明,与RAPD相比,ISSR检测遗传多态性的能力更高.
3.2 山东省长岛县南部4岛狗尾草种群遗传结构、基因流的分析
由于海洋的包围所形成的天然隔离,岛屿上植物种群遗传变异证据是研究遗传结构和基因流分析
的理想模型.本研究4个岛屿上狗尾草的Nei基因多样性指数显示大黑山种群最高(0.210 8),小黑山
种群最低(0.167 4),与岛屿目前开发程度有关.大黑山岛正处在开发期,人类活动导致的环境变化程
第1期 张恒庆等: 山东长岛南4岛狗尾草(Setaira viridis(L.)Beauv)种群遗传多样性的ISSR分析 101 
度远远高于尚未开发的小黑山岛,而狗尾草正是在开发过程中形成的裸地上的先锋植物,人类活动会
增加其生存空间和种子的传播.
由基因分化系数Gst可知,4岛上狗尾草遗传多样性主要存在于种群内部,所占比率为83.47%,而种
群间遗传多样性仅为16.53%.狗尾草的种群间的基因流(Nm)为2.525 5.Hamrick等[9]认为Nm大于1
就足以抵制遗传漂变的作用,也同时防止了群体分化的发生.本实验结果显示种群间Nm为2.5255大于
1,表明虽然不同岛屿之间有海洋的隔离作用,但隔离作用对狗尾草的基因流的阻碍作用并不明显.王天
宇等[10]的研究结果也显示了谷子可以在一定的距离范围内向青狗尾草发生基因转移.产生这种结果可能
是由于狗尾草的风媒传粉生物学特征以及其种群的建立与人类活动关系密切的原因.
遗传距离是分析种群间遗传相似性的重要指标,本研究结果表明南长山与大黑山种群遗传距离最
小0.044 5,一致度最大0.956 4;南长山与小黑山种群遗传距离最大0.081 2,一致度最小0.922 0.这结
果与岛屿间地理距离不成正相关关系,其原因还有待于更进一步的叶绿体DNA序列分析数据证实.
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Analysis of genetic diversity of natural populations in the four islands
south of Changdao,Shandong Province,Setaira viridis(L.)Beauv by ISSR
ZHANG Hengqing1, WU Jinmei 1, FANG Xiaodi 1, DU Yang1,
TAN Kun1, ZHANG Xiaoming1, FAN Qiangjun2, ZHU Enwei 2
(1.Colege of Life Science,Liaoning Normal University,Dalian 116081,China;
2.Shandong Changdao National Nature Reserve,Changdao 265800,China)
Abstract:Using ISSR method,the genetic diversity and genetic structure of 90individuals Setaira
viridis(L.)Beauv in the four islands south of Changdao,Shandong Province were studied in this pa-
per.Through the amplification of ISSR with 13primers,148loci were detected and the percentage of
polymorphic loci was 70.30%.Shannon’s information index was 0.344 9at the species level,genetic
variance was 16.53% among populations according to Gst value.The genetic distances analysis
showed that NCS population and DHS population have the highest population genetic identity,genetic
distances and geographic distances have no correlation.
Key words:Setaira viridis(L.)Beauv;ISSR;genetic diversity;genetic structure