全 文 ：利用种子蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定
向日葵种子纯度的研究
段维　谢宗铭　 陈福隆　 陈寅初　 李万云
(新疆农垦科学院作物所　石河子　 832000)
摘要: 采用种子贮存蛋白 SDS-PAGE技术 ,对 13份向日葵杂交种和自交系进行了鉴别 ,结果表明 ,它们的种子蛋白电泳图
谱差异明显 ,特征谱带稳定。种子蛋白电泳鉴定与田间小区种植鉴定种子纯度结果之间存在极显著的线性正相关性。该技
术可作为向日葵杂交种和自交系种子纯度鉴定的一种新手段。
关键词　向日葵　种子贮存蛋白　聚丙烯酰胺凝胶电泳　田间种植鉴定　品种纯度
品种纯度是农作物种子质量评定和分级的重要指标。高质量的种子是优良品种实现稳产、增产的重要保证。[1 ]目前 ,我国向日葵
杂交种和自交系的种子纯度鉴定工作 ,主要是当年冬季在海南进行田间小区种植来完成的。田间小区种植鉴定是鉴定品种真实性和
检测品种纯度的经典、通用的方法 ,但周期较长 ,费用高 ,品种生物学特征性状易受栽培措施及环境因子的影响 ,加之检测人员的经
验不同 ,往往导致鉴定准确度不高。
电泳技术已广泛应用于种子纯度鉴定。 种子蛋白十二烷基硫酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SDS-PAGE)技术 [2] ,已成功的应用于
小麦、大麦、水稻、棉花等作物的品种鉴定 [3～ 6]。 对于在向日葵品种鉴定上的应用 ,国外虽有少量报道 [7～ 8] ,但国内尚未见正式报道。
因此 ,我们开展了向日葵种子蛋白 SDS-PAGE技术在品种真实性及种子纯度鉴定上应用的可行性研究。
1　材料与方法
1. 1　供试材料
供试材料共 13份。不育系: 109A、 87430-312A、欧洲油葵母本 ;保持系: 109B、 87430-312B;恢复系: 7961-2411、欧洲油葵父本 ;杂
交种: 新葵杂四号、新葵六号、欧洲油葵、新葵杂五号、新葵七号、 G101。
欧洲油葵及其父、母本由新疆昌吉州华西种业有限公司提供 ;新葵杂五号、新葵七号由新疆农业科学院经作所提供 ; G101由新
疆生产建设兵团种子公司提供 ;其余材料均由新疆农垦科学院作物所提供。
1. 2　仪器与试剂
主要仪器为 DYY-Ⅲ 6B型稳压稳流电泳仪、 DYY-Ⅲ 24B型加宽双垂直板电泳糟 (胶板面积 130mm× 225mm ,厚 1mm,北京六
一仪器厂 ) ,高速冷冻离心机 (最大转速 16 000rmp,上海安亭科学仪器厂 ) ,酸度计 PHSJ-4A (上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器
厂 ) ,冰箱等。
主要试剂有丙烯酰胺 (北京化学试剂公司 ) ,甲叉双丙烯酰胺 ( Fluka公司 ) ,十二烷基硫酸钠 ( Sigma公司 ) ,考马斯亮蓝 R-250
( Sigma公司 ) ,均为分析纯。
1. 3　种子脱脂与蛋白质提取
每份试样取单粒种子脱壳 ,置于无菌的双层滤纸之间 ,用小铁锤碾碎成粉末 ,将粉碎样品置于 1. 5ml塑料离心管中 ,用三氯甲烷
∶甲醇∶丙酮混合液 ( 2∶ 1∶ 1)进行脱脂。每小管每次加脱脂液 1ml,在 4℃条件下脱脂 2次 ,每次间隔 2h,脱脂结束后 ,小心倾去脱
脂液 ,用滤纸条吸干残留液或室温风干 ,沉淀物备用。
每小管脱脂样中 ,加入 0. 2ml、 0. 05mol /L T ris-Hcl缓冲液 ,含 1mol /L Nacl, PH8. 0,充分混匀 ,置于 4℃冰箱过夜提取。然后以 8
000r /min离心 8min,取上清液 ,加入等体积的 0. 0625mo l / LTris-Hcl缓冲液 ,含 2% SDS、 5% β -巯基乙醇、 6mo l / L尿素、 0. 02%溴酚
蓝 , PH6. 8。 在沸水浴中加热 5min,冷却至室温后待用。
1. 4　电泳
采用垂直板 SDS-聚丙烯酰胺凝胶不连续系统。分离胶的凝胶浓度 T= 12. 5% ,交联度 C= 2. 6% ;浓缩胶的凝胶浓度 T= 5% ,交
联度= 4. 8%。 电极缓冲液为 0. 025mo l /L T ris-0. 192mo l / L甘氨酸缓冲液 ,含 0. 1% SDS, PH8. 3。
每个点样槽 ( 52齿 )加 7μl蛋白质样品。电泳槽放置于 4℃冰箱中 ,先在 120V恒压下电泳 ,待样品进入分离胶后 ,电压升为 200V
恒压 ,当指示剂溴酚蓝前沿到达距胶板底部约 1～ 2cm时 ,终止电泳 ,全过程约需 3h。
1. 5　染色、观察并记录
电泳结束后 ,卸下凝胶模具 ,用不锈钢片小心将玻璃板与凝胶分开。 将凝胶板先置于蒸馏水中 ,浸泡 10min,然后置于含 12. 5%
三氯乙酸、 0. 2%考马斯亮蓝 R-250的溶液中固定染色 3～ 4h。染色完毕 ,凝胶板用自来水漂洗数次 ,直至蛋白质谱带清晰为止。然后
拍照或制成干胶片长期保存。
1. 6　田间小区种植鉴定和种子蛋白 SDS-PAGE鉴定的比较研究
将待检样品分成两份 ,其中一份在海南进行田间小区种植鉴定 ,另一份用于种子蛋白 SDS-PAGE室内鉴定。将两种鉴定方法的
结果进行了相关性分析。
·24·
种子　 Seed　 2001年　第 1期　 (总第 113期 )
DOI : 10. 16590 /j . cnki . 1001 -4705. 2001. 01. 048
2　结果与分析
2. 1　种子脱脂质量对电泳的影响
向日葵种子富含脂类物质 ,在进行种子蛋白凝胶电泳时 ,需进行有效的脱脂处理 ,才能获得较好的电泳结果。 脱脂越彻底 ,电泳
图谱也越清晰、稳定。传统的种子脱脂方法 ,大多直接采用石油醚、正乙烷等有机溶剂 ,在室温下连续搅拌或振荡抽提 ,每完成一粒种
子脱脂需 10～ 12h以上 ,而采用双层滤纸来粉碎样品 ,避免了种子蛋白样品相互污染 ,滤纸又能吸除一部分油脂 ,缩短了脱脂时间。
2. 2 SDS-PAGE图谱分析
不同向日葵杂交种和自交系种子蛋白 SDS-PAGE图谱存在明显差异。它们都有各自的特征谱带 ,根据谱带的多少 ,谱带的迁移
率 ,谱带的宽窄、染色深浅等可以区别不同的杂交种和自交系 (图 1)。
表 1　田间小区种植鉴定与
SDS-PAGE鉴定的品种纯度结果
品种和自交系 田间小区种植鉴定纯度 (% )
SDS-PAGE
鉴定纯度 (% )
新葵杂四号 87. 1 84. 7
新葵杂四号 95. 2 93. 3
新葵杂四号 91. 2 90. 4
新葵六号 94. 6 92. 8
新葵六号 91. 2 90. 9
新葵六号 96. 4 94. 1
欧洲油葵 100 96. 0
欧洲油葵 99. 1 94. 0
欧洲油葵 98. 9 94. 0
欧洲油葵 97. 5 97. 0
欧洲油葵 100 98. 0
109A 95. 9 94. 6
7961-2411 99. 6 97. 0
7961-2411 100 98. 1
87430-312A 93. 2 89. 4
2. 3　田间小区种植鉴定与 SDS-PAGE鉴定的品种纯度结果的比较
表 1所示为田间小区种植鉴定与 SDS-PAGE鉴定的品种纯度结果。相关性分析表
明 ,二者之间存在着极显著的线性正相关关系。 回归方程为 Y= 2. 1064+ 1. 0029X,相
关系数 r= 0. 9261,式中 Y为田间小区种植纯度 , X为种子蛋白 SDS-PAGE图谱纯度。
说明利用种子蛋白 SDS-PAGE技术鉴定向日葵品种纯度是可靠的 ,准确的。
3　讨论
植物的许多形态学性状受数量基因控制 ,栽培措施及环境因子对其表现型的影响
较大 , 加之不同检验人员经验上的差异导致田间小区种植鉴定的准确度往往不高。 异
地种植鉴定 ,一般需 90～ 100d左右 ,周期较长 ,鉴定结果滞后于种子调运 ,不能有效地
达到种子质量监控的目的 ;另外需要额外的土地、人力 ,费用较高。 采用 SDS-PAGE技
术鉴定品种纯度需用时间少 ,从脱脂制样到出具鉴定报告只需 2d,不受环境条件的影
响 ,随时可进行品种纯度鉴定。
向日葵种子蛋白 SDS-PAGE技术 ,可作为品种纯度检测的一种新手段。 谱带的使
用及与计算机图像识别技术的联接 ,尚需进一步研究。
图 1　油葵自交系、品种种子蛋白 SDS-PAGE电泳图谱
　 1.欧葵母本 ; 2.欧葵 ; 3.欧葵父本 ; 4. 109B; 5. 109A;
6.新葵杂四号 ; 7. 7961- 2411; 8.新葵六号 ; 9. 87430- 312A;
10. 87430- 312B; 11.新葵杂五号 ; 12.新葵七号 ; 13. G101
参考文献
1　毕辛华 ,戴心维主编 .种子学 .北京: 农业出版社 , 1993: 227～ 243
2　何忠效 ,张树政主编 .电泳 .北京: 科学出版社 , 1990: 143～ 155
3　谢宗铭 ,陈福隆 ,孙宝启 .向日葵品种纯度检验的方法和技术 .种子 ,
1999, ( 2): 38～ 41
4　张延滨 ,祁适雨 ,肖志敏等。黑龙江省小麦品种的 HM N麦谷蛋白亚基
组成和血缘关系的研究 .东北农业大学学报 , 1998, 29( 2): 111～ 116
5　湛小燕 ,林榕辉 .部分栽培稻和野生稻种子谷蛋白的电泳分析 .中国水
稻科学 , 1991, 5( 3): 109～ 113
6　曾慕衡 ,杜庭碧 ,马守才 .棉花种子蛋白凝胶电泳方法及其在品种鉴定
中的应用 .陕西农业科学 , 1996, ( 2): 14～ 16
7　 Anisimova I. N . , Gav riljuck , I. P. . Heter og enity and Polymo rphyism
of the lls g lobulin of sunflow er seed . Genetics( Russian) , 1989 , 25
: 1248- 1255
8　Vair , A . , M. Dadlani , R . J . Cooke , Identification of sunflower
hybrids and inbr eds by SDS-PAGE o f seed pro teins . Seed Research , 1992 , 20( 2) 138- 141
Identification of seed puri ty for sunflow er hybrids and inbreds
by ployacrylamide gel elect ropho resis of seed s to rage pro teins
Duan Wei　　Xie Zongming　　 Chen Fulong　　 Chen Yincchu　　 Li Wanyun
( Cr op Institute , X injiang Academ y of Ag ricultura l Reclamation , Shehezi , 832000)
Abstract: Thirteen sunflow er hybrids and inbr eds w ere identified successfully by using seed sto rag e pro teins of SDS-po ly acry lamide
gel electropho r esis . The results show ed that the electropho resic pro files of these ma terials tested existed significant difference, and
the specific bands w ere stable . There w ere a po sitiv e linear relation be tween results of field plo t planting testing and that o f seed
sto rag e pro teins o f SDS-PAGE . Seed sto rag e pro teins of SDS-PAGE technique could be used a s a new way fo r testing of sunflow er
va rie ties seed purity .
Key words　 Sunflow er( Helianthus . annuus L . )　 Seed sto rag e pro teins　 Po ly acylamide gel elec tropho resis
　　　　　 Field plo t planting testing　 Varietal purity
·25·
种子　 Seed　 2001年　第 1期　 (总第 113期 )